穩(wěn)定表達(dá)非洲豬瘟病毒P54 蛋白的Vero 細(xì)胞系的建立

王彩霞 杜方原 林祥梅 Grzegorz Wozniakowski 王勤 馮春燕 吳紹強(qiáng)

（1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176；2. 波蘭國家獸醫(yī)研究所豬病部，波蘭普瓦維 24-100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的烈性、高度接觸性傳染?。?］。1921 年，肯尼亞首次記錄了非洲豬瘟的爆發(fā)，目前非洲大陸次撒哈拉地區(qū)的大多數(shù)非洲國家均有流行［2］。該病于1957 年傳入歐洲南部地區(qū)，1971 年傳入加勒比海地區(qū)和南美洲，2007 年傳入高加索地區(qū)和俄羅斯，現(xiàn)在仍在非洲、南撒丁島、高加索地區(qū)以及俄羅斯流行［3］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將非洲豬瘟列為一類動(dòng)物疫病，在《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》中，ASF 被列為優(yōu)先防范的13 種重大外來動(dòng)物疫病之一。我國于2018 年也爆發(fā)了該病且呈現(xiàn)出繼續(xù)蔓延的趨勢，截至2019 年9 月5 日，我國已有32 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市發(fā)生了ASFV 疫情，有關(guān)防控部門對疫區(qū)豬群進(jìn)行了撲殺政策，從而導(dǎo)致我國目前豬肉價(jià)格急劇攀升，使得我國對該病的防控形勢十分 嚴(yán)峻［4-5］。

ASFV 屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是一種有囊膜的雙鏈DNA 病毒，能夠在Vero 細(xì)胞，PAM 細(xì)胞及PAM 細(xì)胞系中增殖。病毒基因組全長為170 kb-190 kb，整個(gè)基因組含有151 個(gè)ORF，可以編碼150-200 個(gè)蛋白質(zhì)，可以編碼的結(jié)構(gòu)蛋白有54 種以上，包括P54、P72、P30 等。其中P54 蛋白存在于病毒粒子內(nèi)層囊膜，是ASFV 重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L 基因編碼。P54 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體時(shí)起十分重要的作用。P54 蛋白可分泌到病毒體外，并以二硫鍵連接的I 型膜結(jié)合物形式感染細(xì)胞，而且感染細(xì)胞后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處短暫表達(dá)［6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，弱毒株攻毒后7-10 d 即可檢測到P54 抗體［7］。用P54 蛋白建立的ELISA 抗體檢測方法，具有很高的敏感性，特異性和穩(wěn)定性。本研究選擇P54 蛋白作為靶標(biāo)，建立穩(wěn)定表達(dá)P54 基因的單克隆Vero 細(xì)胞系，可用于非洲豬瘟抗體的檢測和確診，能有效縮短檢測時(shí)間且檢測過程中不涉及病原感染，降低了生物安全的要求。此外，建立的穩(wěn)定表達(dá)P54 基因的單克隆Vero 細(xì)胞系還可能進(jìn)一步用于非洲豬瘟病毒的致病機(jī)理的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清、抗體和細(xì)胞 鼠抗Azami Green（以下簡單標(biāo)記為AG）的單抗、鼠抗β-Actin 的單抗、辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、TRITC 標(biāo)記的山羊抗鼠熒光抗體和TRITC 標(biāo)記的兔抗豬熒光抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；滅活的ASFV 豬陽性血清，波蘭國家獸醫(yī)研究所保存。HEK293V 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞和鼠抗P54 多抗，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM，F(xiàn)BS 購自Hyclone 公司；Trypsin-EDTA（0.25%），phenol red（GibcoTM） 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；phmAG1-MCLinker 購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；慢病毒載體pLV-puro，輔助載體pH1、pH2，PEG 慢病毒純化試劑盒均購自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司；胰蛋白酶購自Amresco 公司；PolyFect 轉(zhuǎn)染試劑，Plasmid Plus Maxi Kit 質(zhì)粒提取試劑盒，RNeasy Mini Kit 均購自Qiagen 公司；限制性內(nèi)切酶MluI 和NotI，T4DNA 連接酶均購自TaKaRa 公司；EasyPfu DNA Polymerase、TransScript Green Two-Step qRTPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Hoechst33342 和嘌呤霉素購自Sigma 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中已公布的ASFV P54 基因序列號(hào)（GenBank：FN557520.1）設(shè)計(jì)一對用于P54 基因擴(kuò)增的特異性引物。其中，上游引物P54-F 為：5′-CGACGCGTCG ATGGATTCTGAATTTTTTCAAC-3′，下劃線處為MluI識(shí)別位點(diǎn)；下游引物P54-R 為：5′-CACGCTCACCA TTCCTTGGGTCGATCCTCCTCCTGAACCACC ACTACCACCCGATCCTCCGCCGCCCAAGGAGT TTTC-3′（其中斜體部分為P54 的基因序列，黑體加粗部分為鉸鏈區(qū)序列，未加粗部分為載體phmAG1-MCLinker 的基因序列），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為625 bp。針對phmAG1-MCLinker 設(shè)計(jì)一對用于Azami Green 基因序列擴(kuò)增的特異性引物。其中，上游引物AG-F 為：5′-GAAAACTCCTTGGGCGGCGGAGG ATCGGGTGGTAGTGGTGGTTCAGGAGGAGG ATCGACCCAAGGAATGGTGAGCGTG-3′（其 中 斜體部分為P54 的基因序列，黑體加粗部分為鉸鏈區(qū)序列，未加粗部分為載體phmAG1-MCLinker 的基因序列），下游引物AG-R 為：5′-ATTTGCGGCCGCTTT ATTAGTCAGCGGAATTACCGGTCTT-3′（下劃線處為NotI 識(shí)別位點(diǎn)），預(yù)期擴(kuò)增片段的大小為781 bp。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

分別以非洲豬瘟病毒DNA 和phmAG1-MCLinker載體為模板，以相應(yīng)的特異引物擴(kuò)增ASFV P54 基因序列和Azami Green 基因序列，膠回收兩PCR 產(chǎn)物1∶1 混合后，再以引物P54-F 和AG-R 進(jìn)行搭橋PCR 擴(kuò)增P54-Azami Green 基因的融合片段（P54-AG），預(yù)期融合片段的大小為1 328 bp。將P54-AG融合目的片段通過MulI 和NotI 酶切克隆至慢病毒載體pLV-puro 中，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVASFV-P54-AG。以同樣的操作步驟構(gòu)建pLV-AG質(zhì)粒。

1.2.2 重組慢病毒的包裝 將HEK293V 細(xì)胞接種到90 mm 培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞匯合度為90%-95%時(shí)，通過PolyFect 轉(zhuǎn)染試劑將pLV-ASFV-P54-AG 與輔助質(zhì)粒pH1 和pH2 共轉(zhuǎn)染HEK293V 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PEG 慢病毒純化試劑盒純化病毒，分裝后置-80℃?zhèn)溆?。以相同操作步驟，將pLV-AG 質(zhì)粒與輔助載體共轉(zhuǎn)染HEK293V 細(xì)胞，以制備表達(dá)Azami Green 蛋白的慢病毒對照（以下標(biāo)記為Vero-AG）。

1.2.3 慢病毒感染和細(xì)胞篩選 將Vero 細(xì)胞接種到35 mm 培養(yǎng)皿，將1.2.2 中純化的慢病毒懸液300 μL加入1.7 mL DMEM 培養(yǎng)基（含10%FBS），然后加入聚凝胺至終濃度為6 μg/mL，混合均勻，以其感染細(xì)胞密度為80%左右的正常Vero 細(xì)胞，24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將Vero 細(xì)胞消化后以200-500 個(gè)/皿的密度接種于培養(yǎng)皿，加入嘌呤霉素至終濃度為5 μg/mL 進(jìn)行篩選，每隔2 d 換液一次，并重新添加嘌呤霉素。篩選2 周后不再死亡的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后為多克隆細(xì)胞，消化后以有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞并將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一部分凍存；一部分用于表達(dá)情況檢測。利用RNeasy?Mini Kit 提取擴(kuò)大培養(yǎng)后的單克隆細(xì)胞總RNA，以TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒先將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA 為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縍T-PCR，同時(shí)檢測ASFV-P54 和GAPDH 內(nèi)參基因在Vero 細(xì)胞中的表達(dá)水平，表達(dá)水平高的單克隆細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)鑒定試驗(yàn)。其中檢測ASFV-P54 基因表達(dá)的引物根據(jù)P54 基因序列設(shè)計(jì)，具體引物序列為：P54-RT-F2：5′-AAGATCAGCAA- TGGGCAGAAGT-3′，P54-RT-R2：5′-ACTGTCGTGTAAGGCTCAGTCG-3′；內(nèi)參基因GAPDH 的引物參照文獻(xiàn)［8］，具體引物序列為：GAPDH-F：5′-AACGG- ATTTGGTCGTATTGGG-3′，GAPDH-R：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 細(xì)胞系的Western Blot 鑒定 收集1.2.3 中篩選的約106個(gè)單克隆Vero 細(xì)胞以RIPA 裂解液提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測后半干轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，分別以鼠抗Azami Green 的單抗（1∶1 000），鼠抗β-actin 的單抗（1∶1 000），鼠抗P54 的多抗（1∶8 000）為一抗，采用HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠單抗做1∶5 000 稀釋后作為二抗，通過ECL 系統(tǒng)顯影，拍照，記錄檢測結(jié)果，篩選出最佳表達(dá)ASFV-P54的細(xì)胞系命名為Vero-AG-ASFV-P54。

1.2.5 細(xì)胞系的間接免疫熒光鑒定 制備Vero-AGASFV-P54、Vero-AG 和Vero 三種細(xì)胞的細(xì)胞爬片，以5% BSA 封閉1 h 后，以5% BSA 做抗體稀釋液，分別以鼠抗Azami Green 的單抗（1∶1 000）、SPF豬陰性血清（1∶50）、鼠抗P54 的多抗（1∶1 000）和ASFV 感染豬陽性血清（1∶50）作為一抗，以TRITC 標(biāo)記的山羊抗鼠熒光抗體（1∶100）和TRITC 標(biāo)記的兔抗豬熒光抗體（1∶100）作為二抗對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，利用熒光顯微鏡觀察檢測結(jié)果（該實(shí)驗(yàn)在波蘭國家獸醫(yī)研究所進(jìn)行）。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的特異引物采用兩輪PCR 搭橋擴(kuò)增的方法，獲得P54-AG 融合目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，目的片段大小為1 328 bp，與預(yù)期大小一致。膠回收目的片段，雙酶切后克隆至慢病毒載體pLV-puro 中，構(gòu)建成重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV-ASFV-P54-AG。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，P54 基因序列、插入位置以及閱讀框準(zhǔn)確無誤。

圖1 ASFV-P54 基因與Azami 綠色熒光蛋白的融合片段電泳圖

2.2 重組慢病毒的包裝

利用PolyFect 轉(zhuǎn)染試劑將重組慢病毒質(zhì)粒pLV-ASFV-P54-AG 與 輔 助 質(zhì) 粒pH1 和pH2 共 轉(zhuǎn)染HEK293V 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后觀察細(xì)胞是否存在CPE 現(xiàn)象，然后收集重組慢病毒，結(jié)果顯示，未見HEK293V 細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)ASFV-P54蛋白的細(xì)胞系的篩選

在6 μg/mL 聚凝胺的作用下，將重組慢病毒感染Vero 細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選最終獲得多株可表達(dá)ASFV-P54 蛋白的Vero 單克隆細(xì)胞株，為選擇一株表達(dá)量較高的穩(wěn)定細(xì)胞株，對單克隆細(xì)胞株進(jìn)行了ASFV-P54 和GAPDH 兩基因的雙重?zé)晒釸T-PCR檢測，比較每株單克隆細(xì)胞株ASFV-P54 基因的表達(dá)量。篩選結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，P54-21和P54-24 兩株單克隆細(xì)胞的表達(dá)量較高。

圖2 ASFV-P54 基因在Vero 細(xì)胞系中相對表達(dá)量的熒光RT-PCR 檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 細(xì)胞系的western Blot鑒定

用RIPA 細(xì)胞裂解液分別提取P54-21、P54-24、Vero-AG 和Vero 細(xì)胞的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，分別以鼠抗Azami Green 的單抗，鼠抗β-actin 的單抗，鼠抗P54 的多抗為一抗，用HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠單抗做二抗進(jìn)行Western Blot 檢測。通過比較P54-21 和P54-24 細(xì)胞中P54 蛋白的表達(dá)水平，可以看出P54-24 細(xì)胞系中P54 的表達(dá)水平明顯高于P54-21 細(xì)胞系中P54 的表達(dá)水平（43 kD 大小的條帶），因此將P54-24 命名為Vero-AG-ASFV-P54，用于后續(xù)進(jìn)一步的鑒定。從圖中（圖3）我們可以看出，Vero-AG 細(xì)胞對照只有一條26 kD 的帶，顯示Azami Green 已經(jīng)表達(dá)；而Vero 細(xì)胞可見只有β-actin 有表達(dá)，既沒有P54 蛋白帶也沒有Azami Green 蛋白帶；P54-21 和P54-24 下方均有一條Azami Green 蛋白帶，我們推測可能是由于P54 蛋白降解所導(dǎo)致的。

圖3 穩(wěn)定表達(dá)ASFV P54 基因的Vero 細(xì)胞的Western Blot 鑒定結(jié)果

2.5 細(xì)胞系的IFA鑒定

制 備Vero-AG-ASFV-P54、Vero-AG 和Vero 三種細(xì)胞的細(xì)胞爬片，以鼠抗Azami Green 抗體、鼠抗P54 的多抗和ASFV 感染豬陽性血清作為一抗，TRITC 標(biāo)記的山羊抗鼠熒光抗體和TRITC 標(biāo)記的兔抗豬熒光抗體作為二抗進(jìn)行IFA 鑒定。鑒定結(jié)果顯示，通過慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)非洲豬瘟病毒P54 蛋白的Vero 細(xì)胞（Vero-AG-ASFV-P54）不僅能夠與鼠抗P54 蛋白的多抗發(fā)生特異性反應(yīng)（圖4），而且還能被ASFV 感染豬陽性血清識(shí)別（圖5），同時(shí)還可觀察到ASFV P54 蛋白的綠色點(diǎn)狀熒光信號(hào)（圖4、圖5，Azami Green），能夠與多抗或豬陽性血清的紅色染色信號(hào)（圖4、圖5，pAb ASFVP54/positive ASFV Serum）發(fā)生共定位（圖4，圖5，Merge），與陰性血清則無反應(yīng)（圖5，Negative serum）。而Vero 細(xì)胞和Vero-AG 細(xì)胞對照與P54 多抗、ASFV 感染的豬陽性血清均不發(fā)生反應(yīng)（圖4、 圖5）。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)ASFV P54 基因的Vero 細(xì)胞（Vero-AG-ASFV-P54）與P54 多抗反應(yīng)的IFA 結(jié)果

圖5 穩(wěn)定表達(dá)ASFV P54 基因的Vero 細(xì)胞（Vero-AG-ASFV-P54）與ASFV 感染豬血清反應(yīng)的IFA 結(jié)果

3 討論

ASF 可通過與野豬接觸、受污染的豬制品和媒介昆蟲傳播［9］。除非洲外，該病已經(jīng)在美洲、歐洲等多個(gè)國家發(fā)生，2018 年該病傳入我國，導(dǎo)致我國畜牧業(yè)損失重大，非洲豬瘟防控形勢嚴(yán)峻。為了維持我國畜牧業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，保護(hù)國民身體健康以及維護(hù)國家利益，開展該病的檢測技術(shù)研究具有重大意義。

隨著非洲豬瘟疫苗開始進(jìn)入臨床階段，針對該疫病的抗體檢測迫在眉睫。目前抗體的檢測主要依賴國外進(jìn)口試劑盒，國內(nèi)沒有成熟的商品化試劑盒，這些試劑盒成本昂貴，更重要的是試劑盒檢測結(jié)果不能作為確診方法，必須進(jìn)行免疫熒光（IFA）方法進(jìn)一步驗(yàn)證［10］。

基于病毒學(xué)的IFA 研究方法，該方法是OIE 推薦的實(shí)驗(yàn)室確診方法［11］。但該方法需要病毒感染敏感細(xì)胞過程。目前非洲豬瘟主要感染原帶豬肺泡巨噬細(xì)胞，獲取原帶豬肺泡巨噬細(xì)胞需要較高的實(shí)驗(yàn)條件［12］。研究表明，在Vero 細(xì)胞系中，有些非洲豬瘟病毒也能復(fù)制，但存在滴度不高的現(xiàn)象。因此利用IFA 對抗體陽性血清進(jìn)行確證，操作繁瑣耗時(shí)長，且涉及生物安全的問題，因此應(yīng)用范圍受限，亟需該方法的替代方法。目前已有很多烈性傳染病利用穩(wěn)定克隆細(xì)胞系表達(dá)病毒蛋白來替代IFA 的方法，如Balamurugan 等［13］利用穩(wěn)定表達(dá)H 蛋白的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系來檢測小反芻獸疫抗體陽性，張永寧等［14］利用BHK-21 細(xì)胞建立的穩(wěn)定表達(dá)施馬倫貝格病毒N 蛋白的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系，為SBV 血清抗體的檢測提供了備用材料。

本研究利用Vero 細(xì)胞首次建立了非洲豬瘟主要抗原P54 蛋白的穩(wěn)定單克隆Vero 細(xì)胞系，利用Vero細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)帶有Azami Green 熒光標(biāo)簽P54 蛋白具有高效的生物活性，能夠與P54 多抗和ASFV 陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可以清晰的觀察到熒光信號(hào)，而對照細(xì)胞則沒有，整個(gè)操作過程無需活病毒感染，在普通條件下即可對樣品進(jìn)行確診，且有效縮短了檢測時(shí)間。這表明該細(xì)胞系有望成為非洲豬瘟感染后抗體檢測和確診的重要研究材料。且通過進(jìn)一步的研究，該穩(wěn)定單克隆Vero 細(xì)胞系還能用于非洲豬瘟病毒致病機(jī)理的研究，其應(yīng)用范圍有待于進(jìn)一步的深挖探究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pLV-ASFV-P54-AG 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，并且篩選到了一株能夠高效穩(wěn)定表達(dá)ASFV-P54 蛋白的Vero 細(xì)胞株，可以在不違背生物安全要求的情況下用于非洲豬瘟血清抗體的檢測，應(yīng)用前景廣闊。