鵪鶉內(nèi)臟型痛風模型的誘導初探

褚夢真，林志健，張 冰，王 雨，董一珠，王 笑，楊 婷

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029)

根據(jù)禽痛風臨床癥狀不同分為關(guān)節(jié)型痛風和內(nèi)臟型痛風，內(nèi)臟型痛風是由于禽類動物尿酸產(chǎn)生過多兼或尿酸排泄障礙導致血液中尿酸含量顯著升高，形成高尿酸血癥，進而以尿酸鹽沉積胸腹腔及各種臟器表面和其他間質(zhì)組織中的一種疾病[1]。

引發(fā)禽內(nèi)臟型痛風的誘因大多為高嘌呤或高鈣飲食，郭小權(quán)[2]使用高蛋白質(zhì)飼糧和高鈣飼糧成功復制了雞內(nèi)臟型痛風病例，證實了飼糧蛋白質(zhì)和鈣對禽內(nèi)臟型痛風發(fā)生的重要影響。這與人類因飲酒、大量進食海鮮類及動物內(nèi)臟等嘌呤過多的食物從而誘發(fā)痛風的臨床發(fā)病病因極為相似，且禽類的嘌呤代謝途徑與人類相似，飼料攝入的蛋白質(zhì)和嘌呤也以尿酸為代謝終產(chǎn)物排出體外。因此本研究則選用體積較小便于實驗操作的鵪鶉為研究對象，以高嘌呤高鈣飲食結(jié)合限制飲水來誘導鵪鶉禽內(nèi)臟型痛風模型，以期為禽類、人類痛風的發(fā)病機制及防治藥物的篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物40日齡，♂,迪法克鵪鶉30只，體質(zhì)量(130±10) g，購自北京市德嶺鵪鶉廠，合格證號: 1100368967。

1.2 飼料選用酵母浸膏粉和牛骨粉添加至普通飼料中作為高嘌呤高鈣食餌。在實驗室前期基礎(chǔ)上，高嘌呤高鈣飼料配比為，基礎(chǔ)飼料 ∶ 酵母浸膏粉 ∶ 牛骨粉為5 ∶ 2 ∶ 3。其中正常組飼喂普通飼料其鈣含量為1%，模型組飼喂高嘌呤高鈣飼料其鈣含量為24%；正常組普通飼料中嘌呤含量為79.28 mg·kg-1，模型組高嘌呤高鈣飼料中嘌呤含量為424.83 mg·kg-1。日糧中其余營養(yǎng)成分均符合美國NRC家禽營養(yǎng)需要標準[3]。日糧組成見Tab 1。

1.3 試劑及藥物普通飼料，批號：20180625，購自北京市德嶺鵪鶉廠；酵母浸膏粉，批號：1424987-02，購自英國Oxoid公司；牛骨粉，批號：20180715，購自衡水愛寵商貿(mào)有限公司；尿素氮測定試劑盒(Urea nitrogen determination kit，BUN)，批號：20180908，肌酐測定試劑盒(Creatinine determination kit，Cr)，批號：20180921，黃嘌呤氧化酶試劑盒(Xanthine oxidase Kit，XOD)，批號：201812016，腺苷脫氨酶試劑盒(Adenosine deaminase Kit，ADA)，批號：20180911，均購自南京建成生物技術(shù)公司；尿酸測定試劑盒(Uric acid determination kit，UA)，批號：171314，購自中生北控生物科技股份有限公司；尿酸鹽染色試劑盒，批號：20180604；購自北京索萊寶科技有限公司。

Tab 1 Experimental dietary composition(%)

Note: Guarantee value of component analysis of premixtures (per kg): vitamin A 200 000 IU, vitamin D360 000 IU, vitamin E 380 mg, vitamin K356 mg, vitamin B156 mg, vitamin B2200 mg, vitamin B660 mg, vitamin B12300 μg, biotin 3 mg, nicotinic acid 600 mg, calcium pantothenate 240 mg, folate 30 mg, copper 0.2 g, iron 1.8 g, manganese 1.4 g, zinc 1.1 g, selenium 6 mg, iodine 8.5 mg, phosphorus 15～60 g, calcium 100～250 g, sodium chloride 50～150 g, amino acid 28 g.

1.4 儀器與設(shè)備3K1S低溫高速離心機，德國Sigma公司；sunrise酶標儀，瑞士TECAN公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京鴻達天矩試驗設(shè)備有限公司；Reichert Histo STAT石蠟組織切片機，美國AO公司；Olmpus BX53顯微鏡，日本奧林巴斯。

1.5 分組與造模40日齡♂迪法克鵪鶉30只，適應性飼養(yǎng)3～5 d，按體質(zhì)量隨機分為3組，分別為正常組、模型A組和模型B組，每組各10只。實驗期間各組鵪鶉均給予清水，正常組、模型A組飲水不限量，模型B組飲水150 mL·d-1。且正常組和模型組均按照Tab 1進行飼料配制，攝食不限量，每天記錄攝食量。實驗周期為40 d， d 40鵪鶉頸靜脈取血1.5 mL后處死，取各組鵪鶉腎臟組織固定、制作石蠟切片?？刂苿游锓渴覝?20～25) ℃，濕度40%～60%。

1.6 檢測指標分別于實驗d 10、20、30、40，禁食不禁水12 h，頸靜脈取血，3 500 r·min-1離心10 min，分離血清，取上清以備用。檢測血清尿酸(SUA)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。

2 結(jié)果

2.1 鵪鶉攝食量和體質(zhì)量變化實驗期間，與正常組比，d 20、d 30模型A組、模型B組攝食量出現(xiàn)極顯著增多(P<0.01)，d 40模型A組攝食量出現(xiàn)顯著增多(P<0.05)。具體變化見Tab 2；各組鵪鶉體質(zhì)量呈平穩(wěn)上升趨勢，模型B組與模型A組相比，實驗d 20，鵪鶉體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，見Tab 3。

2.2 鵪鶉血尿酸水平變化與正常組相比，實驗d 10、20、30，模型A和B組鵪鶉血尿酸水平極顯著升高(P<0.01)。d 40，模型A和B組動物血尿酸水平顯著升高(P<0.05)；與模型A組比，實驗d 20，模型B組血尿酸水平極顯著升高(P<0.01)，d 30，模型B組顯著降低(P<0.05)，見Tab 4。

2.3 鵪鶉血尿酸代謝相關(guān)酶活力變化

2.3.1血清黃嘌呤氧化酶(XOD)活力 與正常組相比，實驗d 20，模型A組血清黃嘌呤氧化酶活性水平顯著降低(P<0.05)；d 10、30、40，與正常組相比，其余兩組動物血清黃嘌呤氧化酶活性水平無明顯變化。見Tab 5。

Tab 2 Quail food intake in each

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

Tab 3 Weight levels of quails in each

#P<0.05vsmodel A

Tab 4 Quail serum uric acid (SUA) levels in each

*P<0.05,**P<0.01vsnormal,#P<0.05vsmodel A

Tab 5 Serum xanthine oxidase (XOD) activity of quails in each

*P<0.05vsnormal

2.3.2血清腺苷脫氨酶(ADA)活力 實驗d 10，與正常組相比，模型A組、模型B組血清腺苷脫氨酶活性極顯著升高(P<0.01)；實驗d 30，與正常組相比，模型A組、模型B組血清腺苷脫氨酶活性顯著升高(P<0.05)。見Tab 6。

2.4 鵪鶉血清肌酐、尿素氮水平變化

2.4.1血清肌酐(Cr)水平 實驗d 20，與模型A組相比，模型B組動物血肌酐水平均顯著升高(P<0.05)。實驗d 30、40，與正常組相比，模型A和B組動物血肌酐水平均顯著升高(P<0.05)。見Tab 7。

2.4.2血清尿素氮(BUN)水平 實驗d 10、20，與正常組相比，模型A、B各組鵪鶉血清尿素氮水平顯著升高(P<0.05)，見Tab 8。

宋代徐鉉校定本《說文解字·卷十·夭部》對“喬”字的說解為：“高而曲也。從夭，從高省?！对姟吩唬骸嫌袉棠?。’巨嬌切。”清代段玉裁的《說文解字注》這樣寫到：“按喬不專謂木。淺人以說木則作‘橋’，如《鄭風》‘山有橋松’是也。以說山則作‘嶠’，釋‘山銳而高嶠’是也?！笨梢?，“喬”字剛開始是表示樹木或其枝干高大彎曲的。元以后，“喬”字主要作形容詞和動詞，有貶低的感情色彩，它的意義也發(fā)生了一定的引申變化。

2.5 實驗第40天鵪鶉腎臟組織病理形態(tài)學觀察鵪鶉腎臟病理切片HE染色400倍光學顯微鏡下可見正常組鵪鶉腎組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞核藍染，胞質(zhì)均勻紅染，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常。模型A、B組腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常，組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細胞形態(tài)正常。見Fig 1。

鵪鶉腎臟病理切片尿酸鹽染色400倍光學顯微鏡下可見，正常組鵪鶉腎組織中未見黑色尿酸鹽結(jié)晶沉積，模型組鵪鶉腎組織明顯可見黑色的尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎小管，且近曲小管和遠曲小管均有分布。模型B組因結(jié)合限水，結(jié)果相較于模型A組明顯可見較大量黑色的尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎小管。見Fig 2。

3 討論

3.1 高嘌呤高鈣飲食結(jié)合限水對誘導鵪鶉內(nèi)臟型痛風的作用實驗結(jié)果顯示，高嘌呤高鈣飲食結(jié)合限水會持續(xù)升高動物體內(nèi)血尿酸水平，其原因可能是通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)腺苷脫氨酶(ADA)活性來增加尿酸在體內(nèi)的合成，從而使動物機體保持高尿酸的狀態(tài)，同時會對動物腎臟功能造成一定的損傷，進一步加劇尿酸鹽在體內(nèi)的沉積。實驗中模型組以酵母浸膏粉作為高嘌呤食餌飼喂鵪鶉，為尿酸的合成提供了更多的原料，進而引發(fā)鵪鶉高尿酸血癥。由于鵪鶉體內(nèi)缺乏尿酸酶，攝入的嘌呤都以尿酸為代謝終產(chǎn)物排出體外，當血尿酸水平過高超過了排泄限值時，極易與血液中鈣、鈉離子結(jié)合，以尿酸鹽的形式存在而堵塞腎小管[4]。腎組織鈣化和腎小管堵塞則會加重尿酸排泄障礙，最終誘發(fā)痛風的發(fā)生。

水維系著動物機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保證組織器官及各類細胞的正?；顒覽5]。在禽的飼養(yǎng)過程中，若飲水不足，會造成機體脫水，促使尿濃縮，機體的代謝產(chǎn)物不能及時排出體外[6]。有學者推測限制飲水量不利于尿酸排出，易引起尿酸腎結(jié)石，加速腎臟進行性損害。腎臟在動物排泄尿酸時發(fā)揮著主要作用，腎臟損傷會影響尿酸的排泄，腎小管分泌減少，導致尿酸蓄積，與離子結(jié)合形成尿酸鹽，發(fā)生尿酸鹽沉積[7]。

3.2 鵪鶉內(nèi)臟型痛風模型的特點

3.2.1模型與人體病生理具有相似性 動物模型和人體的生物相似性是開展動物實驗的理論基礎(chǔ)。本實驗選用鵪鶉作為實驗動物，原因為鵪鶉在生理特點及病理特點方面與人類有較高的相似性。① 生理特點：鵪鶉缺乏尿酸酶，與人類代謝途徑相似，攝入的核酸類物質(zhì)在體內(nèi)降解后產(chǎn)生的尿酸無法進一步分解，尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物直接排出體外，其體內(nèi)尿酸濃度能較確切的反應體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝水平[8]。② 病理特點：采用添加酵母浸膏粉和骨粉配制的高嘌呤高鈣食餌進行模型誘導，該造模劑與臨床飲食結(jié)構(gòu)改變類似。造模d 10模型組動物血清尿酸水平升高，動物表現(xiàn)為高尿酸血癥，并可持續(xù)到d 40。同時，鵪鶉腎臟病理切片尿酸鹽染色(陽性反應時尿酸鹽結(jié)晶被染成黑色)發(fā)現(xiàn)，正常組鵪鶉腎臟病理切片未見黑色尿酸鹽沉積，而模型組腎臟組織病理切片腎小管周圍散布黑色尿酸鹽結(jié)晶沉積，且模型B組結(jié)合限制飲水量后，腎臟中尿酸鹽沉積量較模型A組明顯。

Tab 6 Serum adenosine deaminase (ADA) activity of quails in each

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

Tab 7 Serum creatinine (Cr) levels of quails in each

*P<0.05vsnormal,#P<0.05vsmodel A

Tab 8 Serum urea nitrogen (BUN) levels of quails in each

*P<0.05vsnormal

Fig 1 Observation of HE staining in renal histopathological sections(×400)

Fig 2 Urate staining of renal histopathological sections(×400)

本實驗模型組鵪鶉采食高嘌呤高鈣食餌與臨床的致病因素飲食不節(jié)、過食肥甘厚味類似；病機方面分析認為過食高嘌呤高鈣飲食，可損傷脾胃，使脾運化失健，濕濁停留體內(nèi)，濁毒不得外泄，形成高尿酸血癥。且在實驗過程中發(fā)現(xiàn)個別鵪鶉踝關(guān)節(jié)腫大、畸形?？梢姡撃Ｐ驮诓∫虿C與臨床痛風患者的病因病機十分相似。

3.2.3模型具有適用性、經(jīng)濟性 該方法誘導的鵪鶉內(nèi)臟型痛風模型屬飲食誘導法，模擬臨床飲食結(jié)構(gòu)改變，成功建立動物內(nèi)臟型痛風模型。適用于作為營養(yǎng)代謝性疾病的病理藥理研究及痛風的中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究。王巍等[11]采用鵪鶉作為高血脂血癥模型，有研究采用鵪鶉作為高尿酸血癥模型[12-13]，鵪鶉作為實驗動物已逐漸應用于生物學與醫(yī)學研究。日本學者Tsudzuki及Mizutani提出鵪鶉可作為一種新型實驗動物，由于鵪鶉是雞形目中最小的品種，體型適中，性成熟早，易于飼養(yǎng)管理，飼料消耗少，占空間小，目前已逐漸應用于生物學與醫(yī)學研究[14-15]。本實驗采用酵母粉和骨粉誘導的鵪鶉內(nèi)臟型痛風模型，造模劑配制簡單，價格合理，模型穩(wěn)定時間長，實驗操作方便，取血方法簡單，便于動態(tài)觀察且可減少動物使用數(shù)量，經(jīng)濟性較好。

綜上，本實驗以鵪鶉為實驗對象，通過高嘌呤高鈣飲食結(jié)合限水研究，結(jié)果顯示其可明顯升高動物體內(nèi)血清尿酸水平，且能對動物腎臟產(chǎn)生明顯的病理變化，使尿酸鹽沉積于腎臟，為禽類內(nèi)臟型痛風模型的建立提供了條件。模型研究不足之處：未觀察其他臟器是否出現(xiàn)尿酸鹽沉積現(xiàn)象。且研究應進一步深入，對模型的中醫(yī)證候及應用范圍加以研究，以期為該病的防治及藥物研發(fā)提供參考。