陽和化巖湯對乳腺癌癌前病變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Bcl-2、細(xì)胞色素C表達(dá)影響的機(jī)制研究*

史文嫻，劉曉菲，李斐斐，王曉娜，孫 穎

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)(濟(jì)南 250335)；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心)(濟(jì)南250335)；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(濟(jì)南 250335)

乳腺癌是發(fā)生于乳房的惡性腫瘤，目前臨床上已經(jīng)成為女性最常見的惡性腫瘤之一，對女性的生活質(zhì)量和生命健康帶來嚴(yán)重的威脅。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳腺癌癌前病變是其癌變過程之必經(jīng)環(huán)節(jié)，是可以逆轉(zhuǎn)和阻斷的，所以發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，對患者的個(gè)體化治療,逆轉(zhuǎn)或阻斷這一環(huán)節(jié),對乳腺癌二級預(yù)防、降低乳腺癌發(fā)病率具有重要意義[1-2]。乳腺惡性腫瘤中最能有效提高生存率、降低死亡率的重要方法是二級預(yù)防，臨床上早期乳腺癌的發(fā)現(xiàn)率僅25%[3]，中醫(yī)逐漸成為乳腺癌治療的方法，整體觀念和辨證論治思想指導(dǎo)用藥，具有很大的發(fā)展?jié)摿4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，以Bcl-2蛋白家族的表達(dá)和調(diào)控對腫瘤細(xì)胞凋亡具有較大的影響[5]，細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)在細(xì)胞凋亡和炎癥中發(fā)揮著積極作用[6]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)采用中藥陽和化巖湯與三苯氧胺相比，研究其對乳腺癌癌前病變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Bcl-2、細(xì)胞色素C蛋白及基因表達(dá)的影響。

材料與方法

1 材 料

1.1 細(xì)胞系來源：乳腺癌癌前病變細(xì)胞為MCF-10AT細(xì)胞，由陳紅風(fēng)主任(上海龍華醫(yī)院)惠贈。

1.2 藥物與試劑：DMEM/F-12培養(yǎng)基，RNA提取試劑盒(Trizol)、胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、RNA酶、驢抗兔IgG，化學(xué)發(fā)光劑、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、ECL發(fā)光劑、蛋白酶抑制劑、蛋白上樣緩沖液、胎牛血清(FBS)、碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、Western及IP細(xì)胞裂解液，細(xì)胞色素C、Bcl-2一抗，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物科技公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)，RT-PCR所有引物(Invitrogen公司)，及其余常規(guī)生化試劑。

1.3 儀器：BB16uv/BB5060uv CO2培養(yǎng)箱、Axiovert 40倒置相差顯微鏡、Elx50型洗板機(jī)、ELx808全自動酶標(biāo)儀、Sgavplus型超純水系統(tǒng)、水平電泳槽、ClassⅡ2085型超凈工作臺、LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀、DT5-3型低速自動平衡離心機(jī)、ME235P電子分析天平、梅特勒-托利多DELTA320型pH計(jì)、Veriti 96孔型梯度PCR儀、FACSCalibur 流式細(xì)胞儀，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)、冷凍超速離心機(jī)、CA-1390-1超凈工作臺(上凈公司)、CM1900型冰凍切片機(jī)(LEICA公司)、一次性平皿、凝膠成像儀、石蠟包埋機(jī)、天能凝膠成像分析系統(tǒng)、顯影機(jī)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中藥制備：陽和化巖湯組由鹿角霜、山慈菇、莪術(shù)、白花蛇舌草各12 g，淫羊藿、三棱、浙貝、半夏各9 g組成。制劑：將10倍量的水加入上述中藥方，6 h內(nèi)提取收集其揮發(fā)油，保存、備用；提取揮發(fā)油后的藥液濾過，濃縮至1∶1.5(藥材：中藥藥液)，加入適量乙醇，使乙醇含量達(dá)到60%，靜置24 h后，將上清液分離，離心中藥液沉淀，減壓、回收，乙醇濃縮，將相對密度濃縮至1.18(60℃)，備用。將揮發(fā)油加入上述藥物提取液中混勻，倒入提取液中，攪拌均勻，另倒入梨酸、山蔗糖調(diào)節(jié)pH值，并加水將其濃度調(diào)整到0.84 g/ml。采用上述方法制備各拆方組，溫陽組(鹿角霜、淫羊藿各12 g)0.21 g/ml、活血組(三棱9 g、莪術(shù)12 g)0.21 g/ml、化痰組(半夏、浙貝各9 g)0.18 g/ml、解毒組(白花蛇舌草、山慈菇各12 g)0.27 g/ml。三苯氧胺(TAM)制備：溶于生理鹽水，濃度為0.03 mg/ml。對照組不加任何處理因素。

2.2 腸吸收液制備：禁食12 h的大鼠斷頸椎處死，迅速剖開腹腔取出小腸，自回盲瓣向上5 cm處向上取14 cm小腸段，將腸內(nèi)容物完全取出，在TYRODE液中沖洗腸管，并翻轉(zhuǎn)腸管，結(jié)扎成囊狀，將前處理中藥液預(yù)先加入麥?zhǔn)显」苤?，通?5%的O2和5%的CO2,37 ℃恒溫，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別在15、30、45、60、90、120 min取樣200 μl，同時(shí)補(bǔ)充等體積TYRODE,-20℃保存待用。用氮?dú)獯蹈汕疤幚硭藐柡突瘞r湯腸吸收液，將1 ml的80%的甲醇加入中藥液復(fù)浴，超聲3 min，渦旋30 s。0.2 μg濾膜過濾。把腸吸收液混勻后，用無菌濾膜濾過除菌，所得樣品分裝于無菌EP管，-20℃保存待用。

2.3 Western blot法檢測Bcl-2、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)：檢測陽和化巖湯組、溫陽組、活血組、化痰組、解毒組、三苯氧胺組及空白對照組處理乳腺癌癌前病變MCF-10AT細(xì)胞株72 h，收集細(xì)胞，用冷PBS反復(fù)洗滌2次，加入 200 μl 預(yù)冷裂解緩沖液，混勻、冰浴，時(shí)間為30 min，30 min后進(jìn)行離心，取上清液，加水稀釋，至濃度為50 μg /ml，取等量70 μg /泳道的蛋白，電泳條件：濃縮膠恒壓60 V，時(shí)間20 min，分離膠恒壓80 V ，時(shí)間80 min。電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，取脫脂奶粉(濃度為5%)將其封閉，時(shí)間1 h，劑量0.1 ml/cm2，另加入適量一抗及封閉液， Bcl-2：細(xì)胞色素C的稀釋比例為1∶400。搖蕩孵育，溫度4℃下過夜。用PBST漂洗過的PVDF膜和與HRP 結(jié)合稀釋比例1∶5000的二抗，搖蕩孵育，溫度：室溫，時(shí)間： 1～2 h， PBST 充分洗膜。顯影液(0.1 ml/cm2)計(jì)算用量， PVDF 膜上加顯影液，顯影并洗像。調(diào)整時(shí)間使其曝光，直至出現(xiàn)最佳條帶。

2.4 RT- PCR法檢測Bcl-2、細(xì)胞色素CmRNA表達(dá)：將細(xì)胞分別用液氮研磨粉碎后放入離心管中,Trizol法提取總RNA,每只總RNA 量為2 μ,內(nèi)參照為擴(kuò)增GAPDH,每個(gè)標(biāo)本至少重復(fù)3遍。引物序列:COX-2長度為253 bp,上游:5’-AGCAGCCATTCATCAACACT-3’,下游:5’-GGCAGCTGGAACTCAATGTA-3,內(nèi)參長度為286 bp,上游:5’-GCCAGATCATCATCAGCAAT-3’,下游:5’-AGGACGTCCACTGACACCTT-3’，VEGFC長度為164bbp,上游:5’-CGGGCTGTGGATCCTGGATGACCGCC-3’，下游:5’-GGAATTCAGCTCCATTGACTTCTTGG-3’;VEGFR-3長度為189 bp,上游:5’-ACCGGAGCTAAACAAGGATG-3’,下游:5’-TGGTGGTGGAACTTCTTTCC-3’;恒溫70 ℃，加熱時(shí)間為5 min，2 min迅速冷卻，42 ℃溫浴60 min，然后升高溫度至95 ℃，加熱時(shí)間為5 min，以終止反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，94 ℃條件下加熱3 min進(jìn)行預(yù)變性，然后開始循環(huán)操作：溫度94 ℃，時(shí)間45 s，溫度52 ℃，時(shí)間60 s，溫度72 ℃，時(shí)間60 s，共循環(huán)操作30次,最后溫度72 ℃延伸，時(shí)長7 min。取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳分離終止后，用Band Scan 4.3版圖像分析軟件分析，取電泳條帶的光密度值與內(nèi)參照GAPDH光密度值的比值，作為目標(biāo)基因的相對光表達(dá)量。

結(jié) 果

1 Bcl-2、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比率 與空白組比較，各組Bcl-2蛋白表達(dá)比率均下降，陽和化巖湯組、活血組、化痰組、三苯氧胺組比率下降(P<0.05)；與三苯氧胺組比較，陽和化巖湯組(P>0.05)。見表1。

表1 Western blot法檢測Bcl-2蛋白表達(dá)比率

與空白組相比，各組細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比率均下降，陽和化巖湯組、三苯氧胺組(P<0.05)；陽和化巖湯組、三苯氧胺組組間比較(P>0.05)。見表2。

表2 Western blot法檢測細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比率

空白對照組Bcl-2 mRNA表達(dá)量最高，與空白對照組相比，各組Bcl-2 mRNA表達(dá)量呈明顯下降趨勢?？瞻讓φ战M細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)量最低，與空白對照組相比，各組細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)量呈明顯上升趨勢(圖1)。

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

2 Bcl-2 mRNA表達(dá) 見表3(圖2)?？瞻讓φ战MBcl-2 mRNA表達(dá)量最高，三苯氧胺組、陽和化巖湯組、解毒組Bcl-2 mRNA表達(dá)量呈明顯下降趨勢，尤其陽和化巖湯組Bcl-2 mRNA表達(dá)量下降明顯，與三苯氧胺組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)?？瞻讓φ战MBcl-2 mRNA表達(dá)量最高，三苯氧胺組、陽和化巖湯組、解毒組Bcl-2mRNA表達(dá)量呈明顯下降趨勢。

表3 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達(dá)量

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

圖2 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達(dá)

3 RT-PCR檢測細(xì)胞色素C mRNA表達(dá) 陽和化巖湯組、三苯氧胺組細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)比率高于空白對照組，與三苯氧胺組比較陽和化巖湯組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均可抑制細(xì)胞增殖。其余4個(gè)中藥拆方組細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)比率有增高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示三苯氧胺組、陽和化巖湯組均促進(jìn)細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)增高， mRNA表達(dá)比率增高，基因有擴(kuò)增，提示三苯氧胺組、陽和化巖湯組在細(xì)胞凋亡早期可有效促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子細(xì)胞色素C，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見表4?？瞻讓φ战M細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)量最低，三苯氧胺組、陽和化巖湯組細(xì)胞色素CmRNA表達(dá)量均有升高趨勢(圖3)。

表4 RT-PCR檢測細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)量

注：與空白對照組相比，△P<0.05

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

圖3 RT-PCR檢測細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)量

討 論

本病中醫(yī)學(xué)中稱為“乳巖”，乳巖主要病機(jī)為六淫內(nèi)侵，肝脾氣郁，沖任不和，臟腑功能失調(diào)，以致氣滯、血瘀、痰凝、邪毒結(jié)于乳腺，則表現(xiàn)為乳腺癌。本實(shí)驗(yàn)采用陽和化巖湯進(jìn)行研究，陽和化巖湯出自《外科醫(yī)鏡》，方中所含多種中藥具有抗腫瘤作用，鹿角霜溫補(bǔ)腎陽腎精、收斂止血，實(shí)驗(yàn)研究示，鹿角霜能通過刺激血液中T淋巴細(xì)胞的增殖抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞生長[7]，鹿角霜還有活血化瘀之效，有利于改善乳腺癌血液高凝狀態(tài)，肉桂補(bǔ)火助陽散寒、益脾除積，肉桂中含有的肉桂醛能參與細(xì)胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡[8]，淫羊藿、鹿角霜溫補(bǔ)少陰，兩者均富含雄激素，既可以補(bǔ)充雄激素又能拮抗雌激素，淫羊藿主要通過降低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化、改變腫瘤細(xì)胞周期分布等[9]，浙貝母化痰散結(jié)，排癰消腫，浙貝片聯(lián)合化療提高腫瘤抑制率的機(jī)制可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑，增加耐藥性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性，從而起到逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用[10]，莪術(shù)破瘀止痛、行氣解郁，莪術(shù)油具有明顯的抗腫瘤作用，許政旭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油可通過下調(diào)死亡因子及其受體通路，導(dǎo)致相關(guān)癌基因的表達(dá)下調(diào)，增強(qiáng)免疫作用，使癌細(xì)胞凋亡，莪術(shù)、三棱均有破血行氣,消積止痛的作用，李學(xué)臣等[12]研究發(fā)現(xiàn)三棱水的提取物能夠抑制小鼠腫瘤細(xì)胞生長，山慈菇清熱解毒，化痰散結(jié)，山慈菇提取物對小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用和促凋亡作用[13]，白花蛇舌草清熱解毒，其中的萜類化合物可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因、抗氧化作用等抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]，甘草有調(diào)和諸藥之效[15]。全方共奏活血祛瘀與溫腎助陽之功，攻補(bǔ)兼施，溫陽化痰法對延長乳腺癌患者的生存期有至關(guān)重要的療效，溫陽化痰法能起到減毒增效的作用，既能減緩乳腺癌細(xì)胞增殖，又能調(diào)節(jié)信號通路，抑制乳腺癌的癌變進(jìn)程[16]，陽和化巖湯可抑制乳腺癌癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)乳腺癌癌細(xì)胞的凋亡[17]。

他莫昔芬是絕經(jīng)前激素受體陽性乳腺癌輔助內(nèi)分泌治療的標(biāo)準(zhǔn)藥物，是合成的抗雌激素藥物，具有抗雌激素、弱雌激素的雙重作用，競爭性的結(jié)合靶細(xì)胞ER，降低細(xì)胞內(nèi)ER含量，抑制腫瘤細(xì)胞的生長代謝，有效降低乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和病死率[18]，對雌激素受體陽性的患者效果好。此外，它還可以通過阻斷因雌激素引起的乳腺管及管周纖維組織增生，幫助增生的乳腺組織恢復(fù)正常的水平[19]。

抑制細(xì)胞生長的主要途徑是細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞凋亡的反應(yīng)分兩大類，包括內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑。Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用的癌基因之一。Bcl-2主要分布在線粒體外膜表面，可以保護(hù)線粒體的完整性，進(jìn)而阻止相關(guān)活化因子(如CytC)的釋放，從而阻斷凋亡信號，減輕細(xì)胞損傷。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較多時(shí)，與Bax形成大量異源二聚體，抑制Bax活性，使細(xì)胞凋亡減緩受阻，抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程，在機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)中起著重要的作用，在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿細(xì)胞是凋亡程序關(guān)鍵的一步，研究表明，線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔孔徑可以在凋亡刺激信號作用下增大，破壞線粒體的外膜，細(xì)胞色素C蛋白從線粒體內(nèi)釋放到胞質(zhì)當(dāng)中，形成凋亡復(fù)合體，使DNA修復(fù)酶活性受到抑制，細(xì)胞核的內(nèi)切酶被激活，進(jìn)而切割DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，陽和化巖湯可明顯降低Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)，激活細(xì)胞色素C，加速癌細(xì)胞的凋亡及阻斷相關(guān)通路活化，進(jìn)而抑制癌變進(jìn)程。