小麥吸漿蟲保幼激素酯酶和保幼激素環(huán)氧水解酶基因的克隆及在滯育和變態(tài)發(fā)育過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

王晶晶, 梁婷婷, 成衛(wèi)寧,*, 朱克巖

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100; 2. Department of Entomology, Texas A&M University, Texas 77843, USA)

保幼激素(juvenile hormone, JH)是最重要的一類昆蟲激素，不僅具有調(diào)控昆蟲發(fā)育和翅型分化(Ayoadeetal., 1999; Zhaoetal., 2017)、阻止幼蟲變態(tài)(Riddifordetal., 2010; Jindraetal., 2013)、促進(jìn)卵子成熟等功能(Riddiford, 2012; Royetal., 2018)，對滯育也具有重要的調(diào)節(jié)作用。滯育是昆蟲抵御不良環(huán)境，延續(xù)種族發(fā)展的重要生態(tài)對策。大量研究表明，不僅海藻糖、山梨醇、甘油三酯等化學(xué)物質(zhì)在昆蟲滯育前后發(fā)生變化(朱芬等, 2008; 劉洋等, 2016)，與滯育維持和滯育后的發(fā)育恢復(fù)相關(guān)，JH在幼蟲滯育的誘導(dǎo)和維持(Yin and Chippendale, 1973; Yagi and Akaike, 1976; Sieber and Benz, 1977; Eizaguirreetal., 1998, 2005; Munyiri and Ishikawa, 2004; Jiangetal., 2011)以及成蟲滯育的終止過程中也發(fā)揮重要作用(Vermuntetal., 1997; Smykaletal., 2014; Liuetal., 2016)。

昆蟲血淋巴中JH的滴度是通過合成與代謝共同維持和平衡的(李勝等, 2004)，其滴度的精確調(diào)控對發(fā)揮其功能至關(guān)重要。已知的兩條JH代謝途徑分別由保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase, JHE)和保幼激素環(huán)氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)催化。其中JHE被認(rèn)為是大多數(shù)昆蟲中最主要的代謝酶，該酶屬于羧酸酯酶(carboxylesterases, COEs)家族，主要分布在昆蟲的血淋巴、中腸和脂肪體中，能夠高度識別并分解與保幼激素結(jié)合蛋白結(jié)合的或游離的JH為保幼激素酸，促進(jìn)或抑制其活性能擾亂昆蟲體內(nèi)的JH水平，影響昆蟲蛻皮、化蛹和生殖，使昆蟲發(fā)育紊亂，喪失生活能力或降低生殖力(Wogulisetal., 2006; 楊文佳等, 2010; EI-Sheikhetal., 2016)，從而達(dá)到間接殺蟲的目的。最近研究發(fā)現(xiàn)，在一些昆蟲JH代謝中，JHEH與JHE同時(shí)發(fā)揮作用，甚至比JHE更重要。例如，在煙草天蛾Manducasexta和赤擬谷盜Triboliumcastaneum的幼蟲階段以及褐飛虱Nilaparvatalugens的翅型分化中，JHEH的降解是JH代謝的主要途徑(Halarnkaretal., 1993; Tsubotaetal., 2010; Zhaoetal., 2017)。

小麥吸漿蟲Sitodiplosismosellana是我國乃至世界小麥生產(chǎn)上最重要的害蟲(Miaoetal., 2013; Shrestha and Reddy, 2019)。該蟲一年發(fā)生1代，每年4月小麥抽穗后成蟲盛發(fā)并產(chǎn)卵，幼蟲孵化后危害正在發(fā)育的籽粒，小麥黃熟后3齡老熟幼蟲脫離麥穗落入土中，在土壤中結(jié)繭進(jìn)入滯育，直至12月后大部分個(gè)體終止滯育并進(jìn)入滯育后靜息期，翌年3月小麥拔節(jié)后才恢復(fù)發(fā)育(王越等, 2015; Chengetal., 2017)，即以滯育狀態(tài)存在長達(dá)10個(gè)月，屬典型的專性幼蟲滯育昆蟲。前期研究表明，JH在小麥吸漿蟲滯育誘導(dǎo)、維持及滯育后靜息狀態(tài)維持中發(fā)揮重要作用(Chengetal., 2020)，但其滴度的代謝調(diào)控是由JHE還是JHEH或者二者共同作用尚不清楚。為探討小麥吸漿蟲滯育和變態(tài)發(fā)育過程中JH滴度的代謝調(diào)控機(jī)理，本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆小麥吸漿蟲JHE和JHEH基因，并利用qPCR技術(shù)檢測兩個(gè)基因在滯育和發(fā)育進(jìn)程的表達(dá)模式，為明確JH調(diào)控因子在小麥吸漿蟲生命活動(dòng)中的功能及利用其打破體內(nèi)JH代謝平衡控制危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為小麥吸漿蟲生活史中除卵外的所有發(fā)育階段，獲得方法如下: 2016年5月上旬，在陜西省周至縣小麥吸漿蟲發(fā)生嚴(yán)重的麥田采集正在灌漿的感蟲麥穗，在解剖鏡下剝穗分離1和2齡幼蟲，蟲齡依據(jù)蟲體大小、顏色和Y型劍骨片區(qū)分(Gagne and Doane, 1999)；2016年5月下旬大量采集被害麥穗，保存部分3齡麥穗幼蟲作為滯育前樣本，其余放入西北農(nóng)林科技大學(xué)校內(nèi)養(yǎng)蟲圃(34°16′N, 108°4′E)，讓老熟幼蟲自然落土進(jìn)入滯育，然后于入土后1個(gè)月至翌年2月，每月淘土采集結(jié)繭幼蟲，翌年3月幼蟲破繭恢復(fù)活動(dòng)后至4月上旬采集滯育后發(fā)育幼蟲，隨后依次采集預(yù)蛹、初蛹、中蛹、后蛹及雌雄成蟲，蛹發(fā)育程度依據(jù)復(fù)眼和翅芽顏色劃分(武予清等, 2011)。樣本收集后每50(1-2齡幼蟲)或20頭(1-2齡外的其他蟲態(tài))分裝于1.5 mL離心管，液氮快速冷凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小麥吸漿蟲JHE和JHEH基因cDNA全長序列的克隆

取20頭小麥吸漿蟲滯育前幼蟲，參考RNA Simple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN, 北京)操作說明提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測后，以1 μg總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 大連)說明書操作，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第1鏈。

根據(jù)前期獲得的小麥吸漿蟲幼蟲轉(zhuǎn)錄組中JHE和JHEH基因保守區(qū)片段，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物(表1)。以獲得的cDNA為模板，根據(jù)2×Taq Master Mix試劑盒(康為世紀(jì)，北京)擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，用DNA純化回收試劑盒(TIANGEN，北京)純化，然后與pMDTM-19T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種到含Ampicillin, IPTG和X-Gal的培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，最后將鑒定的陽性克隆菌液送往上海英俊公司進(jìn)行測序，每個(gè)基因測定3個(gè)陽性克隆。

根據(jù)以上獲得的JHE和JHEH基因保守區(qū)片段序列設(shè)計(jì)5′和3′ RACE引物(表1)。RACE-PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照3′ Full RACE Core Set with PrimerScriptTMRTase和5′ Full RACE Kit with TAP(TaKaRa, 大連)試劑盒操說明進(jìn)行。其中5′RACE Outer和Inner擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性40 s, 54℃退火40 s, 72℃延伸40 s, 32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。3′RACE Outer 擴(kuò)增程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s, 25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min; Inner 擴(kuò)增程序同Outer PCR(除循環(huán)數(shù)為35外)。 PCR產(chǎn)物按照上述步驟經(jīng)過電泳檢測、連接、轉(zhuǎn)化和測序驗(yàn)證后，應(yīng)用DNAMAN 6.0軟件將獲得的中間序列及5′和3′末端序列進(jìn)行組裝，然后根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μL): 2×Taq MasterMix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1.5 μL, ddH2O 9 μL。擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性7 min; 94℃變性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃ 延伸30 s, 35個(gè)循環(huán)；72℃ 終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序驗(yàn)證。

1.3 序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建

利用ORF Finder在線工具(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對克隆獲得的小麥吸漿蟲JHE和JHEH基因進(jìn)行開放閱讀框鑒定；編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)應(yīng)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(http:∥www.expasy.org/Protparam)進(jìn)行預(yù)測，使用SignalP 5.0軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測，根據(jù)已報(bào)道昆蟲JHE(Wardetal., 1992; Kamita and Hammock, 2010)和JHEH序列(Zhangetal., 2005)推導(dǎo)目標(biāo)蛋白特異保守模塊；氨基酸序列一致性分析采用Blastp軟件(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining method, NJ method)，進(jìn)行1 000次bootstrap構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 小麥吸漿蟲JHE和JHEH基因在滯育和變態(tài)發(fā)育進(jìn)程中的mRNA表達(dá)分析

按照1.2節(jié)中方法分別提取小麥吸漿蟲滯育不同時(shí)期3齡幼蟲及不同發(fā)育階段(1-2齡幼蟲、預(yù)蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成蟲)樣本總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其中1齡和2齡幼蟲每處理分別用200和100頭試蟲，其他各階段為20頭。每處理重復(fù)3次。

以合成的cDNA為模板，按照SYBR Premix EX TaqTMII(TaKaRa, 大連)試劑盒說明書， 在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上檢測JHE和JHEH基因在不同滯育和發(fā)育階段樣本中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。JHE和JHEH及內(nèi)參基因GAPDH(GenBank登錄號: KR733066)定量引物見表1。qPCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×SYBR Green Premix EX TaqTMII 10 μL, cDNA模板2.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, 其余為超純水。擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性 5 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，每樣品重復(fù)測定3次。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

分別以小麥吸漿蟲滯育前的3齡幼蟲和1齡幼蟲中的基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，對1.4節(jié)獲得的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同滯育和發(fā)育階段SmJHE和SmJHEH基因相對表達(dá)水平。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件(Chicago, IL., 美國)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)，Tukey氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 小麥吸漿蟲JHE和JHEH基因的克隆與序列分析

以小麥吸漿蟲轉(zhuǎn)錄組中JHE和JHEH序列設(shè)計(jì)特異引物，通過RT-PCR和RACE技術(shù)，成功獲得了cDNA全長分別為3 102和1 980 bp的小麥吸漿蟲JHE基因(SmJHE)(GenBank登錄號: MG876768)和JHEH基因(SmJHEH)(GenBank登錄號: MG876769)(圖1)。 ORF Finder預(yù)測顯示，SmJHE和SmJHEH的ORF長度分別為1 740 bp和1 371 bp，分別編碼579和456個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測的蛋白分子量分別為65.67和51.65 kD，理論等電點(diǎn)分別為5.76和8.66。兩個(gè)基因的起始密碼子均為atg，分別位于第733-735 bp和291-293 bp處；終止密碼子均為taa，分別位于第2 472-2 474 bp和1 661-1 663 bp處；3′非編碼區(qū)均具有真核生物典型的多聚腺甘酸信號(aataa)和PolyA結(jié)構(gòu)。

SignalP5.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，SmJHE和SmJHEH基因推導(dǎo)的氨基酸序列N末端分別存在一個(gè)長度為22和18個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽序列(圖1)。氨基酸序列(圖1)分析發(fā)現(xiàn)，SmJHE蛋白包含昆蟲保幼激素酯酶5個(gè)典型功能基序，即一個(gè)長疏水結(jié)合域GxSxG，是COEs的關(guān)鍵組成部分；其他4個(gè)基序分別為RF(第67-68位氨基酸)、DQ(第187-188位氨基酸)、E(第347位氨基酸)和GxxHxxE(第466-472位氨基酸)；其中S215, E347和H469被預(yù)測形成催化三聯(lián)體(Wardetal., 1992; Kamita and Hammock, 2010)。SmJHEH蛋白包含JHEH家族組成陰氧離子洞的兩個(gè)Tyr299和Tyr374殘基和HGWP花樣結(jié)構(gòu)(第155-158位氨基酸)以及形成催化三聯(lián)體的氨基酸殘基，但組成催化三聯(lián)體的1個(gè)氨基酸發(fā)生了變異，即在多數(shù)昆蟲JHEH中為Asp, Glu和His(Zhangetal., 2005; Mackertetal., 2010)，但SmJHEH中為Asp228, Asp404和His431。赤擬谷盜T.castaneum、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata等JHE也利用Asp替代Glu作為催化三聯(lián)體(Tsubotaetal., 2010; Lüetal., 2015)。

圖1 小麥吸漿蟲SmJHE (A)和SmJHEH (B)核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of SmJHE (A) and SmJHEH (B) from Sitodiplosis mosellana起始密碼子atg和終止密碼子taa用方框標(biāo)注，N端的信號肽用雙下劃標(biāo)注，多聚腺甘酸信號(aataa)用單下劃線標(biāo)注。JHE的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域RF, DQ, GASAG, E和GVSHADE和組成JHEH的催化三聯(lián)體的Asp228, Asp404和His431氨基酸殘基用及組成陰氧離子洞的Tyr299和Tyr374殘基以及HGWP花樣結(jié)構(gòu)用黑色陰影標(biāo)注。The initiation codon atg and the termination codon taa are boxed. The N terminal signal peptides are indicated by double underline. The putative polyadenylation signals (aataa) are indicated by single underline, and five conserved motifs of JHE including RF, DQ, GASAG, E and GVSHADE, as well as acidic residues consisting of the conserved catalytic triad including Asp228, Asp404 and His431, and the potenital oxyanion hole including Tyr299 and Tyr 374 and HGWP motif of JHEH are in black shade.

2.2 SmJHE和SmJHEH蛋白序列一致性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

蛋白氨基酸序列一致性分析(圖2)表明，SmJHE與同目同亞目(雙翅目長角亞目)昆蟲達(dá)氏按蚊Anophelesdarling、埃及伊蚊Aedesaegypti、白紋伊蚊Aedesalbopictus和岡比亞按蚊AnophelesgambiaeJHE的氨基酸序列一致性較高，為49%～51%，其次為與家蠅Muscadomestica、廄螫蠅Stomoxyscalcitrans、絲光綠蠅Luciliacuprina、牽牛花果蠅Drosophilaelegans、地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis和漿果實(shí)蠅Rhagoletiszephyria等同目短角亞目昆蟲JHE的氨基酸序列一致性為45%～48%，與其他3個(gè)目(鱗翅目、膜翅目和鞘翅目)7種昆蟲同源蛋白的氨基酸序列一致性為40%～42%。SmJHEH與12種雙翅目昆蟲JHEH的氨基酸序列一致性為51%～53%，與鱗翅目、膜翅目和鞘翅目7種昆蟲JHEH的氨基酸序列一致性為47%～49%。用MEGA 6.0中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，雙翅目、鱗翅目、膜翅目和鞘翅目昆蟲JHE和JHEH完全被分開，SmJHE和SmJHEH均與長角亞目昆蟲對應(yīng)蛋白的親緣關(guān)系最近，與昆蟲傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的小麥吸漿蟲與其他昆蟲JHE (A)和JHEH (B)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of JHE (A) and JHEH (B) from Sitodiplosis mosellana and other insectsbased on amino acid sequence by the neighbor-joining method分支上的數(shù)字為1 000次重復(fù)的自舉檢驗(yàn)值。Numbers on the branches are the bootstrap values based on 1 000 replicates.

2.3 小麥吸漿蟲滯育不同階段幼蟲SmJHE和SmJHEH表達(dá)水平分析

為探討SmJHE和SmJHEH在小麥吸漿蟲滯育中可能的作用，采用qPCR技術(shù)分析了兩個(gè)基因在3齡幼蟲滯育前、滯育期、滯育后靜息和發(fā)育恢復(fù)后不同階段的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，二者在滯育進(jìn)程中表達(dá)水平均存在顯著差異(P<0.05)。SmJHE在滯育前和滯育期(2016年6-11月)基本恒定，但11月即向滯育后的過度期和靜息階段的早期(12月)表達(dá)量最低，為滯育前的46%～61%，隨后逐漸升高，恢復(fù)發(fā)育后達(dá)到最高，尤其發(fā)育的后期(2017年4月)，表達(dá)水平為滯育前的4.58倍，顯著高于滯育前、滯育期和滯育后靜息期(圖3: A)。

與SmJHE一樣，整個(gè)滯育進(jìn)程中，SmJHEH在2016年11月和滯育后靜息期表達(dá)水平低于其他時(shí)期。不同的是，SmJHEH在翌年1月表達(dá)水平最低，為滯育前的56%，發(fā)育恢復(fù)后表達(dá)量有升高，但隨后又逐漸降低(圖3: B)。

圖3 小麥吸漿蟲滯育前后及滯育期3齡幼蟲中SmJHE (A)和SmJHEH (B)的相對表達(dá)水平Fig. 3 Relative expression levels of SmJHE (A) and SmJHEH (B) in the 3rd instar larvae ofSitodiplosis mosellana at the pre-diapause, diapause and post-diapause quiescence stages圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同字母表示經(jīng)Tukey氏多重比較后差異顯著(P<0.05)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference by Tukey’s multiple range test (P<0.05). 圖4同The same for Fig. 4.

2.4 小麥吸漿蟲不同發(fā)育階段SmJHE和SmJHEH表達(dá)水平分析

由圖4可知，小麥吸漿蟲不同發(fā)育階段SmJHE和SmJHEH表達(dá)水平均存在差異顯著(P<0.05)。SmJHE在1齡到3齡幼蟲早期表達(dá)水平較低且差異不顯著(P>0.05)，發(fā)育到3齡幼蟲后期表達(dá)量顯著升高，預(yù)蛹時(shí)達(dá)到最高，為1齡幼蟲中的8.6倍，化蛹后表達(dá)水平顯著下降，其中中蛹和后蛹中的表達(dá)量顯著低于初蛹期的(P<0.05)；雄成蟲中的表達(dá)水平與中、后蛹中的差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于雌成蟲(P<0.05)(圖4: A)。

與SmJHE不同，整個(gè)發(fā)育過程中，SmJHEH在預(yù)蛹期表達(dá)水平最低，僅為1齡幼蟲中的35%；在雌成蟲中表達(dá)水平為在1齡幼蟲中的1.6倍，顯著高于雄成蟲和其他所有蟲態(tài)的表達(dá)水平(P<0.05)。幼蟲期各階段SmJHEH表達(dá)水平基本恒定，化蛹后表達(dá)水平逐漸升高，但各時(shí)期(初蛹、中蛹和后蛹)的表達(dá)水平差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)(圖4: B)。

圖4 小麥吸漿蟲不同發(fā)育階段SmJHE (A)和SmJHEH (B)的相對表達(dá)水平Fig. 4 Relative expression levels of SmJHE (A) and SmJHEH (B) at different developmental stages of Sitodiplosis mosellanaL1: 1齡幼蟲1st instar larva; EL2: 2齡幼蟲早期Early 2nd instar larva; LL2: 2齡幼蟲后期Late 2nd instar larva; EL3: 3齡幼蟲早期Early 3rd instar larva; LL3: 3齡幼蟲后期Late 3rd instar larva; PP: 預(yù)蛹Prepupa; EP: 初蛹Early pupa; MP: 中蛹Middle pupa; LP: 后蛹Late pupa; FA: 雌成蟲Female adult; MA: 雄成蟲Male adult.

3 討論

JHE和JHEH是在昆蟲生命活動(dòng)中調(diào)控JH滴度的重要降解酶(李勝等, 2004)。本研究克隆得到小麥吸漿蟲SmJHE和SmJHEH基因全長cDNA序列，兩個(gè)基因編碼的蛋白不僅與已報(bào)道的同目長角亞目昆蟲同源蛋白的氨基酸序列一致性較高，親緣關(guān)系最近，而且與已報(bào)道的絕大多數(shù)昆蟲JHE和JHEH一致(圖1和2)，N端包含一個(gè)由18～22個(gè)氨基酸組成的疏水性信號肽序列(徐素平等, 2014; Zhuetal., 2017)。研究表明，昆蟲JHEs包含RF, DQ, GxSxG, E和GxxHxxD/E 5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Kamita and Hammock, 2010)，其中GxSxG和GxxHxxD/E基序中的S和H以及E基序是最保守的，它們被預(yù)測形成催化三聯(lián)體，而RF和DQ基序中的R和D殘基是JHE發(fā)揮作用所必需的(Wardetal., 1992)。本研究結(jié)果顯示SmJHE蛋白包含以上所有特征結(jié)構(gòu)域，表明其在進(jìn)化過程中功能高度保守，即在小麥吸漿蟲體內(nèi)JH的降解代謝中發(fā)揮作用。值得指出的是，SmJHE基因編碼的GxSxG模塊為GASAG，與絕大多數(shù)昆蟲典型序列GQSAG相比第2位氨基酸發(fā)生了突變。類似現(xiàn)象也在西方蜜蜂Apismellifera(Mackertetal., 2008)、煙粉虱Bemisiatabaci(龍楚云等, 2013)、大猿葉甲Colaphellusbowringi(Zhuetal., 2017)等其他昆蟲JHEs中發(fā)現(xiàn)。Mackert等(2008)認(rèn)為保守結(jié)構(gòu)域的突變可能代表激素信號通路的調(diào)整，說明JHE在不同昆蟲體內(nèi)的作用途徑可能存在差異。盡管大多數(shù)昆蟲JHEHs組成催化三聯(lián)體和陰氧離子洞的氨基酸殘基高度保守(Zhangetal., 2005; Mackertetal., 2010)，但小麥吸漿蟲SmJHEH中構(gòu)成催化三聯(lián)體的氨基酸發(fā)生了小的變異，即SmJHEH中構(gòu)成催化三聯(lián)體的Asp在多數(shù)昆蟲中為Glu。類似現(xiàn)象也在赤擬谷盜T.castaneum、馬鈴薯甲蟲L.decemlineata等JHE中發(fā)現(xiàn)，而且在赤擬谷盜JHE中也證明Glu突變?yōu)锳sp后同樣具有高效降解JH的能力(Tsubotaetal., 2010; Lüetal., 2015)，據(jù)此推測SmJHEH也具有該功能。

前期研究表明，JH在小麥吸漿蟲滯育誘導(dǎo)及滯育和滯育后靜息狀態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用(Chengetal., 2020)，據(jù)此推測，如果代謝途徑在小麥吸漿蟲滯育誘導(dǎo)期間JH滴度的調(diào)控中起主導(dǎo)作用，SmJHE和SmJHEH在滯育前的3齡早期幼蟲中的表達(dá)量應(yīng)低于在2齡幼蟲中的，且進(jìn)入滯育后維持較低水平。事實(shí)上，黃斑星天牛Psacotheahilaris幼蟲進(jìn)入滯育后JHE活性顯著降低且在滯育期間維持較低水平(Munyiri and Ishikawa, 2004)。然而與預(yù)期不同，SmJHE和SmJHEH在3齡早期幼蟲中的表達(dá)量與1和2齡幼蟲中的差異不顯著，且進(jìn)入滯育后至10月的滯育維持期間一直維持平穩(wěn)水平；而JH合成途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因SmHMGR在滯育誘導(dǎo)和維持中表達(dá)變化與JH滴度及其信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因SmMet和SmKr-h1(李英梅等, 2006; 劉禹含等, 2019; Chengetal., 2020)完全一致。因此認(rèn)為，是JH合成而不是降解途徑對麥紅吸漿蟲滯育誘導(dǎo)過程中JH滴度起主要調(diào)節(jié)作用。類似結(jié)果也在蛀莖夜蛾Sesamianonagrioides(Schafellneretal., 2008)和大猿葉甲C.bowringi(Zhuetal., 2017)滯育研究中發(fā)現(xiàn)。有趣的是，小麥吸漿蟲滯育后靜息階段的當(dāng)年12月至翌年1月，SmJHE和SmJHEH的表達(dá)水平均為滯育進(jìn)程中的最低，而此時(shí)JH滴度達(dá)到最高(李英梅等, 2006; Chengetal., 2020)，說明二者表達(dá)水平的降低利于JH的累積，從而使蟲體維持靜息狀態(tài)。

眾所周知，全變態(tài)類昆蟲末齡幼蟲JH滴度顯著降低、蛻皮激素(molting hormone, MH)滴度急劇升高時(shí)引起變態(tài)(Bhaskaranetal., 1986; Kinjohetal., 2007; Ureaetal., 2016; Kayukawaetal., 2017)，而在此過程中JH降解酶扮演著重要角色。例如，黃斑星天牛P.hilaris5齡幼蟲變態(tài)發(fā)育過程中JHE活性與JH滴度變化呈明顯的負(fù)相關(guān)，化蛹前JH滴度降到最低而JHE活性達(dá)到最高(Munyiri and Ishikawa, 2004)；苜蓿夜蛾HeliothisdipsaceaJHE在預(yù)蛹中的表達(dá)量顯著高于其他階段(張歡等, 2015)；家蠶JHE基因敲除后末齡幼蟲期延長，化蛹推遲(Zhangetal., 2017)。本研究中，小麥吸漿蟲3齡后期SmJHE表達(dá)量逐漸升高，預(yù)蛹期達(dá)到最高(圖4: A)，而此時(shí)MH滴度顯著升高，JH信號傳導(dǎo)相關(guān)基因SmMet和SmKr-h1表達(dá)量明顯降低(成衛(wèi)寧等, 2009; Chengetal., 2020)，說明高水平的SmJHE表達(dá)刺激酶活性提高，促進(jìn)JH降解，利于幼蟲到蛹的變態(tài)。然而與SmJHE不同，SmJHEH在預(yù)蛹期的表達(dá)量反而降到最低(圖4: B)，說明在幼蟲變態(tài)過程中，該酶對JH的降解貢獻(xiàn)不大。

有研究表明，JH對昆蟲生殖活動(dòng)的調(diào)控與JHE有關(guān)。例如,煙粉虱B.tabaci和西方蜜蜂A.mellifera生活史中卵黃原蛋白基因和JHE基因表達(dá)水平一致，二者均與JH滴度呈負(fù)相關(guān)(Mackertetal., 2008; 龍楚云等, 2013)。本研究中SmJHE在雌成蟲中表達(dá)量顯著低于雄成蟲，與JH信號傳導(dǎo)相關(guān)基因SmMet和SmKr-h1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Chengetal., 2020)，據(jù)此推測該基因可能參與小麥吸漿蟲生殖力的調(diào)控。

綜上所述，SmJHE和SmJHEH參與小麥吸漿蟲的滯育調(diào)控，二者在滯育進(jìn)程中表達(dá)量的降低為滯育后靜息階段JH的累計(jì)提供了保障；SmJHE在發(fā)育過程中表達(dá)量的升高可能參與了幼蟲到蛹的變態(tài)，在雌成蟲中表達(dá)量低于雄成蟲可能與JH調(diào)控的生殖發(fā)育有關(guān)。這說明SmJHE不僅在小麥吸漿蟲滯育后靜息狀態(tài)維持，而且在其變態(tài)發(fā)育和生殖中均發(fā)揮作用。