外源水楊酸對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗生理的影響

黃程　文小梅　唐殷　郭磊周　江世杰　代其林

摘要：采用葉面噴施法探討水楊酸（SA）對(duì)不同時(shí)間段NaCl脅迫下小白菜（Brassica campestris L.）幼苗生理的影響。結(jié)果表明，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SA預(yù)處理的小白菜幼苗葉片葉綠素含量、相對(duì)含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及相關(guān)基因的表達(dá)量均高于對(duì)照處理;而丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均低于對(duì)照處理。在整個(gè)鹽脅迫過(guò)程中，相對(duì)含水量、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量以及脯氨酸含量呈不斷下降的趨勢(shì);丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率呈不斷上升的趨勢(shì);POD活性以及SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在3 d。POD基因與SOD基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且峰值出現(xiàn)在3 d。分析結(jié)果表明，外源水楊酸可以通過(guò)提高葉綠素含量、相對(duì)含水量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化酶活性，并且減輕細(xì)胞膜損傷來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)小白菜幼苗的傷害，從而提高小白菜幼苗的抗鹽能力。

關(guān)鍵詞：水楊酸;小白菜;鹽脅迫;生理生化;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S634.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）07-0147-05

據(jù)統(tǒng)計(jì)，地球鹽漬土地面積約占陸地總面積的1/3，而土壤鹽漬化問(wèn)題給農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來(lái)了諸多負(fù)面影響，給農(nóng)作物的生產(chǎn)帶來(lái)了極大的阻礙。目前，也出現(xiàn)了許多土壤改良劑、土壤調(diào)理劑來(lái)改善土壤中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，但并不能從根本上解決土壤鹽漬化對(duì)植物造成的傷害[1-2]。土壤鹽分降低了土壤資源價(jià)值，給生產(chǎn)性農(nóng)業(yè)帶來(lái)巨大損失，對(duì)環(huán)境造成威脅，從而加大了對(duì)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的危害[3]。當(dāng)植物體處于鹽脅迫環(huán)境下時(shí)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的大量產(chǎn)生并且導(dǎo)致活性氧清除系統(tǒng)之間的失衡?；钚匝醯睦鄯e會(huì)引起膜質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并且傷害細(xì)胞膜[4]，而植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可以通過(guò)抗氧化酶之間的協(xié)同作用來(lái)清除[5-6]。桑利敏研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甜菜幼苗處于鹽脅迫條件下時(shí)，其出芽率、葉綠素含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）的活性等各項(xiàng)生理指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，植物生長(zhǎng)受到限制[7]。師晨娟等論述了多胺、細(xì)胞分裂素、乙烯、脫落酸等激素對(duì)鹽脅迫下植物的緩解作用與作用機(jī)制[8]，如吲哚乙酸對(duì)鹽脅迫下的番茄幼苗具有緩解作用，脫落酸（ABA）可以提高鹽脅迫下小麥的產(chǎn)量等[9-10]。水楊酸（SA）可以提高煙草對(duì)病毒的抗性，并且在黃瓜體內(nèi)可以作為介導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）傳遞的內(nèi)源信號(hào)[11-12]，可以提高植物體的抗逆性[13-14]。

目前，關(guān)于SA對(duì)小白菜幼苗抗鹽生理方面的研究較少，探究SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗生理的影響，有利于為日后小白菜在鹽脅迫環(huán)境的栽培生產(chǎn)提供一定的理論參考。本研究以小白菜為試驗(yàn)材料，研究鹽脅迫下SA對(duì)小白菜幼苗生理生化過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小白菜品種為溫州快菜，購(gòu)自綿陽(yáng)龍門農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。溫州快菜生長(zhǎng)周期短，生育期60 d，我國(guó)南北各地均可種植。

1.2 方法

選取飽滿的小白菜種子，用1% NaClO溶液消毒處理10 min，用蒸餾水清洗后在25 ℃的溫室中浸種2 d，然后置于25 ℃組織培養(yǎng)室內(nèi)催芽2 d。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的小白菜出芽種子，均勻地栽種在盛有石英砂的塑料盤中（規(guī)格為120 cm×30 cm），共12盤，然后加入清水，放入（25±1） ℃、光/暗周期12 h/12 h、光流密度200 μmol/（m2·s）條件下的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。當(dāng)小白菜幼苗第1張葉張開時(shí)，開始添加MS培養(yǎng)液，培養(yǎng)至3葉1心期。把小白菜幼苗分成2組，一組小白菜幼苗葉片上均勻噴施濃度為0.5 mmol/L的水楊酸溶液，另一組小白菜葉片噴施蒸餾水作為對(duì)照。靜置1 d后，去掉盤中原來(lái)的MS培養(yǎng)液，再將噴施了SA和蒸餾水的小白菜幼苗置于含有200 mmol/L 的NaCl溶液中培養(yǎng)1 d，從上往下數(shù)取小白菜幼苗的第3張幼葉為試驗(yàn)材料，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

按照丙酮乙醇混合法[15]測(cè)定葉綠素含量;按照浸泡法[16]測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率;按照王學(xué)奎的方法[17]測(cè)定可溶性糖含量;按照茚三酮法[18]測(cè)定脯氨酸含量;按照陳建勛等的方法[19]測(cè)定相對(duì)含水量;用NBT光還原法測(cè)定SOD活性;用Omran法[20]測(cè)定POD活性;按照Lowry法[20]測(cè)定可溶性蛋白含量;按照硫代巴比妥酸（TBA）比色法[18]測(cè)定丙二醛含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗葉片生理干旱情況的影響

植物葉片的相對(duì)含水量可以反映植物對(duì)鹽脅迫所帶來(lái)的生理干旱的抵抗能力。在一定范圍內(nèi)，植物葉片含水量高，說(shuō)明其體內(nèi)的生理生化反應(yīng)可以正常進(jìn)行，能夠保證正常的新陳代謝[21-22]。由圖1可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小白菜幼苗葉片含水量明顯下降，在鹽脅迫過(guò)程中，經(jīng)SA預(yù)處理的小白菜幼苗葉片含水量均高于對(duì)照處理（蒸餾水處理），在鹽脅迫的4 d時(shí)，SA處理的小白菜和對(duì)照處理的小白菜的含水量差達(dá)到最大。表明噴施SA有利于減緩小白菜幼苗在鹽脅迫下含水量的下降，緩解了小白菜幼苗的生理干旱，增強(qiáng)了小白菜的鹽脅迫抗性。

2.2 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗質(zhì)膜的影響

當(dāng)植物處于非生物脅迫下時(shí)，其質(zhì)膜會(huì)受到傷害，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量增加[21-22]。由圖2可知，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量均隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，經(jīng)SA預(yù)處理的小白菜幼苗相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量均低于對(duì)照處理。鹽脅迫4 d時(shí)，SA處理和對(duì)照處理小白菜的相對(duì)電導(dǎo)率差值達(dá)到最大;在鹽脅迫的4 d時(shí)，SA處理和對(duì)照處理的小白菜丙二醛含量差值達(dá)到最大?？傮w而言，在鹽脅迫的過(guò)程中，SA處理的小白菜相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量均低于對(duì)照處理，表明噴施SA有利于緩解小白菜在鹽脅迫下的膜質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)了小白菜的鹽脅迫抗性。

2.3 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗葉片光合作用的影響

葉綠素是光合作用重要的色素分子，決定著光合作用的效率。因此，葉綠素含量是體現(xiàn)植物抵抗非生物脅迫能力的重要指標(biāo)[21-22]。由圖3可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小白菜幼苗葉片葉綠素含量明顯下降，而SA預(yù)處理的小白菜葉幼苗綠素含量下降速度比對(duì)照更慢。在鹽脅迫4 d時(shí)，SA處理小白菜和對(duì)照處理小白菜葉綠素含量差值最大。表明噴施SA有利于減緩鹽脅迫下小白菜葉綠素的降解，提高光合作用效率，有助于增強(qiáng)小白菜的鹽脅迫抗性。

2.4 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗葉片滲透勢(shì)的影響

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以降低細(xì)胞滲透壓，減少失水，降低植株受到的脅迫傷害[20-21]。由圖4可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小白菜幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均呈上升趨勢(shì)。在鹽脅迫的同一時(shí)間內(nèi)，SA處理小白菜幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量均高于對(duì)照處理。鹽脅迫剛開始時(shí)，SA和對(duì)照處理的小白菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量差異不明顯，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SA處理的小白菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)明顯高于對(duì)照處理。脅迫處理3 d時(shí)，SA處理和對(duì)照處理可溶性糖含量差達(dá)到最大。脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均在脅迫的4 d時(shí)達(dá)到最大差值。結(jié)果表明，噴施SA可以提高鹽脅迫下小白菜幼苗的滲透物質(zhì)含量，有利于降低細(xì)胞的水勢(shì)，減少小白菜失水，降低小白菜受到的鹽脅迫傷害，增強(qiáng)了小白菜抵抗鹽脅迫的能力。

2.5 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗抗氧化酶的影響

植物受到非生物脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，對(duì)植物體造成傷害。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物體形成了具有清除活性氧自由基能力的抗氧化防御體系，其中SOD和POD是重要的保護(hù)酶類[20]。由圖5可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD和POD活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且均在鹽脅迫3 d后開始下降。SA處理和對(duì)照處理小白菜SOD、POD活性的最大差值均出現(xiàn)在脅迫3 d時(shí)。整個(gè)脅迫過(guò)程中，SA處理的小白菜抗氧化酶活性均高于對(duì)照處理，表明噴施SA有利于保護(hù)鹽脅迫下小白菜的抗氧化酶系統(tǒng)，增強(qiáng)了小白菜抵抗鹽脅迫的能力。

2.6 SA對(duì)鹽脅迫下小白菜幼苗抗氧化酶基因表達(dá)的影響

為探究小白菜幼苗的耐鹽機(jī)制，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究POD和SOD基因在NaCl脅迫下的表達(dá)。由圖6可知，NaCl脅迫1 d以后，小白菜幼苗POD和SOD基因表達(dá)水平與對(duì)照相比均存在明顯差異。其中，未進(jìn)行NaCl處理時(shí)，POD和SOD基因有少量表達(dá);在NaCl處理后，小白菜幼苗POD和SOD基因的相對(duì)表達(dá)水平均有不同程度的提高，POD和SOD基因的表達(dá)量均在NaCl脅迫3 d時(shí)達(dá)到最高水平，與它們的酶活性變化具有一致的趨勢(shì)。表明外源水楊酸通過(guò)上調(diào)鹽脅迫下小白菜幼苗抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量來(lái)增強(qiáng)其抗氧化酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)了小白菜抵抗鹽脅迫的能力。

3 結(jié)論與討論

在植物體生長(zhǎng)的不同時(shí)期，其鹽脅迫抗性存在一定的差異，植物在苗期對(duì)鹽脅迫更為敏感[23-24]，因此選取了苗期的小白菜進(jìn)行試驗(yàn)。

當(dāng)處于鹽脅迫下時(shí)，植物體內(nèi)的生理特性發(fā)生巨大的變化[25]。由于植物自身的抗逆機(jī)制，植物體內(nèi)會(huì)迅速積累可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。當(dāng)脅迫達(dá)到一定程度時(shí)，植物自身抗逆機(jī)制會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的傷害，進(jìn)而導(dǎo)致植物體滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的下降[26]。同時(shí)鹽脅迫也會(huì)引起植物體內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生，其中POD和SOD等抗氧化酶組成的抗氧化酶系統(tǒng)可以清除植物體內(nèi)的氧自由基[20]。本研究中沒(méi)有鹽脅迫時(shí)，SA處理和對(duì)照處理的各項(xiàng)生理影響并沒(méi)有明顯差別，表明在正常的生長(zhǎng)環(huán)境下，噴施SA對(duì)小白菜體內(nèi)的生理生化反應(yīng)并無(wú)明顯影響，這與富春元等的研究結(jié)果[27]一致。鹽脅迫對(duì)小白菜造成的傷害會(huì)通過(guò)某種信號(hào)傳遞的方式來(lái)影響小白菜的生理生化指標(biāo)，而生理生化指標(biāo)的變化會(huì)體現(xiàn)在這種信號(hào)傳遞完成之后。隨著鹽脅迫的進(jìn)行，對(duì)照處理的小白菜POD和SOD指標(biāo)先升高后降低，與杜世章等的研究結(jié)果[28]一致。表明在沒(méi)有噴施SA的情況下，小白菜幼苗在面對(duì)鹽脅迫時(shí)，自身也會(huì)有一種抗逆機(jī)制，進(jìn)而使抗氧化酶活性在一定范圍內(nèi)上升。當(dāng)脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)之后，這種抗逆機(jī)制會(huì)受到破壞，進(jìn)而使抗氧化酶活性下降，甚至可能會(huì)低于正常生長(zhǎng)的小白菜抗氧化酶活性，直至小白菜死亡。當(dāng)鹽脅迫時(shí)間足夠久時(shí)，將會(huì)對(duì)小白菜本身的抗逆機(jī)制造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步的考證與研究。

鹽脅迫下小白菜幼苗相關(guān)抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了變化。在沒(méi)有使用NaCl處理之前，SOD基因與POD基因僅有微量表達(dá)。在使用NaCl處理之后，2種抗氧化酶基因的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，且均在脅迫3 d時(shí)達(dá)到峰值，之后表達(dá)量均有下調(diào)。與代其林等關(guān)于豇豆在鹽脅迫下抗氧化酶活性以及相關(guān)基因表達(dá)的研究結(jié)果[20]吻合。顯然，這2種抗氧化酶基因都是誘導(dǎo)表達(dá)型基因，均存在過(guò)量表達(dá)的可能性。

參考文獻(xiàn)：

[1]史慶華，朱祝軍，Khalidal-Aghabary K，等. 等滲鹽脅迫對(duì)番茄抗氧化酶和ATP酶及焦磷酸酶活性的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（3）：311-316.

[2]付立東，王 宇，隋 鑫，等. 氮肥運(yùn)籌對(duì)濱海鹽堿地水稻生育及產(chǎn)量的影響[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（3）：327-330.

[3]Long X H，Zhao J，Liu Z P，et al. Applying geostatistics to determine the soil quality improvement by Jerusalem artichoke in coastal saline zone[J]. Ecological Engineering，2014，70（4）：319-326.

[4]Sairam R K，Vasanthan B，Arora A，et al. Calcium regulates Gladiolus flower senescence by influencing antioxidative enzymes activity[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2011，33（5）：1897-1904.

[5]孫彩霞，劉志剛，荊艷東. 水分脅迫對(duì)玉米葉片關(guān)鍵防御酶系活性及其同工酶的影響[J]. 玉米科學(xué)，2003，11（1）：63-66.

[6]Ennajeh M，Vadel A M，Khemira H，et al. Osmoregulation and osmoprotection in the leaf cells of two olive cultivars subjected to severe water deficit[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2009，31（4）：711-721.

[7]桑利敏. 甜菜幼苗對(duì)中性鹽和堿性鹽脅迫的生理應(yīng)答特性[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[8]師晨娟，劉 勇，荊 濤. 植物激素抗逆性研究進(jìn)展[J]. 世界林業(yè)研究，2006，19（5）：21-26.

[9]劉拴成，曹興明，穆俊祥，等. 外源激素對(duì)鹽脅迫下番茄種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 種子，2016，35（12）：94-98.

[10]李曉宇，穆春生. 鹽堿脅迫及外源植物激素對(duì)小麥和羊草生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 草地學(xué)報(bào)，2017，25（2）：257-260.

[11]Malamy J，Carr J P，Klessig D F，et al. Salicylic acid：a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection[J]. Science，1990，250（4983）：1002-1004.

[12]Métraux J P，Signer H，Ryals J，et al. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber[J]. Science，1990，250（4983）：1004-1006.

[13]Durner J，Shah J，Klessig D F. Salicylic acid and disease resistance in plants[J]. Trends in Plant Science，1997，2（7）：266-274.

[14]Delaney T P，Uknes S，Vernooij B，et al. A central role of salicylic Acid in plant disease resistance[J]. Science，1994，266（5188）：1247-1250.

[15]徐國(guó)瑞，劉濟(jì)明，閆國(guó)華，等. 羅甸小米核桃葉綠素含量測(cè)定方法研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2010，29（5）：419-423.

[16]陳愛(ài)葵，韓瑞宏，李東洋，等. 植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定方法比較研究[J]. 廣東教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（5）：88-91.

[17]王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2006.

[18]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[19]陳建勛，王曉峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，2006.

[20]代其林，王金玲，馬明莉，等. NaCl脅迫處理對(duì)豇豆幼苗抗氧化酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：193-196.

[21]Hou Y D，Guo Z F，Yi Y，et al. Effects of cold acclimation and exogenous pytohormone abscisic acid treatment on physiological indicators of winterness wheat[J]. Journal of Plant Sciences，2010，5（2）：125-136.[HJ1.95mm]

[22]王連榮，薛擁志，常美花，等. 外源激素對(duì)杏扁抗寒生理指標(biāo)的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，30（2）：396-403.

[23]孫小芳，鄭青松，劉友良. NaCl脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的傷害[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2000，9（3）：22-25.

[24]沈禹穎，王鎖民. 鹽脅迫對(duì)牧草種子萌發(fā)及其恢復(fù)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，1999，42（3）：54-60.

[25]Jini D，Joseph B. Physiological mechanism of salicylic acid for alleviation of salt stress in rice[J]. Rice Science，2017，24（2）：97-108.

[26]付 艷，高樹仁，楊克軍，等. 鹽脅迫對(duì)玉米耐鹽系與鹽敏感系苗期幾個(gè)生理生化指標(biāo)的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2011，47（5）：459-462.

[27]富春元，張淑娟，魚昭君，等. PEG模擬干旱脅迫對(duì)葉緣裂刻小白菜生理特性的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（5）：139-145.

[28]杜世章，代其林，奉 斌，等. 不同濃度NaCl脅迫處理下豇豆幼苗抗氧化酶活性的變化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30（3）：351-356.