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    加味身痛逐瘀湯調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治作用*

    2020-06-10 05:05:00韓鵬勃姚亞波
    陜西中醫(yī) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:身痛戊酸骨質(zhì)疏松癥

    韓鵬勃,蔣 鋒,劉 柱,姚亞波

    1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(西安 710038);2.陜西省友誼醫(yī)院(西安 710068)

    骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病變,多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性,主要表現(xiàn)為低骨量、骨微結(jié)構(gòu)破壞,是導(dǎo)致骨脆性增加、強(qiáng)度降低,易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病[1]。近年來(lái),我國(guó)人口老齡化進(jìn)程加速,OP發(fā)病率、致殘率和死亡風(fēng)險(xiǎn)逐年增高,給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。因此,積極防治OP現(xiàn)已成為醫(yī)療關(guān)注的重點(diǎn)之一。中醫(yī)藥治療在我國(guó)已有悠久的歷史,具有辨證論治、防重于治、療效佳、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),安全性及可行性較高[3]。據(jù)報(bào)道,加味身痛逐瘀湯在骨質(zhì)疏松癥的治療中具有良好的臨床療效,可明顯減輕患者癥狀[4-6],但其在OP防治中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。現(xiàn)根據(jù)既往研究報(bào)道,骨代謝過(guò)程涉及信號(hào)傳導(dǎo)通路、遺傳基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控及激素等,其中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨發(fā)育、骨形成及骨代謝等生理過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7];Wnt通路可通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖及分化進(jìn)而增加骨量,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡[8]。且研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與骨質(zhì)疏松的發(fā)生及緩解密切相關(guān),其異常表達(dá)會(huì)造成骨形成障礙,進(jìn)而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[9]?;诖?,本研究通過(guò)建立去卵巢大鼠模型作為骨質(zhì)疏松癥研究對(duì)象,給予加味身痛逐瘀湯進(jìn)行灌腸干預(yù),通過(guò)觀察其骨密度變化、股骨病理形態(tài)改變及股骨組織中 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化,探究加味身痛逐瘀湯對(duì)OP的防治作用機(jī)制,以期為OP的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和參考。

    材料與方法

    1 材 料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取60只成年健康雌性SD大鼠,SPF級(jí),平均體質(zhì)量(245±25) g,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.2 藥物:加味身痛逐瘀處方組成,當(dāng)歸 、茯苓、川牛膝各20 g,秦艽、紅花、川芎、桃仁、地龍各10 g,香附、羌活、五靈脂、蒼術(shù)、杜仲、白芍各15 g,黃芪、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)各30 g,甘草5 g。所有藥材均購(gòu)自西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,常規(guī)水煎。大鼠給藥劑量換算方法參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》,大鼠等效劑量按照成人劑量的6.3倍計(jì)算,給藥容積0.5 ml/100g,加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量分別為 32、16、8 g /kg。

    水合氯醛購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,戊酸雌二醇片購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,青霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司,Wnt 、β-catenin和β-actin抗體購(gòu)自Gene Tex,Wnt1和cyclin D1抗體購(gòu)自 Abcam。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 模型的建立:采用摘除雙側(cè)卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥大鼠動(dòng)物模型。給予實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒M大鼠40 g/L水合氯醛(3 μg/g體質(zhì)量),左側(cè)腹腔肌肉注射麻醉,俯臥位固定,于腰背部脊柱兩側(cè)作縱行切口充分暴露卵巢組織,后結(jié)扎完整摘除兩側(cè)卵巢組織,縫合切口。假手術(shù)組同上暴露卵巢但不予以摘除,造模術(shù)后均給予青霉素防感染。

    2.2 分組及給藥:實(shí)驗(yàn)大鼠按體重隨機(jī)分為6組,分別為假手術(shù)組,模型對(duì)照組,戊酸雌二醇組,加味身痛逐瘀湯高劑量組、中劑量組和低劑量組各10只。于造模成功后2個(gè)月給藥,假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃;戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片(0.09 μg/g 體質(zhì)量);加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量組分別給予32、16、8 g/kg 體質(zhì)量湯劑。各組均于上午 9:00 準(zhǔn)時(shí)灌胃給藥,1 d/1次,連續(xù)2個(gè)月。

    2.3 取材:各組大鼠末次給藥灌胃后禁食24 h,稱重給予水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,取大鼠腹主動(dòng)脈血液,離心取血清備用。處死各組動(dòng)物,剝離肌肉、結(jié)締組織,取大鼠左右側(cè)股骨經(jīng)生理鹽水沖洗,錫紙包裹,-80 ℃凍存,以供后續(xù)檢測(cè)。左側(cè)股骨做 HE 染色,用于組織病理形態(tài)的觀察,右側(cè)股骨做Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)的測(cè)定。

    2.4 骨密度測(cè)定:采用美國(guó)NORLAND雙能 X 線骨密度儀測(cè)量各組大鼠左右肢股骨骨密度,掃描速度70 mm/s,掃描寬度15 cm,以單位面積內(nèi)骨礦物質(zhì)含量(g /cm2) 表示,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。

    2.5 股骨組織病理形態(tài)改變:取各組大鼠左股骨組織標(biāo)本,多聚甲醛固定液固定,10% EDTA(pH 7.4)溶液脫鈣,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋5 μm切片;60 ℃烤片,行股骨石蠟切片常規(guī) HE染色,中性樹(shù)膠封片,于倒置顯微鏡下觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài),拍照記錄。

    2.6 股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定:取各組大鼠右股骨組織標(biāo)本,液氮研磨破碎,加入RIPA 裂解液提取總RNA,測(cè)定其濃度。取80 μg變性蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至NC膜,5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h,加入一抗 Wnt(1∶1000)、Wnt1(1∶1000)、β-catenin(1∶2000)、cyclin D1(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗滌3次,加入相應(yīng)二抗,室溫孵育 1 h, ECL顯色,使用Azurec500化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照記錄。使用 Image-J 圖像分析軟件分析各目標(biāo)條帶灰度值,以 β-actin 為內(nèi)參,進(jìn)行半定量結(jié)果分析。

    結(jié) 果

    1 各組大鼠骨密度檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 對(duì)比顯示,模型對(duì)照組大鼠股骨骨密度值較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05);與模型對(duì)照組相比,戊酸雌二醇組、加味身痛逐瘀湯高劑量組、中劑量組和低劑量組股骨骨密度值均顯著升高(P<0.05),但程度不一,戊酸雌二醇組升高較明顯,加味身痛逐瘀湯高劑量組其次。見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠骨密度值比較(g /cm2)

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型對(duì)照組比較,#P<0.05

    2 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)對(duì)比 光鏡下,假手術(shù)組大鼠骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰、排列有序,基本結(jié)構(gòu)正常;模型對(duì)照組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)明顯異常,表現(xiàn)為骨小梁斷裂、不完整、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失;加味身痛逐瘀湯低、中劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯斷裂。較模型對(duì)照組相比,戊酸雌二醇組和加味身痛逐瘀湯高劑量組骨小梁病理變化明顯改善,骨小梁結(jié)構(gòu)排列較規(guī)則有序,接近正常(圖 1)。

    圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)(HE染色,×20)

    3 各組大鼠股骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)比 研究為明確各組大鼠股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)情況,故采用Western blot法對(duì)各組相關(guān)蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)表2。模型對(duì)照組大鼠股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)含量較假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05);戊酸雌二醇組、加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量組股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)含量均較模型對(duì)照組顯著升高(P<0.05),且加味身痛逐瘀湯高劑量組蛋白表達(dá)量升高最為顯著(圖2)。

    表2 各組大鼠骨股組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型對(duì)照組比較,#P<0.05

    注:1假手術(shù)組;2模型對(duì)照組;3戊酸雌二醇組;4加味身痛逐瘀湯高劑量組; 5加味身痛逐瘀湯中劑量組;6加味身痛逐瘀湯低劑量組

    圖2 各組大鼠股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

    討 論

    OP是由多種因素引起的以低骨量、骨微結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕卣鞯某R?jiàn)骨代謝性疾病,一般分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類,多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性和老年男性,其導(dǎo)致的骨強(qiáng)度減弱、易骨折等嚴(yán)重影響中老年人群的生活質(zhì)量,現(xiàn)已受到醫(yī)學(xué)界重視,并將其列為三大老年病之一[10]。資料顯示[11-13],骨代謝過(guò)程中骨形成和骨代謝偶聯(lián)失衡,致使骨密度降低是OP的基本發(fā)病機(jī)制;且認(rèn)為OP與機(jī)體內(nèi)分泌紊亂、降鈣素缺失及甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素和糖皮質(zhì)激素等分泌異常密切相關(guān)。目前,臨床采用有效的藥物治療如雌激素代替療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素及抑制骨吸收藥和促進(jìn)骨形成藥等阻止、治療OP,患者病情暫時(shí)得到緩解,但普遍存在依從性差、藥物過(guò)敏等副作用,多數(shù)患者仍遭受病痛的折磨[14]。近年來(lái),中醫(yī)藥在OP治療臨床和實(shí)驗(yàn)中取得了較好成效,其辨證論治、防重于治,在提高療效的同時(shí)藥物毒副作用小,且具有較高安全性及可行性。因此,探尋有效的OP中醫(yī)藥方劑及機(jī)制,具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

    中醫(yī)理論認(rèn)為,根據(jù)臨床特征及發(fā)病特點(diǎn)可將OP歸屬于“骨枯”、“骨痹”、“骨痿”等范疇,并認(rèn)為腎精虧虛是OP的主要病因[15]。據(jù)《醫(yī)經(jīng)精義》記載:“腎藏精,精生髓,髓生骨,故骨者腎之合也”。脾腎虧虛為本,血瘀為要,“虛”、“瘀”相互影響、互為因果。脾腎兩虛導(dǎo)致整體機(jī)能減退,氣不能行血,出現(xiàn)瘀阻脈絡(luò),“不通則痛”,故臨床上OP患者大多以腰背疼痛就診。而脈絡(luò)瘀阻,精微氣血不暢,導(dǎo)致脾腎虧虛,骨失所養(yǎng),生髓乏源,進(jìn)而加速OP發(fā)生。因此,臨床上對(duì)OP的治療主要以活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)骨為原則,且臨床試驗(yàn)表明,補(bǔ)腎中藥可增強(qiáng)骨細(xì)胞活性,調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡,促進(jìn)骨中礦物質(zhì)沉積,進(jìn)而阻抗OP發(fā)生。加味身痛逐瘀湯為王清任創(chuàng)制的名方[16],方中川芎、桃仁、當(dāng)歸、紅花等活血化瘀,可降低血液黏稠度,改善血管微循環(huán)和通透性,促進(jìn)修復(fù)及再生;五靈脂、香附等活血行氣,疏肝解郁,抗炎,散瘀止痛;羌活、秦艽等解熱鎮(zhèn)痛,祛風(fēng)濕,舒經(jīng)脈;川牛膝、杜仲等活血通經(jīng),補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)筋骨;地龍舒筋利血脈,黃芪補(bǔ)中益氣,茯苓利水消腫;甘草調(diào)和諸藥,共為佐使,同時(shí)配以續(xù)斷、骨碎補(bǔ)活血續(xù)筋、補(bǔ)腎強(qiáng)骨。全方共奏活血化瘀、通痹止痛、補(bǔ)腎之功效。袁菱梅等研究發(fā)現(xiàn)[4],電針結(jié)合加味身痛逐瘀湯,可明顯緩解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的癥狀,提高患者的生活質(zhì)量。陳魯峰等[6]在老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的臨床中藥治療中發(fā)現(xiàn)加味身痛逐瘀湯能明顯改善臨床療效,提高患者骨密度。此外,現(xiàn)代藥理研究表明[17],方中骨碎補(bǔ)能提高堿性磷酸酶活性,抑制破骨細(xì)胞骨吸收,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,利于骨鹽和骨鈣化的形成,增加骨密度。同時(shí)中藥能夠調(diào)控骨生長(zhǎng)因子,提高骨磷、骨鈣、骨膠原含量,通過(guò)增加骨密度進(jìn)而改善骨生物力學(xué)性能,利于骨折愈合[18]。因此本課題通過(guò)切除大鼠雙側(cè)卵巢構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型,研究加味身痛逐瘀湯對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果,結(jié)果顯示,去卵巢后大鼠BMD 下降,骨微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞呈現(xiàn)出明顯的 OP 癥狀,表明去除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型成功。而加味身痛逐瘀湯干預(yù)去卵巢大鼠 4 周后,能明顯升高其骨密度,抑制骨微結(jié)構(gòu)的破壞,表明加味身痛逐瘀湯對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療效果,戊酸雌二醇組和高劑量加味身痛逐瘀湯的防治效果最佳,但臨床上患者可能對(duì)西藥過(guò)敏及其他副作用導(dǎo)致效果不佳,而加味身痛逐瘀湯能有效緩解骨質(zhì)疏松癥,且因其沒(méi)有藥物副作用,在臨床上可廣泛應(yīng)用。

    據(jù)國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道,成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖分化受Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控,在OP中發(fā)揮重要作用。近年來(lái),有關(guān)骨代謝的研究中Wnt/β-catenin通路較為深入,認(rèn)為該通路在骨代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。韓學(xué)明等[19]研究發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)β-catenin的表達(dá)量明顯低于正常老年女性,表明Wnt/β-catenin通路可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。沈霖等[20]利用具有補(bǔ)腎滋陰功效的青蛾丸治療 80 例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者,發(fā)現(xiàn)青娥丸能夠維持絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨密度,其部分療效機(jī)制與其可增強(qiáng)患者β-catenin表達(dá)和抑制DKK-1水平有關(guān)。成鵬等[21]在去卵巢大鼠的OP癥中研究發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷能夠有效緩解氧化應(yīng)激介導(dǎo)的OP,可能與其調(diào)控Wnt2/β-catenin 通路,降低骨代謝水平,減少骨吸收作用相關(guān)。Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1等蛋白是調(diào)控 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵因子,其高表達(dá)表明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活。本研究測(cè)定了大鼠股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加味身痛逐瘀湯干預(yù)去卵巢大鼠后促進(jìn)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性,由此可以推斷加味身痛逐瘀湯可能通過(guò)正向調(diào)控 Wnt/β -catenin 信號(hào)通路,提高骨密度,改善骨組織形態(tài),對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有治療效果。

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