空間立構(gòu)pH敏感喜樹堿新型納米膠束藥動學研究

徐文霞，趙 科，劉 源，孫文霞，任 靜

(四川省藥物制劑及裝備工程技術(shù)研究中心，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學，成都 610052)

喜樹堿(camptothecin，CPT)是S-期型抗癌藥物，臨床具有顯著的抗癌活性[1,2]。但天然喜樹堿內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定，具有例如血尿、尿頻、腹瀉等嚴重的不良反應(yīng)[3,4]，限制了其臨床使用。聚乳酸作為一種天然高分子材料，具有良好的生物降解性能和優(yōu)良的生物相容性；而空間立構(gòu)復合物是一種由兩個互補的有規(guī)立構(gòu)聚合物之間的立體選擇性相互作用而形成的復合物，它與其母體對映物相比有著穩(wěn)定性更好的顯著優(yōu)點。聚合物膠束具有特殊的核-殼結(jié)構(gòu)(疏水嵌段為內(nèi)核，親水嵌段為外殼)，其內(nèi)核載藥，增溶難溶性藥物；而外殼可避免膠束被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)( reticulo-endothelial system，RES) 識別和攝取，延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，并保持其穩(wěn)定[5]。因此，聚乳酸空間立構(gòu)復合物作為藥物載體具有獨特的物理化學穩(wěn)定性，在藥物傳輸領(lǐng)域有著極大的應(yīng)用潛力[6-8]。本實驗室前期已制備得到聚乳酸空間立構(gòu)復合物為載體的喜樹堿新型納米膠束(camptothecin nanomicelles， CPT-NC)，體外質(zhì)量評價良好，現(xiàn)分別采用大鼠及小鼠對其體內(nèi)過程進行進一步的研究和評價，以為制劑產(chǎn)品開發(fā)奠定生物藥劑學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠20只(雌雄各半，SPF級，200～250 g)，昆明種小鼠24只(雌雄各半，SPF級，25～30 g)，均由成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供，合格證號：SYXK(川) 2015-030。

1.2 藥品與試劑CPT對照品，含量>98%，批號：drk-0333-920417，購自成都德銳可生物科技有限公司；CPT原料藥，含量98%，批號：C-12246，購自天津希恩思生化科技有限公司；鹽酸伊立替康(內(nèi)標)對照品，含量 98%，批號：C023D130909，購自四川協(xié)力制藥有限公司；CPT-NC，自制。生理鹽水，含量0.9%，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器LC-10A高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；BSA224S萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；BP-211D電子分析天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；Allrgra X-30系列離心機，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國有限公司)產(chǎn)品；XW-80A旋渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.4 溶液配制

1.4.1對照品溶液 稱取CPT對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲波振蕩20 min，至樣品完全溶解，甲醇定容得200 mg·L-1CPT儲備液；取儲備液適量用甲醇稀釋得到濃度為50、25、5、2.5、0.5、0.25、0.05 mg·L-1的內(nèi)酯型CPT對照品系列工作溶液。

1.4.2內(nèi)標溶液 稱取鹽酸伊立替康對照品適量，用甲醇配制成濃度為20 mg·L-1的溶液作為內(nèi)標溶液。

1.4.3CPT混懸型注射液(CPT-Free) 取CPT適量，用少量聚氧乙烯蓖麻油和乙醇(體積比為1 ∶ 1)溶解，然后保存在-20 ℃的冰箱中備用，注射前直接用生理鹽水稀釋即可。

1.5 藥動學給藥方案及血樣本采集20只SD大鼠，雌雄各半，隨機分成4組(編號A，B，C，D)，每組5只。A、B、C組給予CPT-NC，給藥劑量分別為0.25、0.5、1mg·kg-1；D組給予CPT-Free，給藥劑量為0.5 mg·kg-1。CPT-NC與CPT-Free使用前均用生理鹽水稀釋至使用濃度，尾靜脈注射給藥。給藥前禁食12 h，給藥后繼續(xù)禁食24 h，全程不禁水，分別于給藥前以及給藥后5、15、30 min，以及1、2、4、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置肝素化離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，分離血漿置-20 ℃冰箱中保存待測。

1.6 組織分布給藥方案及樣本采集選取雌雄各半共24只小鼠，并隨機分成2組，尾靜脈注射CPT-NC或 CPT-Free，給藥劑量0.8 mg·kg-1，給藥后分別于0.5、1、4、12 h(每組每個點3只)進行眼眶取血，小鼠處死后取出心、肝、脾、肺和腎，并用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱重，以3倍量的生理鹽水混合勻漿。血漿樣品與組織勻漿液置-20 ℃冰箱中保存待測。

1.7 測定條件與樣本處理

1.7.1色譜條件 色譜柱：HypersiL BDS-C18 (5 μm，200 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈 ∶ 磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)= 29 ∶ 71；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

1.7.2血漿樣品處理 取血漿樣品100 μL，同時加入內(nèi)標溶液20 μL、甲醇20 μL、乙酸乙酯300 μL，渦旋混合1 min；然后12 000 r·min-1離心5 min，取上清液空氣流揮干后加入100 μL甲醇復溶，渦旋混合1 min后再12 000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL注入色譜儀，記錄色譜峰，以內(nèi)標法按隨行標準曲線測定血漿樣品的濃度。

1.7.3組織樣品處理 組織樣品處理方式同“1.7.2”項。

1.8 方法學考察

1.8.1專屬性 在“2.4”色譜條件下，分別將空白血漿(空白組織)、加入對照品溶液和內(nèi)標物的模擬血漿樣品(組織樣品)和血漿樣品(組織樣品)處理后進樣檢測，記錄色譜圖觀察內(nèi)源性雜質(zhì)的色譜峰對內(nèi)標物和內(nèi)酯型CPT的色譜峰測定是否有干擾，驗證其專屬性。

1.8.2標準曲線與定量限 取大鼠空白血漿100 μL，加入不同質(zhì)量濃度的內(nèi)酯型CPT對照品工作溶液20 μL，配制成含CPT 0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg·L-1的模擬血漿樣品；同法取小鼠空白生物樣品配制成含CPT 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg·L-1的模擬血漿樣品。按照“2.4”項下方法處理，以CPT與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)，CPT濃度為橫坐標(X)，采用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算。定量限確定采用信噪比法，制備系列濃度的生物樣品，HPLC進樣測定峰面積，計算樣品信號強度(S)與基線噪音強度(N)的比例，以S/N=10時的最低樣品濃度作為定量限。

1.8.3精密度與方法回收率 取大鼠空白血漿，制成含CPT 0.05、0.1、1、5 mg·L-1的質(zhì)控樣品(QC樣品)各5份；取小鼠空白血漿，制成含CPT 0.01、0.1、1、5 mg·L-1的QC樣品各5份。HPLC進樣分析，每一濃度平行5樣本分析，連續(xù)測定3天，根據(jù)每批隨行標準曲線，計算QC樣品中CPT的濃度，以測得值與加入值之比計算方法回收率，并計算日內(nèi)和日間精密度。

1.8.4萃取回收率 取空白血漿(空白組織)，制成含CPT 1 mg·L-1(0.1 mg·L-1)的QC樣品5份；不加空白血漿(空白組織)，同法制備制成含CPT 1 mg·L-1(0.1 mg·L-1)的甲醇溶液5份，分別取20 μL注入色譜儀，記錄色譜峰，得到萃取的CPT與內(nèi)標峰面積和未經(jīng)萃取的CPT與內(nèi)標峰面積；以峰面積比值計算CPT與內(nèi)標的萃取回收率。

1.8.5穩(wěn)定性 取適量大鼠空白血漿樣品，配制成含CPT 0.1、1、5 mg·L-1的血漿樣品；取適量小鼠勻漿組織或血漿樣品，配制成含CPT 0.01、0.1、1 mg·L-1的勻漿組織或血漿樣品。將樣品放置冰箱中，經(jīng)3次冷凍-融化循環(huán)、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經(jīng)室溫放置8 h后，HPLC進樣分析，考察樣品的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 方法學評價

2.1.1大鼠體內(nèi)分析方法學評價 專屬性 如Fig 1所示，大鼠血漿中內(nèi)酯型CPT及其內(nèi)標鹽酸伊立替康的出峰時間為8 min和5 min左右；內(nèi)源性物質(zhì)不干擾內(nèi)酯型CPT及其內(nèi)標的測定，方法專屬性良好。

Fig 1 HPLC chromatogram of rat plasma sample

A: Blank plasma; B: Blank plasma+CPT+internal standard; C: Plasma samples after administration; 1: Lactone CPT;2: Internal standard

標準曲線與定量下限 內(nèi)酯型CPT線性回歸方程為：Y=0.39X+1.8×10-3，R2=0.9997；在(0.05～10)mg·L-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，定量下限為0.05 mg·L-1。

精密度與方法回收率 如Tab 1所示，定量下限、低、中、高4個濃度QC樣品的日內(nèi)和日間精密度(RSD%)均小于15%，方法回收率大于98%。

萃取回收率 CPT與內(nèi)標的萃取回收率分別為(57.08±1.96)%和(62.89±2.93)%，RSD小于5%，說明該提取方法穩(wěn)定可靠。

穩(wěn)定性 0.1、1、5 mg·L-1的大鼠血漿樣品經(jīng)3次冷凍-融化循環(huán)、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經(jīng)室溫放置8 h后，穩(wěn)定性結(jié)果RSD均小于8.04%，表明在上述條件下CPT穩(wěn)定性良好。

2.1.2小鼠生物樣品測定方法學評價 專屬性 結(jié)果顯示，各生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾CPT及內(nèi)標的測定。小鼠血漿與各組織色譜圖如Fig 2所示，內(nèi)酯型CPT及其內(nèi)標鹽酸伊立替康的出峰時間為8 min和5 min左右，以肝組織色譜圖為代表，其他組織與之類似。

標準曲線與定量下限 CPT在血漿與各組織的標準曲線見Tab 2。在線性范圍(0.01～5)mg·L-1內(nèi)，線性關(guān)系良好，經(jīng)實驗測得CPT的定量限為10 μg·L-1。

精密度與方法回收率 測得CPT在小鼠血漿和各組織中定量下限、低、中、高4個濃度QC樣品的日內(nèi)精密度為3.54%～9.04%，日間精密度為 2.67%～8.56%，方法回收率在98.4%～104.0%內(nèi)波動。

萃取回收率 各生物樣品中CPT和內(nèi)標的萃取回收率穩(wěn)定，RSD均小于10%，說明該提取方法穩(wěn)定可靠。

穩(wěn)定性 0.01、0.1、1mg·L-1的小鼠生物樣品經(jīng)3次冷凍-融化循環(huán)、室溫下放置4 h以及樣品處理后上清液經(jīng)室溫放置8 h后，穩(wěn)定性結(jié)果RSD均小于9.18%，表明在上述條件下CPT穩(wěn)定性良好。

2.2 血藥濃度——時間曲線大鼠尾靜脈注射CPT-Free和CPT-NC的平均血藥濃度—時間曲線見Fig 3。由Fig 3可見，高、中、低3個劑量下，CPT-NC組隨著給藥劑量的增大，各時間點血藥濃度變化趨勢一致，AUC(0-t)相應(yīng)增大。而在相同給藥劑量下，CPT-NC組的AUC(0-t)明顯大于CPT-Free組，且CPT-Free組的血藥濃度下降較CPT-NC組快。

2.3 藥動學參數(shù)大鼠體內(nèi)藥代動力學參數(shù)結(jié)果見Tab 3。如Tab 3所示，低、中、高劑量下，載CPT納米膠束的Cmax分別為(3.07±0.89、4.04±0.50和6.30±0.53)mg·L-1，AUC(0-t)分別為(30.13±3.18、43.49±4.56和56.58±6.18)mg·L-1·h，兩者隨著給藥劑量的增加而增加，在(0.25～1) mg·kg-1給藥劑量下呈線性關(guān)系。在相同給藥劑量下，結(jié)果載藥膠束的AUC(0-t)為(43.49±4.56)mg·L-1·h，CPT的AUC(0-t)為(33.01±2.95)mg·L-1·h，載藥膠束AUC為CPT的1.32倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。載藥膠束的t1/2為(9.73±0.19)h，CPT的t1/2為(8.31±1.93)h，前者是后者的1.17倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 2 HPLC chromatogram of biological samples (A1. Blank plasma; A2. Blank plasma + CPT + internal standard; A3. Plasma samples after administration; B1. Blank liver; B2. Blank liver+ CPT + internal standard;B3. Liver samples after administration;1. Lactone CPT;2. Internal standard)

Fig 3 Average plasma concentration-time curve of CPT-free and CPT-NC after intravenous administration (n=5)

C/mg·L-1Intra-day x±s (mg·L-1)RSD/%Inter-dayx±s (mg·L-1)RSD/%Methodrecovery/%0.050.05±0.008.740.05±0.007.0899.30±7.790.10.10±0.015.530.11±0.018.17101.04±4.0911.01±0.065.921.04±0.054.61100.33±2.7055.25±0.346.135.14±0.386.93100.31±3.04

Tab 2 Standard curves of CPT in plasma and tissues(n=6)

2.4 組織分布結(jié)果小鼠尾靜脈注射CPT-Free和CPT-NC后不同時間內(nèi)酯型CPT含量變化見Tab 4。

從表中可見，給藥0.5 h后，CPT-NC組在血漿中的濃度最大，CPT-Free組在肝組織的濃度最大，兩給藥組在心、肝、脾、肺、腎等多組織中均能檢測到一定濃度的內(nèi)酯型CPT，表明注射給藥后內(nèi)酯型CPT能較快分布到多種組織器官中。給藥1 h后，兩給藥組的脾、肺和腎中內(nèi)酯型CPT濃度均有提升，特別是載藥膠束組在肺組織中達到峰值。給藥4 h后，各組織中CPT濃度均有一定程度的降低，至12 h各組織中仍能檢測到內(nèi)酯型CPT。CPT-Free組的內(nèi)酯型CPT在組織中暴露量的大小順序為肝>肺>心>脾>腎；CPT-NC組的內(nèi)酯型CPT在組織中暴露量的大小順序為肺>心>肝>脾>腎。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of CPT-free and CPT-NC in

*P<0.05,**P<0.01vsCPT-free

Tab 4 CPT concentration at different time points in plasma and tissue of mice after CPT-free and CPT-CN injection(n=3,

*P<0.05,**P<0.01vsCPT-free

3 討論

CPT自然狀態(tài)下存在兩種形式：閉合內(nèi)酯型和開環(huán)羧酸鹽型。在緩沖體系中，內(nèi)酯型與羧酸鹽型的CPT之間存在著動態(tài)平衡[9]，但只有閉合內(nèi)酯型的CPT能夠抑制Topo Ⅰ，因此本研究選擇測定內(nèi)酯型CPT含量更能反映CPT在體內(nèi)的真實情況。大鼠藥動學研究結(jié)果顯示，CPT-NC組的Cmax和AUC(0-t)隨著給藥劑量的增加而增加，在(0.25～1)mg·kg-1給藥劑量下呈線性關(guān)系。在相同給藥劑量下，CPT-NC組的AUC(0-t)為CPT-Free組的AUC(0-t)的1.32倍，表明膠束載藥系統(tǒng)對內(nèi)酯型CPT具有保護作用，可以抑制內(nèi)酯環(huán)CPT的開環(huán)。CPT-NC組的t1/2為CPT-Free組的t1/2的1.17倍。以上結(jié)果反映載藥膠束能有效保護內(nèi)酯型CPT，提高其生物利用度，增強治療效果。該納米載藥膠束提高 CPT生物利用度的原因可能是： 其核-殼結(jié)構(gòu)上的聚乙二醇可以減少載體與血液成分的相互作用，減少RES 系統(tǒng)的攝取和腎臟的清除，從而延長載藥膠束在體內(nèi)的半衰期；加上空間立構(gòu)復合物穩(wěn)定性更好，可以有效保護CPT的內(nèi)酯環(huán)；另外，CPT屬于難溶性藥物，通過膠束疏水端的包裹可以增加其溶解度，改善其在體內(nèi)的吸收和分布；綜上所述，該新型納米載藥膠束可以有效提高CPT的生物利用度，并增強其治療效果。

小鼠體內(nèi)組織分布的結(jié)果顯示：小鼠尾靜脈注射給藥后內(nèi)酯型CPT在各組織中分布廣泛，各組織中均檢出內(nèi)酯型CPT，且分布迅速，特別是肝和肺組織中。該載藥膠束可以通過其天然被動靶向發(fā)揮作用，如其對心臟和肝臟的靶向性；但一般被肺組織截留的粒子粒徑需大于7 μm，這遠遠大于納米膠束200 nm的粒徑，因此，其對肺的高親和性可能是因為聚乳酸空間立構(gòu)復合膠束表面帶正電荷，而表面帶正電荷的粒子由于靜電作用更易被肺組織攝取。在整個體內(nèi)過程中，CPT-NC組進入肺中的內(nèi)酯型CPT含量都比CPT-Free組高很多，說明載藥膠束在肺中的靶向作用更強，提示我們載藥膠束對肺癌可能有較好的治療作用。而且，CPT-NC組在脾和腎臟中的分布較低，可以減輕對脾腎患者的毒副作用，在臨床治療上有重要意義。