基于轉(zhuǎn)錄組的蘋(píng)小卷葉蛾殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)及解毒代謝相關(guān)基因分析

孫麗娜, 張懷江, 劉孝賀, 仇貴生

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所, 遼寧興城 125100)

蘋(píng)小卷葉蛾Adoxophyesorana是蘋(píng)果、桃、櫻桃、山楂、茶、棉花和豆類(lèi)等多種果樹(shù)及農(nóng)作物的主要害蟲(chóng)。因其為害果樹(shù)，故果樹(shù)上的蘋(píng)小卷葉蛾又稱(chēng)小黃卷葉蛾、遠(yuǎn)東卷葉蛾、蘋(píng)褐帶卷蛾(何振昌, 1997)。該害蟲(chóng)的幼蟲(chóng)不僅取食植物幼葉、花，還可轉(zhuǎn)果為害多個(gè)果實(shí)，甚至能啃食套塑膜袋為害果實(shí)。近年來(lái)，由于果樹(shù)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和種植模式變化使該蟲(chóng)在我國(guó)北方果區(qū)發(fā)生為害逐漸加重，為害面積也不斷擴(kuò)大(胡雅輝等, 2009)。適逢多雨高濕天氣，也會(huì)導(dǎo)致該蟲(chóng)的暴發(fā)(孫麗娜等, 2015a)。為了減輕該蟲(chóng)對(duì)果樹(shù)造成的危害，化學(xué)防治是目前防治該蟲(chóng)最有效的途徑之一。田間驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺、蟲(chóng)酰肼、甲氧蟲(chóng)酰肼、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和虱螨脲對(duì)防治蘋(píng)小卷葉蛾均具有較好防效(孫麗娜等, 2014)。然而，由于蘋(píng)小卷葉蛾潛居于卷葉中，難以完全接觸藥劑，且有些藥劑長(zhǎng)期施用，使該蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于昆蟲(chóng)毒理學(xué)研究領(lǐng)域，為無(wú)參考基因組害蟲(chóng)研究提供了技術(shù)支持。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析了衛(wèi)生害蟲(chóng)(岡比亞按蚊Anophelesgambiae)、大田作物害蟲(chóng)(灰飛虱Laodelphaxstriatellus、玉米螟Ostriniafurnacalis)、蔬菜害蟲(chóng)(小菜蛾P(guān)lutellaxylostella)、果樹(shù)害蟲(chóng)(桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis)、林業(yè)害蟲(chóng)(舞毒蛾Lymantriadispar)等對(duì)殺蟲(chóng)劑代謝、解毒及抗藥性機(jī)制，涉及不同種類(lèi)殺蟲(chóng)劑如有機(jī)磷、菊酯類(lèi)、二酰胺類(lèi)、苯基吡唑類(lèi)等(Heetal., 2012; Zhangetal., 2012; Houetal., 2014; Caoetal., 2015; Cuietal., 2017; Domingosetal., 2017)。筆者前期研究表明，我國(guó)蘋(píng)小卷葉蛾的有效防治藥劑主要有蟲(chóng)酰肼、甲氧蟲(chóng)酰肼、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、虱螨脲等(孫麗娜等, 2014)。蟲(chóng)酰肼、甲氧蟲(chóng)酰肼和虱螨脲是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，作用靶標(biāo)為蛻皮激素受體，甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽作用靶標(biāo)為氯離子通道蛋白，氯蟲(chóng)苯甲酰胺的靶標(biāo)為昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體(www.irac-online.org)。害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性的過(guò)程，與殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)的敏感性、解毒酶的活性密切相關(guān)(高希武, 2012)。

本文采用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)開(kāi)展蘋(píng)小卷葉蛾的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，挖掘?qū)μO(píng)小卷葉蛾具有較好防效的殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)基因及該蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的主要解毒代謝相關(guān)基因，為相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能研究及進(jìn)一步開(kāi)展蘋(píng)小卷葉蛾抗藥性的分子機(jī)制和治理策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 害蟲(chóng)飼養(yǎng)

供試蟲(chóng)源采自遼寧興城(40.61°N, 120.73°E)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工氣候箱中于溫度為25±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期為16L∶8D的條件下用金冠蘋(píng)果Malusdomesticacv. Golden Delicious葉片飼養(yǎng)2代后，取卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)混合樣為供試材料，于液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

用TRIzol試劑提取蘋(píng)小卷葉蛾卵約200粒、幼蟲(chóng)20頭、蛹20頭、成蟲(chóng)20頭總RNA(孫麗娜等, 2015b)?？俁NA的提取、質(zhì)量分析、cDNA文庫(kù)的建立及測(cè)序工作由華大基因有限公司(深圳)完成。采用Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序(劉長(zhǎng)莉等, 2013)。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Nesoni Tools程序?qū)υ紃eads進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，使用Trinity v 2.0.6對(duì)得到的有效讀序(clean reads)組裝unigenes，并使用Blast2go軟件將拼接的unigenes與NCBI的NR(非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)), NT(核酸數(shù)據(jù)庫(kù)), Swiss-Prot(蛋白質(zhì)注釋信息數(shù)據(jù)庫(kù)), GO(Gene Ontology), COG(Clusters of Orthologous Groups), KOG(euKaryotic Orthologous Groups), KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及信息注釋(Grabherretal., 2011)。

1.4 殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因的鑒定及表達(dá)模式分析

根據(jù)unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行功能注釋?zhuān)谵D(zhuǎn)錄組中搜索防治蘋(píng)小卷葉蛾常用殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因蛻皮激素受體、乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿受體、鈉離子通道、氯離子通道、γ-氨基丁酸、幾丁質(zhì)酶、魚(yú)尼丁受體基因等。以核糖體蛋白S15基因?yàn)閮?nèi)參基因，參照筆者之前研究方法(Sunetal., 2016)檢測(cè)6個(gè)殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因在蘋(píng)小卷葉蛾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，基因名及引物見(jiàn)表1。卵為1-6日齡混合樣120粒，1-5齡幼蟲(chóng)各10頭，蛹分別為2, 4, 6, 8和10日齡混樣10頭，成蟲(chóng)分別為1, 3和5日齡混樣10頭。試驗(yàn)于Bio-Rad CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，樣品重復(fù)3次，另加3個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)體系(20 μL): 1 μL稀釋10倍的cDNA(20 ng), 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 2×SYBR Green I 10 μL, 加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因分別以2齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)2-ΔΔCt相對(duì)定量法統(tǒng)計(jì)各基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量差異，每個(gè)發(fā)育階段重復(fù)3次(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers in qPCR

1.5 解毒代謝相關(guān)基因的挖掘及代謝通路、進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)將unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在轉(zhuǎn)錄組中篩選與抗藥性相關(guān)的細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因等。提取序列，鑒定具有完整ORF的基因，采用MEGA6序列分析軟件中鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)(劉長(zhǎng)莉等, 2013; Tianetal., 2018)。同時(shí)分別按照Feyereisen (2005)、Oakeshott等(1999)、Ranson和Hemingway(2005)的方法對(duì)細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行分類(lèi)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 20.0分析系統(tǒng)，各處理平均數(shù)經(jīng)過(guò)方差分析后，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制，共得到52 962 442 clean reads，最終對(duì)轉(zhuǎn)錄組的clean data進(jìn)行拼接共得到48 610條unigene，平均長(zhǎng)度為796 bp，unigene中超過(guò)1 000 bp的數(shù)量為12 694，其不同長(zhǎng)度的具體分布圖如圖1所示。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為SRP143426；組裝的clean data提交至NCBI TSA數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank登錄號(hào): GGMW00000000)。

圖1 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組拼接后的unigenes長(zhǎng)度分布Fig. 1 Length distribution of the assembled unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

2.2 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中unigenes的功能注釋及序列特征

將組裝得到的48 610個(gè)unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)選擇BLAST參數(shù)E-value不大于1e-5和HMMER參數(shù)E-value不大于1e-10且有注釋信息的unigene，結(jié)果如表2所示。根據(jù)序列同源性比對(duì)，NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的16 803個(gè)注釋基因源自300余個(gè)物種，分布如圖2所示。其中5 428個(gè)基因與甜菜夜蛾Spodopteraexigua同源，3 308個(gè)基因與家蠶Bombyxmori同源，與2物種同源的注釋基因占總注釋基因的67.61%；其后依次是與柑橘鳳蝶Papilioxuthus、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和岡比亞蚊Anophelesgambiae同源的基因分別為464, 321和177個(gè)，分別占總注釋基因的3.59%, 2.48%和1.37%；與其他物種同源的基因占總注釋基因的24.95%。

2.3 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)及表達(dá)模式分析

根據(jù)蘋(píng)小卷葉蛾防治中藥劑的應(yīng)用，篩選藥劑的靶標(biāo)基因。通過(guò)比對(duì)NR, NT, Swiss-Port, KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的序列，搜索蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因155個(gè)(表3)，與幾丁質(zhì)酶相關(guān)的基因在蘋(píng)小卷葉蛾中數(shù)目最多，占?xì)⑾x(chóng)劑靶標(biāo)unigene的47.10%。155個(gè)unigene與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線(xiàn)比對(duì)，鑒定出1個(gè)蛻皮激素受體基因、2個(gè)膽堿酯酶基因、1個(gè)氯離子通道基因、1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因和1個(gè)魚(yú)尼丁受體基因。

qPCR結(jié)果顯示，6種靶基因在蘋(píng)小卷葉蛾不同發(fā)育階段均呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。隨著蘋(píng)小卷葉蛾發(fā)育蛻皮激素受體基因表達(dá)逐漸下調(diào)(圖3: A)，該基因在卵期的表達(dá)量分別是1-5齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)期的17.68, 24.62, 29.67, 27.61, 28.60, 46.76和72.61倍(P<0.05)。乙酰膽堿酯酶1基因在3齡和5齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量較高(圖3: B)(P<0.05)；乙酰膽堿酯酶2基因則蛹期表達(dá)量最高(圖3: C)(P<0.05)。而蛹和成蟲(chóng)期的氯離子通道蛋白基因表達(dá)量顯著高于卵期和幼蟲(chóng)期(圖3: D)(P<0.05)。幾丁質(zhì)酶基因在3-5齡幼蟲(chóng)期的表達(dá)量較高，4齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量分別是卵期、蛹期和成蟲(chóng)期的22.89, 35.63和450.75倍(圖3: E)(P<0.05)。魚(yú)尼丁受體基因在蘋(píng)小卷葉蛾卵、1齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)期的表達(dá)量較高，且在幼蟲(chóng)期表達(dá)逐漸下調(diào)，其在卵期的表達(dá)量分別是4和5齡幼蟲(chóng)的12.27和13.39倍(圖3: F)(P<0.05)。

表2 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組unigenes注釋統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical of the annotated unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

圖2 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組unigenes在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布圖Fig. 2 Species distribution of unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome in NR database

表3 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 3 Number of insecticide target genes inthe Adoxophyes orana transcriptome

2.4 蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中解毒代謝相關(guān)基因的挖掘、代謝通路及進(jìn)化關(guān)系分析

蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)69個(gè)羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE) unigene, 66個(gè)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathion S-transferase, GST)unigene和205個(gè)細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)unigene。解毒代謝相關(guān)基因中細(xì)胞色素P450基因數(shù)目占3種解毒酶基因的71.6%，遠(yuǎn)多于羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的數(shù)量，這與細(xì)胞色素P450酶在昆蟲(chóng)物質(zhì)代謝過(guò)程中極其重要的地位有關(guān)。

根據(jù)NR注釋結(jié)果與KEGG通路分析，過(guò)濾掉短片段、等位基因后，發(fā)現(xiàn)20個(gè)CarE unigene與drug metabolism-other enzymes (ko00983)通路有關(guān)。其中12個(gè)CarE unigene具有完整的ORF。

在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，31個(gè)GST unigene與drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)通路相關(guān)，32個(gè)GST unigene與metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相關(guān)，差異unigene為unigene68409_All。

人工剔除不能正確翻譯、與微生物具有高度同源性和長(zhǎng)度小于700 bp的unigene后，從205個(gè)細(xì)胞色素P450相關(guān)的unigene中鑒定出66個(gè)P450 unigene，平均長(zhǎng)度1 762 bp。根據(jù)KO注釋結(jié)果，對(duì)P450 unigene進(jìn)行分類(lèi)，其中14個(gè)unigene屬于family3, 10個(gè)屬于family4， 22個(gè)屬于family6， 8個(gè)屬于family9。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路分析，其中30個(gè)P450 unigene均與drug metabolism-other enzymes (ko00983), drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)和metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相關(guān)。且30個(gè)P450 unigene中12個(gè)屬于family3， 10個(gè)屬于family6， 8個(gè)屬于family9。

獲得12個(gè)具有完整開(kāi)放閱讀框的蘋(píng)小卷葉蛾CarE基因，通過(guò)與其他已知昆蟲(chóng)的CarEs序列進(jìn)行NJ聚類(lèi)分析(圖4)，結(jié)果顯示，9個(gè)基因?yàn)镚類(lèi)，即鱗翅目保幼激素類(lèi)基因；1個(gè)為D類(lèi)，即moth integument esterase withDrosophilahomologs基因，1個(gè)屬于E類(lèi)即β-酯酶基因，1個(gè)屬于Gliotactin類(lèi)基因。

圖3 蘋(píng)小卷葉蛾6個(gè)殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因的發(fā)育表達(dá)模式Fig. 3 Expression profiles of six insecticide target genes in Adoxophyes orana at different developmental stagesA: 蛻皮激素受體基因Ecdysone receptor gene; B: 乙酰膽堿酯酶1基因Acetylcholinesterase 1 gene; C: 乙酰膽堿酯酶2基因Acetylcholinesterase 2 gene; D: 氯離子通道蛋白基因Chloride channel gene; E: 幾丁質(zhì)酶基因Chitinase gene; F: 魚(yú)尼丁受體基因Ryanodine receptor gene. Eg: 卵Egg; L1-5: 分別為1-5齡幼蟲(chóng)1st-5th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; Ad: 成蟲(chóng)Adult. 以核糖體蛋白S15基因?yàn)閮?nèi)參基因; 以2齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同小寫(xiě)字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段間差異顯著(P<0.05, Duncan氏檢驗(yàn))。The ribosomal protein S15 gene was used as the reference gene, and the expression level of gene in the 2nd instar larva was taken as the standard. Data in the figure are mean±SE, and different small letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, Duncan’s test).

AoGSTs與其他昆蟲(chóng)GSTs之間的進(jìn)化關(guān)系的結(jié)果表明(圖5)，AoGSTs被劃分為5個(gè)亞家族，分別為Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，基因數(shù)分別為4, 5, 1, 10和10。其中尚未發(fā)現(xiàn)有基因類(lèi)屬Zeta家族基因。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CL3513.contig2 unigene與同為果樹(shù)害蟲(chóng)的蘋(píng)果蠹蛾CydiapomonellaGSTd1(GenBank登錄號(hào): ACJ23087.1)的氨基酸序列一致性最高，達(dá)81.86%。

根據(jù)ORF編碼氨基酸序列，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)完整的P450基因，與其他27個(gè)P450基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)。結(jié)果表明，蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中的18個(gè)P450基因全部聚到CYP3集團(tuán)(CYP3 clade)，未有P450聚集到CYP2集團(tuán)(CYP2 clade)，CYP4集團(tuán)(CYP4 clade)和線(xiàn)粒體集團(tuán)(mitochondrial clade)。

圖4 基于氨基酸序列的蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組CarE unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 4 Phylogenetic analysis of CarE unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)D: Moth integument esterase with Drosophila homologs; E: Diptera β-esterases with hemipteran sister group; F: Nonlepidopteran juvenile hormone esterases and like enzymes; G: Lepidopteran JHE’s and Anopheles sister group; H: Glutactin and like enzyme; K: Uncharacterized putative neuroreceptor group; M: Gliotactin; L: Neuroligins. 菱形所標(biāo)基因?yàn)樘O(píng)小卷葉蛾CarE unigene。CarE unigenes of A. orana are marked with black rhombus. 其他基因來(lái)源物種Origin species of other genes: Aaeg: 埃及伊蚊Aedes aegypti; Dmel: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Cfum: 云杉卷葉蛾Choristoneura fumiferana; Msex: 煙草天蛾Manduca sexta; Agam: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae; Apol: 多音天蠶Antheraea polyphemus; Tcas: 赤擬谷盜Tribolium castaneum.

圖5 基于氨基酸序列的蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組GST unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 5 Phylogenetic analysis of GST unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)黑色圓點(diǎn)所標(biāo)基因?yàn)樘O(píng)小卷葉蛾GSTs基因。GST unigenes of A. orana are marked with black circles. 其他基因來(lái)源物種Origin species of other genes: Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Prap: 菜粉蝶Pieris rapae; Csup: 二化螟Chilo suppressalis; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Dant: 蔥蠅Delia antiqua; Slit: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Hvit: 黃野螟Heortia vitessoides; Lmig: 東亞飛蝗Locusta migratoria; Agam: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae; Cpom: 蘋(píng)果蠹蛾Cydia pomonella; Pxut: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus; Ofur: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Aper: 柞蠶Antheraea pernyi.

圖6 基于氨基酸序列的蘋(píng)小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組P450 unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 6 Phylogenetic analysis of CYP unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)三角號(hào)所標(biāo)基因?yàn)樘O(píng)小卷葉蛾CYP unigene。CYP unigenes from A. orana are marked with black triangles. 其他基因來(lái)源物種 Origin species of other genes: Dpas: 歐洲防風(fēng)草結(jié)網(wǎng)毛蟲(chóng)Depressaria pastinacella; Slit: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Obru: 冬尺蠖Operophtera brumata; Dsim: 擬果蠅Drosophila simulans; Dbus: 巴氏果蠅Drosophila busckii; Dmel: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Zcuc: 瓜實(shí)蠅Zeugodacus cucurbitae; Csec: 白蟻Cryptotermes secundus; Agos: 棉蚜Aphis gossypii; Bman: 野桑蠶Bombyx mandarina; Papo: 阿波羅絹蝶Parnassius apollo; Dple: 帝王蝶Danaus plexippus; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Lstr: 灰飛虱Laodelphax striatella; Nden: 綠蝦Neocaridina denticulata.

3 討論

新一代高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛用于昆蟲(chóng)分子標(biāo)記、抗藥性相關(guān)基因的挖掘、昆蟲(chóng)與其他生物互作研究等方面。本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)蘋(píng)小卷葉蛾的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析。在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，蘋(píng)小卷葉蛾注釋到甜菜夜蛾的序列信息最多，源于兩種昆蟲(chóng)均屬鱗翅目害蟲(chóng)，親緣關(guān)系相對(duì)較近。此現(xiàn)象在其他物種轉(zhuǎn)錄組研究中也得到證實(shí)，如桃小食心蟲(chóng)Carposinasasalii的轉(zhuǎn)錄組中6 684個(gè)基因與家蠶Bombyxmori中的同源，占比達(dá)39.8%；梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta的觸角轉(zhuǎn)錄組52.2%的序列注釋到帝王蝶Danausplexippus的序列(Lietal., 2015; 孫麗娜等, 2018)。目前，尚未見(jiàn)蘋(píng)小卷葉蛾基因組報(bào)道，對(duì)該蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的測(cè)定和分析，可同時(shí)獲得多個(gè)靶標(biāo)基因、解毒代謝相關(guān)基因的序列信息，加速殺蟲(chóng)劑對(duì)此害蟲(chóng)作用機(jī)制的研究。

本研究qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)小卷葉蛾殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因的表達(dá)模式與其他害蟲(chóng)存在差異。蘋(píng)小卷葉蛾EcR基因在卵期的表達(dá)量最高(圖3: A)，而茶尺蠖Ectropisobliqua和煙粉虱Bemisiatabaci的EcR基因均在成蟲(chóng)期表達(dá)量最高(李良德等, 2015; 楊春紅等, 2016)。另有研究發(fā)現(xiàn)在黑腹果蠅和西方蜜蜂EcR基因分別編碼3個(gè)和2個(gè)異構(gòu)體，且功能不同(Benderetal.,1997; Melloetal., 2014)。Mello等(2014)發(fā)現(xiàn),在蜜蜂幼蟲(chóng)和蛹發(fā)育過(guò)程中異構(gòu)體A高表達(dá)，而在胚胎發(fā)育過(guò)程中異構(gòu)體B高表達(dá)，這表明不同異構(gòu)體在不同發(fā)育時(shí)期可能存在不同的調(diào)控作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在蘋(píng)小卷葉蛾中尚未發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體，蘋(píng)小卷葉蛾中是否也存在其他異構(gòu)體，還有待進(jìn)一步證實(shí)。有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑通過(guò)抑制害蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶的活性殺害昆蟲(chóng)。蘋(píng)小卷葉蛾Ache1在3齡幼蟲(chóng)期表達(dá)最高(圖3: B)，而Ache2在蛹期表達(dá)最高(圖3: C)。蓖麻蠶Philosamiacynthiaricini乙酰膽堿酯酶基因Pcrace2在成蟲(chóng)期表達(dá)量最高(劉娟等, 2013)，褐色橘蚜Aphiscitricidus乙酰膽堿酯酶基因Tcace1和Tcace2從若蟲(chóng)到成蟲(chóng)期表達(dá)量逐漸升高(牟星, 2017)。對(duì)于蘋(píng)小卷葉蛾幾丁質(zhì)酶基因，其在3-5齡幼蟲(chóng)期持續(xù)高表達(dá)(圖3: E)，不同于小菜蛾P(guān)xyChi基因，其在成蟲(chóng)期表達(dá)量最高( 申建梅等, 2018)；與棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera和舞毒蛾相似，HaCHT4基因在棉鈴蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)期的表達(dá)量最高，舞毒蛾中該基因以2齡與4齡幼蟲(chóng)期表達(dá)水平最高(劉建紅等, 2015; 麥麥提艾力·阿卜杜納斯?fàn)柕? 2019)。二酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑是目前防治鱗翅目害蟲(chóng)較流行的殺蟲(chóng)劑，其作用靶標(biāo)昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體。該類(lèi)藥劑正在果樹(shù)害蟲(chóng)的防治中推廣應(yīng)用，其對(duì)蘋(píng)小卷蛾防治效果較好。蘋(píng)小卷葉蛾魚(yú)尼丁受體基因在卵中表達(dá)量最高(圖3: F)，這與已報(bào)道的果樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)該基因的表達(dá)模式存在較大差異。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)桃小食心蟲(chóng)和梨小食心蟲(chóng)中，RyR基因在蛹期和成蟲(chóng)期均高表達(dá)，且雄蟲(chóng)中的表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)(孫麗娜等, 2015b; Sunetal., 2016)。殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度與藥劑活性是否存在相關(guān)性，該研究也有待進(jìn)一步研究。

害蟲(chóng)長(zhǎng)期暴露于殺蟲(chóng)劑中易產(chǎn)生抗藥性，CarEs, GST和細(xì)胞色素P450與害蟲(chóng)抗藥性密切相關(guān)，并稱(chēng)為昆蟲(chóng)三大解毒酶系，均屬于多基因編碼的超家族酶系。根據(jù)Oakeshott等(1999)的分類(lèi)方法，對(duì)蘋(píng)小卷葉蛾羧酸酯酶的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。與黑腹果蠅、岡比亞按蚊、白粉虱和飛蝗不同，本文鑒定的蘋(píng)小卷葉蛾中具有完整開(kāi)放閱讀框的12個(gè)羧酸酯酶基因中的9個(gè)基因?yàn)镚類(lèi)基因，即鱗翅目昆蟲(chóng)保幼激素酯酶基因，類(lèi)屬于第二功能組，與激素降解相關(guān)；CL4070.contig2屬于E類(lèi)(圖4)，即β酯酶。β酯酶、保幼激素酯酶屬于分泌型催化酯酶，β酯酶基因的數(shù)目在昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)得并不多，在鱗翅目昆蟲(chóng)的主要功能是降解性信息素(Durandetal., 2010; 張建琴, 2014)。研究認(rèn)為第一功能組(A-C簇)主要由α酯酶組成，這些酶類(lèi)可對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行代謝解毒，已有報(bào)道表明一些α酯酶參與昆蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性，然而在鑒定的所有完整開(kāi)放閱讀框基因中并未發(fā)現(xiàn)A-C簇的CarEs基因，故本文未把A-C簇的其他基因列入。

GST主要分3類(lèi)，Ⅰ類(lèi)為Delta亞家族，Ⅱ類(lèi)包括Sigma, Theta, Zeta和Omega 4個(gè)亞家族，Ⅲ類(lèi)為Epison亞家族(Ranson and Hemingway, 2005)。本文鑒定的AoGSTs被劃分為5個(gè)亞家族，分別為Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，多數(shù)AoGSTs分布在Delta和Epsilon家族，多于蘋(píng)果蠹蛾GSTs在兩個(gè)家族的分布(郭金夢(mèng), 2018)。通過(guò)比較敏感和抗性品系昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性發(fā)現(xiàn)，害蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生可能與機(jī)體內(nèi)GSTs活性提高相關(guān)(Huangetal., 1998; Vontasetal., 2001; Heetal., 2009)。Li等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，GSTs活性提高包括基因擴(kuò)增和基因過(guò)量表達(dá)2種作用機(jī)制，并且介導(dǎo)昆蟲(chóng)抗殺蟲(chóng)劑的GSTs基因主要來(lái)自Delta和Epsilon 2個(gè)亞家族，這兩個(gè)家族被認(rèn)為是昆蟲(chóng)抗藥性形成的主要原因(Shietal., 2012)。研究認(rèn)為埃及伊蚊、黑腹果蠅和岡比亞按蚊對(duì)DDT的抗藥性可能分別被AaGSTD1, DmGSTD1和AgGSTE2所誘導(dǎo)形成，家蠅Muscadomestica對(duì)有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗藥性由MdGSTD3介導(dǎo)產(chǎn)生(Wangetal., 1991; Grantetal., 1992; Tang and Tu, 1994; Lumjuanetal., 2005)。在果樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)的抗藥性研究中，Liu等(2014)研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果蠹蛾CpGSTd1基因在毒死蜱和高效氯氟氰菊酯代謝解毒過(guò)程中扮演重要角色。本研究中蘋(píng)小卷葉蛾中GST基因CL3513.contig2與CPGSTd1的氨基酸序列一致度最高，推測(cè)蘋(píng)小卷葉蛾中的CL3513.contig2在有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥劑的代謝中也起到舉足輕重的作用。

P450參與多種殺蟲(chóng)劑的代謝，是導(dǎo)致昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵基因之一。根據(jù)P450成員間的進(jìn)化及親緣關(guān)系，P450可分為CYP2集團(tuán)(CYP2 clade), CYP3集團(tuán)(CYP3 clade), CYP4集團(tuán)(CYP4 clade)和線(xiàn)粒體P450集團(tuán)(mitochondrial P450 clade)(Feyereisen, 2006)。昆蟲(chóng)所特有的P450家族主要有CYP6, CYP9, CYP12, CYP18和CYP28，其中CYP6, CYP9和CYP28屬于CYP3集團(tuán)，CYP12屬于線(xiàn)粒體集團(tuán)，CYP18屬于CYP2集團(tuán)(Feyereisen, 2005; Lietal., 2007; Daietal., 2014)。CYP3集團(tuán)是包含昆蟲(chóng)P450家族最多的集團(tuán)，與昆蟲(chóng)代謝外源物質(zhì)相關(guān)的家族屬于此集團(tuán)，本研究中鑒定的18個(gè)CYP基因均屬于CYP3集團(tuán)基因，除CL1119.contig2外，其余17個(gè)分屬于CYP6和CYP9家族基因。根據(jù)所屬通路分析，這18個(gè)基因均可參與藥物代謝，與害蟲(chóng)的抗藥性密切相關(guān)。