齊墩果酸對人卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制研究

杜貴強 張永莉 胡孝輝

中圖分類號 R285 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1190-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.07

摘 要 目的：探討齊墩果酸抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用及其機制。方法：采用CCK-8法檢測不同濃度齊墩果酸（10、20、40、60、80、100 μmol/L）作用12、24、36、48 h對卵巢癌SKOV3細胞增殖能力的影響;采用Transwell實驗觀察低、高劑量齊墩果酸（20、40 μmol/L）作用24 h對SKOV3細胞遷移及侵襲能力的影響;采用Western Blotting法檢測低、高劑量齊墩果酸對SKOV3細胞中核因子κB p65 （NF-κB p65）、肝再生磷酸酶3（PRL-3）、腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細胞介素6 （IL-6）、上皮鈣黏著蛋白E （E-cadherin）等蛋白表達的影響;運用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)和NF-κB p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，采用Western blotting法和實時熒光定量PCR考察低、高劑量齊墩果酸對NF-κB/PRL-3通路相關(guān)蛋白及其mRNA表達的影響。結(jié)果：隨著齊墩果酸給藥濃度的增加和作用時間的延長，SKOV3細胞的增殖能力有隨之降低的趨勢，各劑量組的細胞存活率均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01）。低、高劑量的齊墩果酸組的遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01），且其NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達量均顯著降低，E-cadherin蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)LPS刺激后，LPS模型組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6 蛋白及其mRNA的相對表達量較對照組顯著升高，E-cadherin 蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;低、高劑量齊墩果酸組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6 蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著降低，E-cadherin 蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。在NF-κB p65過表達SKOV3細胞中，低、高劑量齊墩果酸同樣能夠顯著下調(diào)NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白的表達，顯著上調(diào)E-cadherin 蛋白的表達（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：齊墩果酸能夠通過調(diào)控NF-κB/PRL-3信號通路來抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞 齊墩果酸;卵巢癌;SKOV3細胞;增殖;侵襲;轉(zhuǎn)移;核因子κB;肝再生磷酸酶3

Study on the Effects of Oleanolic Acid on the Proliferation， Invasion and Metastasis of Human Ovarian Cancer SKOV3 Cells and Its Mechanism

DU Guiqiang，ZHANG Yongli，HU Xiaohui（Dept. of Gynecology， the First Affiliated Maternal and Infant Hospital of Tongji University， Shanghai 200126， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects and mechanism of oleanolic acid on inhibiting the proliferation， invasion and metastasis of human ovarian cancer SKOV3 cells. METHODS： CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations of oleanolic acid （10， 20， 40， 60， 80， 100 μmol/L） on the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells at 12， 24， 36 and 48 h. The effects of low-dose and high-dose of oleanolic acid （20， 40 μmol/L） on the metastasis and invasion ability of SKOV3 cells for 24 h were observed in Transwell assay. Western blotting assay was used to detect the effects of low-dose and high-dose of oleanolic acid on the protein expression of NF-κB p65， PRL-3，TNF-α， IL-6 and E-cadherin in SKOV3 cells. Through LPS induction and NF-κB p65 plasmid transfection， Western blotting and RT-qPCR assay were used to investigate the effects of low-dose and high-dose oleanolic acid on the expression of NF-κB/PRL-3 pathway related proteins and their mRNA. RESULTS： With the increase of the concentration and action time of oleanolic acid， the proliferation capacity of ovarian cancer SKOV3 cells was decreased， the surval rates of administration groups were significantly lower than that of the control group （P<0.05 or P<0.01）. Low-dose and high-dose of oleanolic acid could significantly reduce the number of migrating and invading cells （P<0.05 or P<0.01）. The protein relative expression of NF-κB p65， PRL-3， TNF-α and IL-6 in SKOV3 cells were significantly decreased， while the protein relative expression of E-cadherin was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. After LPS induction， protein and mRNA relative expression of NF-κB p65， PRL-3， TNF-α and IL-6 were increased significantly in LPS model group， while protein and mRNA relative expression of E-cadherin were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The protein and mRNA relative expression of NF-κB p65， PRL-3， TNF-α and IL-6 were significantly decreased， and protein and mRNA relative expression of E-cadherin were significantly increased in low-dose and high-dose of oleanolic acid group （P<0.05 or P<0.01）. In SKOV3 cells with over-expressed NF-κB p65，low-dose and high-dose of oleanolic acid could significantly down-regulat the protein expression of NF-κB p65， PRL-3， TNF-α and IL-6， while upregult the protein relative expression of E-cadherin （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Oleanolic acid can inhibit SKOV3 cells proliferation， invasion and metastasis by regulating NF-κB/PRL-3 signaling pathway.

KEYWORDS? ?Oleanolic acid; Ovarian cancer; SKOV3 cell; Proliferation; Invasion; Metastasis; NF-κB; PRL-3

卵巢癌是最常見的女性生殖器官惡性腫瘤之一，其致死率在婦科腫瘤中居首位，對女性生命健康造成嚴重威脅[1-2]。卵巢深居盆腔，體積小，卵巢癌早期缺乏典型癥狀且發(fā)展迅速，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[3]，超過70%的患者在晚期才被確診[4]，因此臨床上卵巢癌治療效果和患者預(yù)后均較差。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，在全球范圍內(nèi)每年新增卵巢癌病例超過22.5萬，死亡人數(shù)超過14萬[5-6]，臨床在卵巢癌的預(yù)防和治療方面均面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，臨床治療卵巢癌以藥物治療為主，但奧拉帕利等卵巢癌一線治療藥物的長期使用易引發(fā)多種不良反應(yīng)，并導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥[7]，嚴重影響藥物治療效果及患者預(yù)后。因此，尋找安全有效防治卵巢癌的藥物對于提升卵巢癌的治療效果具有重要的意義。

齊墩果酸是一種廣泛存在于各種水果和可食用植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，具有顯著的抗炎作用[8-9]。越來越多的研究證實，炎癥是腫瘤微環(huán)境的基本特征，炎癥信號通路活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。核因子κB（NF-κB）信號通路可促進腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子的釋放，抑制上皮鈣黏著蛋白E（E-cadherin）的表達進而促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中重要的調(diào)節(jié)通路[12-13]。因此，抑制NF-κB信號通路以調(diào)節(jié)腫瘤細胞炎癥微環(huán)境，進而抑制細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移可作為防治腫瘤的新策略。McQueeney KE等[14]的研究表明，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子肝再生磷酸酶3（PRL-3）在卵巢癌細胞中呈高表達，其通過活化端粒結(jié)合蛋白RAP1進而激活NF-κB信號通路以促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移;Wang Z等[15]的研究表明，NF-κB p65在卵巢癌SKOV3細胞中異常表達，抑制該蛋白的表達則可抑制SKOV3細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。由此可見，NF-κB/PRL-3信號通路與卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為卵巢癌防治的新靶標(biāo)。研究表明，齊墩果酸對宮頸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均具有抑制作用[16-18]，但其對卵巢癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及其機制仍不明確?；诖?，本研究以人卵巢癌SKOV3細胞為對象，探討齊墩果酸對其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及其機制，以期為該化合物防治卵巢癌提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;xMark型酶標(biāo)儀、164-5050型電泳儀、170-4156型全能蛋白轉(zhuǎn)膜儀、TC20型細胞計數(shù)器、Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)、iQ5型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀等購自美國Bio-Rad公司;M400D型離心機（上海邁皋科學(xué)儀器有限公司）;ML-T型分析天平（瑞士Mettler Toledo多公司）;CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對照品（批號：O110087，純度：>98%）、脂多糖（LPS，批號：L118716）均購自上海阿拉丁試劑有限公司; NF-κB p65質(zhì)粒（北京華越洋生物科技有限公司，批號：VECT76065）;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（批號：12566014）、TRIzolTMRNA提取試劑（批號：12183555）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號：23227）、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（批號：34580）、M-PERTM哺乳動物蛋白提取試劑（批號：78501）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;胎牛血清（FBS，批號：10099-141）、0.25%胰蛋白酶溶液（批號：25200-056）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號：15070063）均購自美國Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號：SH30022.01）;NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6、E-cadherin、GAPDH等編碼基因上、下游引物和探針均由生工生物工程 （上海） 股份有限公司設(shè)計與合成;熒光定量PCR試劑（上海星漢生物科技有限公司）;結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1063）;CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司，批號：CK04）;NF-κB p65兔單克隆抗體、PRL-3兔多克隆抗體、TNF-α兔單克隆抗體、白細胞IL-6兔單克隆抗體、E-cadherin兔單克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗均購自美國CST公司（批號分別為8242、6484、11948、12912、3195、4970、7074）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）凝膠快速制備試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號：LM-048）;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細胞

人卵巢癌SKOV3細胞株（批號：TCHu185）購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

SKOV3細胞用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”），在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)試驗。

2.2 齊墩果酸藥液配制

精密稱取齊墩果酸對照品適量，溶于二甲基亞砜1 mL中，配成濃度為1×105 ?mol/L的母液，于-20 ℃保存;用時取上述母液適量，加完全培養(yǎng)基稀釋，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過后，即得，備用。

2.3 細胞毒性檢測

采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，以4 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h時將細胞隨機分為對照組及不同濃度藥物組，另設(shè)不含細胞只含培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各給藥組分別加入齊墩果酸終濃度為10、20、40、60、80、100 μmol/L（濃度設(shè)置參考文獻[19]）的含藥完全培養(yǎng)基100 μL，對照組和空白組加入完全培養(yǎng)基100 μL，分別于培養(yǎng)12、24、36、48 h時，加入CCK-8試劑10 μL ，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔吸光度（A），計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（A試驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。上述試驗重復(fù)3次。

2.4 分組、造模與給藥

2.4.1 齊墩果酸對SKOV3細胞的作用 取SKOV3細胞，以5×106個/皿接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng);待細胞生長融合至80%時，將其隨機分為對照組和齊墩果酸低、高劑量藥物組（劑量設(shè)置參考“2.3”項下結(jié)果），每組設(shè)3個復(fù)孔。藥物組分別加入低、高劑量齊墩果酸含藥完全培養(yǎng)基5 mL，對照組加入完全培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)24 h。

2.4.2 齊墩果酸對LPS誘導(dǎo)SKOV3細胞的作用 取SKOV3細胞，以5×106個/皿接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng);待細胞生長融合至80%時，將其隨機分為對照組、LPS模型組和齊墩果酸低、高劑量藥物組（劑量設(shè)置參考“2.3”項下結(jié)果），每組設(shè)3個復(fù)孔。對照組加入完全培養(yǎng)基5 mL，模型組加入LPS終濃度為100 ?g/L 的含藥完全培養(yǎng)基5 mL[20]，藥物組加入為100 ?g/L LPS和低、高劑量齊墩果酸含藥完全培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)24 h。

2.4.3 齊墩果酸對NF-κB p65轉(zhuǎn)染的SKOV3細胞的作用 取SKOV3細胞，以5×106個/皿接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng);待細胞生長融合至80%時，將其隨機分為對照組、NF-κB p65過表達模型組和齊墩果酸低、高劑量藥物組（劑量設(shè)置參考“2.3”項下結(jié)果），模型組及藥物組加入NF-κB p65過表達載體（LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑10 ?L與NF-κB p65質(zhì)粒10 ?g于室溫下孵育20 min即得）轉(zhuǎn)染12 h后，藥物組分別加入低、高劑量齊墩果酸含藥完全培養(yǎng)基5 mL，對照組及模型組給予完全培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)24 h。

2.5 Transwell遷移實驗

將SKOV3細胞用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使其處于饑餓狀態(tài)。SKOV3細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，以1×105個/孔加入到Transwell小室上層中，小室下層加入DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）800 μL，培養(yǎng)24 h。按“2.4.1”項下方法分組、給藥，培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)底部未穿膜的細胞，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色液染色后，在顯微鏡下選取5個不同視野觀察，計算各組細胞遷移數(shù)目（遷移細胞被染成紫色）。上述試驗重復(fù)3次。

2.6Transwell侵襲實驗

Matrigel膠融化后均勻鋪于Transwell小室底部上層中，37 ℃放置致凝固。其余操作同“2.5”項下方法，選取5個不同視野在顯微鏡下觀察，計算各組細胞侵襲數(shù)目。上述試驗重復(fù)3次。

2.7 相關(guān)基因mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。SKOV3細胞按“2.4.1”“2.4.2”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)后，收集細胞，運用TRIzolTM RNA提取試劑提取細胞RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實時熒光定量PCR儀檢測NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6、E-cadherin 等編碼基因mRNA的表達水平。PCR反應(yīng)體系（共20 ?L）：cDNA 模板2 ?L，上、下游引物各1 ?L，熒光定量PCR試劑10 ?L，無酶水6 ?L。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)（引物序列見表1）。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因mRNA的相對表達量。上述試驗重復(fù)3次。

2.8 相關(guān)蛋白表達檢測

采用Western blotting法檢測。SKOV3細胞按“2.4.1”～“2.4.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)后，收集細胞，運用M-PERTM哺乳動物蛋白提取試劑提取蛋白，后用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后將蛋白于95 ℃水浴中變性5 min后即得蛋白樣品。取蛋白樣品40 ?g在100 V、80 mA的電泳條件下進行SDS-PAGE，在25 V、1.0 A條件下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（0.45 ?m）上，以5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6、E-cadherin、β-actin等一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），在4 ℃條件下孵育過夜，TBST溶液清洗10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h，TBST溶液清洗10 min×3次，經(jīng)ECL顯色后運用凝膠成像分析系統(tǒng)成像，采用Image J 1.8.0圖像軟件分析。以β-actin作為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達量。上述試驗重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度齊墩果酸對SKOV3細胞存活率的影響

隨著齊墩果酸濃度的增加和作用時間的延長，SKOV3細胞的增殖能力有隨之減弱的趨勢，齊墩果酸各劑量組細胞存活率均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01），詳見表2。當(dāng)齊墩果酸濃度為20 μmol/L、作用24 h時，SKOV3細胞的存活率為（79.06± 3.24）%，提示該濃度齊墩果酸對SKOV3細胞具有顯著的細胞毒性。因此，選擇20 μmol/L作為齊墩果酸給藥的低劑量，選擇40 μmol/L作為齊墩果酸給藥的高劑量，并選擇作用24 h作為齊墩果酸的給藥條件。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. control group， *P<0.05， **P<0.01

3.2 齊墩果酸對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響

與對照組比較，齊墩果酸低、高劑量組遷移和侵襲的細胞數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、圖2、表3。

3.3 齊墩果酸對SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，齊墩果酸低、高劑量組NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6的相對表達量均顯著降低，E-cadherin蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表4。

3.4 齊墩果酸對LPS誘導(dǎo)的SKOV3細胞NF-κB/PRL-3通路相關(guān)蛋白及其mRNA表達的影響

與對照組比較，LPS模型組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著升高，E-cadherin 蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.01）;與LPS模型組比較，齊墩果酸低、高劑量組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白及其mRNA相對表達量均顯著降低，E-cadherin 蛋白及其mRNA相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表5、圖4、表6。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與LPS模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

Note： vs. control group， *P<0.05， **P<0.01;vs. LPS model group， #P<0.05， ##P<0.01

3.5 齊墩果酸對NF-κB過表達誘導(dǎo)的SKOV3細胞NF-κB/PRL-3通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

與對照組比較，NF-κB p65過表達模型組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達量均顯著升高，E-cadherin蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與NF-κB p65過表達模型組比較，齊墩果酸低、高劑量組細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白的相對表達量均顯著降低，E-cadherin 蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表7。

4 討論

卵巢癌具有早期難以診斷、惡性程度高、極易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點，難以進行早期預(yù)防，治療難度較大[21-22]。近年來，卵巢癌的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢[23]，故探尋有效防治卵巢癌的藥物已成為目前研究的熱點。研究表明，腫瘤細胞微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)[10-11]，因此改善腫瘤細胞微環(huán)境為腫瘤的防治提供了新思路。

齊墩果酸為可用于腫瘤患者的免疫調(diào)節(jié)，其廣泛存在于蔬菜、水果和可食用植物中，是一種自然資源充足的天然活性成分，具有顯著的抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保肝及抗腫瘤等作用[24-25]。本研究探討了齊墩果酸對卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。CCK-8結(jié)果顯示，隨著齊墩果酸給藥濃度的增加和作用時間的延長，SKOV3細胞的增殖能力有隨之減弱的趨勢，齊墩果酸各劑量組細胞存活率均顯著低于對照組，說明齊墩果酸對SKOV3細胞增殖具有抑制作用。Transwell實驗結(jié)果顯示，20、40 μmol/L齊墩果酸均能夠顯著減少卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲細胞數(shù)目，說明其具有抑制SKOV3細胞遷移與侵襲的作用。

腫瘤細胞炎性浸潤是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要特征。NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠促進大量炎癥因子（如TNF-α、IL-6等）釋放，加速腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[26-27]。其中，TNF-α能夠增加血管通透性，IL-6能夠促進血管生成及腫瘤細胞增殖、分化，在腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[28]。PRL-3是腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[29]，研究表明，該因子能夠促進觸發(fā)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化活化，抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達，從而降低腫瘤細胞黏附作用并促進細胞外基質(zhì)降解，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞向周圍組織、血管侵襲和轉(zhuǎn)移[30-31]。由此可見，NF-κB/PRL-3信號通路對腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均具有促進作用。研究顯示，SKOV3細胞中NF-κB信號通路異?；罨?，具有促進卵巢癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，活化的NF-κB信號通路能夠促進PRL-3高表達進而促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[32]。這提示靶向調(diào)節(jié)NF-κB/PRL-3信號通路可作為抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要途徑。

本研究結(jié)果表明，不同濃度齊墩果酸均能夠顯著抑制SKOV3細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白的表達，升高E-cadherin蛋白的表達。研究顯示，LPS能夠通過活化NF-κB信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[33]。因此，本研究運用LPS誘導(dǎo)SKOV3細胞活化NF-κB/PRL-3信號通路，進一步研究齊墩果酸對該信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，采用LPS誘導(dǎo)后，SKOV3細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白及其mRNA的表達均顯著升高，E-cadherin 蛋白及其mRNA的表達均顯著降低;采用齊墩果酸干預(yù)能夠顯著降低細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6蛋白及其mRNA的表達，升高E-cadherin 蛋白及其mRNA的表達。這提示齊墩果酸抑制SKOV3細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用可能與調(diào)控NF-κB/PRL-3信號通路以抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。NF-κB信號通路活化能夠激活PRL-3、抑制E-cadherin，從而促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[34]。為了進一步確定齊墩果酸是否通過抑制NF-κB p65進而調(diào)節(jié)PRL-3、TNF-α、IL-6、E-cadherin的表達，本研究運用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑將NF-κB p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞中，使細胞中的NF-κB p65過表達，從而激活PRL-3、TNF-α、IL-6等相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，齊墩果酸仍然能夠抑制NF-κB p65過表達誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，下調(diào)SKOV3細胞中NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6 蛋白的表達，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達。由此推測，齊墩果酸可能主要通過抑制炎癥反應(yīng)及上皮細胞間質(zhì)化過程而抑制SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，齊墩果酸可能通過調(diào)控NF-κB/PRL-3通路相關(guān)因子的表達，抑制炎癥反應(yīng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而抑制SKOV3細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，對于防治卵巢癌具有一定的潛力。

參考文獻

[ 1 ] BOWTELl DD， BOHM S， AHMED AA， et al. Rethinking ovarian cancer Ⅱ： reducing mortality from high-grade serous ovarian cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2015，15（11）：668-679.

[ 2 ] TORRE LA， TRABERT B， DESANTIS CE， et al. Ovarian cancer statistics：2018[J]. CA Cancer J Clin，2018，68（4）：284-296.

[ 3 ] 周琳，何秀萍.卵巢癌形成、診斷及治療的研究進展[J].中國生育健康雜志，2018，29（5）：491-493.

[ 4 ] STEWART C， RALYEA C， LOCKWOOD S. Ovarian cancer： an integrated review[J]. Semin Oncol Nurs，2019，35（2）：151-156.

[ 5 ] FRANIER B， THOMPSON M. Early stage detection and screening of ovarian cancer： a research opportunity and significant challenge for biosensor technology[J]. Biosens Bioelectron， 2019. DOI：10.1016/j.bios.2019.03.041.

[ 6 ] LA VECCHIA C. Ovarian cancer： epidemiology and risk factors[J]. Eur J Cancer Prev，2017，26（1）：55-62.

[ 7 ] GOULOOZE SC， COHEN AF， RISSMANN R. Olaparib[J]. Br J Clin Pharmacol，2016，81（1）：171-173.

[ 8 ] 程艷剛，荊然，譚金燕，等.齊墩果酸及其衍生物抗腫瘤作用機制研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，18（11）：210-213.

[ 9 ] SHANMUGAM MK， DAI X， KUMAR AP， et al. Oleanolic acid and its synthetic derivatives for the prevention and therapy of cancer： preclinical and clinical evidence[J]. Cancer Lett，2014，346（2）：206-216.

[10] 唐亞尼，孫洋，葉茂.炎癥反應(yīng)促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的研究進展[J].生命科學(xué)研究，2015，19（2）：160-164.

[11] CHANG CH， QIU J， OSULLIVAN D， et al. Metabolic competition in the tumor microenvironment is a driver of cancer progression[J]. Cell，2015，162（6）：1229-1241.

[12] QIN Y， ZHAO D， ZHOU HG， et al. Apigenin inhibits NF-κB and snail signaling， EMT and metastasis in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget，2016，7（27）：41421-41431.

[13] TANIGUCHI K， KARIN M. NF-κB， inflammation， immunity and cancer： coming of age[J]. Nat Rev Immunol，2018，18（5）：309-324.

[14] MCQUEENEY KE， SALAMOUN JM， BURNETT JC， et al. Targeting ovarian cancer and endothelium with an allosteric PTP4A3 phosphatase inhibitor[J]. Oncotarget， 2018，9（9）：8223-8240.

[15] WANG Z， ZHAI Z， DU X. Celastrol inhibits migration and invasion through blocking the NF-κB pathway? in ovarian cancer cells[J]. Exp Ther Med，2017，14（1）：819- 824.

[16] 王晶，張濤，商云飛.齊墩果酸對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（1）：31-32.

[17] BAO X， GAO M， XU H， et al. A novel oleanolic acid-loaded PLGA-TPGS nanoparticle for liver cancer treatment[J]. Drug Dev Ind Pharm，2015，41（7）：1193-1203.

[18] ZHAO X， LIU M， LI D. Oleanolic acid suppresses the proliferation of lung carcinoma cells by miR-122/Cyclin G1/MEF2D axis[J]. Mol Cell Biochem， 2015，400（1/2）：1-7.

[19] 耿傳營， 徐波， 李紅艷，等. 3種中藥單體對卵巢癌端粒酶活性與放射敏感性的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（10）：1372-1375.

[20] 于洋，劉師兵，李松巖，等.脂多糖通過調(diào)節(jié)iNOS表達影響人卵巢癌SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥性的研究[J]. 毒理學(xué)雜志，2017，31（5）：350-354.

[21] 李晶，吳妙芳，林仲秋. 《FIGO 2018婦癌報告》：卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌診治指南解讀[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2019，35（3）：304-314.

[22] BURSTEIN HJ， KRILOV L， ARAGON-CHING JB， et al. Clinical cancer advances 2017： annual report on progress against cancer from the? American Society of Clinical Oncology[J]. J Clin Oncol，2017，35（12）：1341-1367.

[23] WEBB PM， GREEN AC， JORDAN SJ. Trends in hormone use and ovarian cancer incidence in US white and Australian women： implications for the future[J]. Cancer Causes Control，2017，28（5）：365-370.

[24] 廖忻，陳文瑩，楊杰也琦，等.齊墩果酸的來源及護腎作用研究進展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（6）：156-160.

[25] 王京，鄭誠月，王楊，等.齊墩果酸衍生物的合成、抗癌活性及構(gòu)效關(guān)系研究進展[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊）， 2017，38（3）：118-124.

[26] 胡芳.核因子-κB與卵巢癌[J].國外醫(yī)學(xué)（婦產(chǎn)科學(xué)分冊），2001，28（4）：228-231.

[27] 方艷惠，趙喜娃，安麗沙. IL-6對卵巢癌細胞遷移和侵襲影響及機制探討[J].中華腫瘤防治雜志，2018，25（16）：1156-1162.

[28] 林鎮(zhèn)海，閆士燦，張潔筠，等. MST4通過激活MAPK- ERK信號通路調(diào)節(jié)炎癥因子釋放促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機制研究[J].中國癌癥雜志，2017，27（9）：681-686.

[29] 宋秀軍，劉建紅，呂進，等. PRL-3在腫瘤中作用機制的研究進展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2017，22（6）：566-569.

[30] XIONG J， LI Z， ZHANG Y， et al. PRL-3 promotes the peritoneal metastasis of gastric cancer through the PI3K/Akt signaling pathway by regulating PTEN[J]. Oncol Rep，2016，36（4）：1819-1828.

[31] XU H， ZENG Y， LIU L， et al. PRL-3 improves colorectal cancer cell proliferation and invasion through IL-8 mediated glycolysis metabolism[J]. Int J Oncol，2017，51（4）：1271-1279.

[32] GARI HH， DEGALA GD， RAY R， et al. PRL-3 engages the focal adhesion pathway in triple-negative breast cancer cells to alter actin structure and substrate adhesion properties critical for cell migration and invasion[J]. Cancer Lett，2016，380（2）：505-512.

[33] HUANG T， CHEN Z， FANG L. Curcumin inhibits LPS- induced EMT through downregulation of NF-κB-Snail signaling in breast cancer cells[J]. Oncol Rep， 2013，29（1）：117-124.

[34] LI H， LI Y， LIU D， et al. LPS promotes epithelial-mesenchymal transition and activation of TLR4/JNK signaling[J]. Tumour Biol，2014，35（10）：10429-10435.

（收稿日期：2019-09-14 修回日期：2020-03-26）

（編輯：段思怡）