巴西橡膠樹HbAIH 基因的克隆及表達(dá)分析

楊洪 岳鎰繁，2 胡燕玲，2 鄧治 代龍軍 李德軍

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095）

多胺（Polyamines，PAs）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的具有較強(qiáng)生物活性的小分子脂肪族含氮堿，常見的多胺種類有腐胺（Putrescine，Put）、亞精 胺（Spermidine，Spd）、 精 胺（Spermine，Spm）和尸胺（Cadaverine，Cad）等。此外，高亞精胺（Homospermidine，Hspd）、高精胺（Homospermine，Hspm）、降亞精胺（Norspermidine，Nspd）和降精胺（Norspermine，Nspm）等稀有多胺也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。已有許多研究表明，多胺在植物正常生長、發(fā)育、逆境應(yīng)答等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用［1-6］。在生理pH 環(huán)境下，多胺極易與核酸和酸性蛋白質(zhì)相結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄、翻譯和物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程的調(diào)控［4，7-10］。多胺的積累往往與植物抵抗逆境的能力成正相關(guān)。逆境脅迫下，植物多胺的含量和多胺合成酶的活性顯著上升，抗逆性增強(qiáng)。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常通過外源施加多胺來提高植物對干旱、高鹽、低溫等逆境的抵抗能力［11-13］。此外，多胺在植物體內(nèi)還起著類似于cAMP“第二信使”的作用，通過與NO、γ-氨基丁酸、脯氨酸和植物激素等物質(zhì)相互作用來促進(jìn)植物生長、發(fā)育，增強(qiáng)逆境適應(yīng) 能力［14-16］。

在生物體內(nèi)，多胺的合成起始于腐胺的生物合成，因此腐胺的合成對生物體內(nèi)源多胺的合成至關(guān)重要。根據(jù)合成起始物的不同，腐胺的生物合成途徑分為鳥氨酸途徑和精氨酸途徑［17］。鳥氨酸途徑是一個單反應(yīng)過程，前體鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）的作用下脫羧直接生成腐胺；精氨酸途徑則以精氨酸為前體在精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）的作用下脫羧生成鯡精胺（Agmatine，AGM），AGM 相繼經(jīng)鯡精胺亞胺水解酶（Agmatine iminohydrolase，AIH）和N-氨甲酰腐胺-酰胺水解酶（N-carbamoylputrescine amidohydrolase，CPA）作用最終生成Put。已發(fā)現(xiàn)有些植物（如擬南芥、小立碗蘚）由于ODC 基因的缺失使得精氨酸途徑成為其腐胺合成的唯一途徑［18］。作為精氨酸途徑中3 個酶之一，AIH 基因或蛋白已在玉米、小麥、大豆和擬南芥等植物中克隆或純化，關(guān)于該酶結(jié)構(gòu)特征的研究也部分報道［19-22］。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬于大戟科喬木，是目前唯一大面積商業(yè)化種植用于生產(chǎn)天然橡膠的產(chǎn)膠植物。在生產(chǎn)中，通過割膠切斷樹皮中次生乳管從而使膠乳流出獲得天然橡膠的原始材料。巴西橡膠樹膠乳中主要含有Put、Spd 和Spm 三種多胺，且以Put 為主；割面上的Put 和PAs 總含量高于非割面，割面上離割口越近Put 含量越高，其生物合成越活躍，而非割面上的Put 及其它多胺垂直變化不大［23］。這些結(jié)果說明Put 可能是橡膠樹膠乳中的重要多胺，對調(diào)節(jié)橡膠樹橡膠生物合成和膠乳再生具有重要作用。巴西橡膠樹中多個多胺合成途徑基因已相繼報道，但對AIH 基因了解甚少［24-25］。本研究克隆了巴西橡膠樹AIH 基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析，旨在為進(jìn)一步豐富和完善多胺在巴西橡膠樹中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文試驗(yàn)材料為巴西橡膠樹品系熱研-73397，葉、莖尖、雄花、雌花、健康及死皮橡膠樹膠乳和樹皮等組織樣品均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場開割橡膠樹，葉片不同發(fā)育階段樣品采自國家橡膠樹種質(zhì)資源圃。每樣品取3 個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)選3株橡膠樹。樣品采集后用液氮速凍，-80℃保存。

低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫處理材料為移栽培養(yǎng)6 個月的熱研-73397 組培苗。低溫處理在4℃人工氣候箱中進(jìn)行；干旱和高鹽脅迫處理參照劉輝等［26］方法，分別用30% PEG 6000 和1 mol/L NaCl 溶液模擬干旱和高鹽環(huán)境。各處理于設(shè)定時間點(diǎn)采集第2 和3 片葉，以未處理正常植株作對照。以上各處理每時間點(diǎn)均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)5 株組培苗。樣品采集后液氮速凍，-80℃保存，用于RNA 提取。

過氧化氫（H2O2）、乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）等處理材料為達(dá)到開割標(biāo)準(zhǔn)的未開割橡膠樹品系熱研-73397。H2O2處理分別參照Tang 等［27］和Zhu 等［28］方法，乙烯利和MeJA 處理參照Hao 等［29］方法，以不作任何處理的未開割樹為對照。每處理每時間點(diǎn)均設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)5 棵樹。各處理于設(shè)定時間點(diǎn)采集膠乳，液氮凍存，用于RNA 提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 使用植物通用總RNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說明書提取橡膠樹RNA，采用DNase I（Fermentas）去除RNA 中的DNA。利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2HbAIH的 克 隆 3′-RACE（rapid amplification of cDNA ends）采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）試劑盒進(jìn)行。3′-RACE所用引物為5′- CACCAAACACAAGACTTGCTG-3′和5′-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3′。按照試劑盒說明用3′-RACE CDS Primer A 對1 μg 各組織混合RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA 為模板用PrimeSTAR Max Premix（TaKaRa，Dalian，China）進(jìn)行3′端序列的擴(kuò)增。將獲得的3′端序列與轉(zhuǎn)錄組中獲得的unigene 序列進(jìn)行拼接，并設(shè)計全長cDNA 擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.3HbAIH生物信息學(xué)分析 利用ORF finder 預(yù)測開放閱讀框；用在線程序Smart（http：//smart.emblheidelb erg.de/） 和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；用Expasy 網(wǎng) 站 的ProtParam 程 序（http：//web.expasy.or g/protparam/）分析蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等理化性質(zhì)；用NCBI 中的BLAST和DNASTAR 軟件進(jìn)行同源性分析；信號肽預(yù)測用SignalP 4.1 Server 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），采用程序TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk- /services/ TMHMM/）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域。用ClustalX 和MEGA6.0 進(jìn)行多序列比對和Neighbor-Joining 進(jìn)化樹的構(gòu)建，多序列比對顯色用ESPript 工具完成［30］。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 分析 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計HbAIH基因?qū)崟r熒光定量PCR 引物，正、反向引物序列分別為5′-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3′和5′-GCTCTAGACCAAGCTACTAG-3′。 選 擇 巴 西橡膠樹HbUBC4作為內(nèi)參基因，正、反向引物序列 分 別 為5′- TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′ 和5′- TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3′。 根 據(jù)SYBR Green I Master Mix 試劑盒說明書qPCR 反應(yīng)體系如下：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）（TaKaRa）10 μL，正、反向引物各1 μL，模板 2 μL，補(bǔ)ddH2O 至20 μL。每樣品設(shè)置3 次重復(fù)。qPCR 在Bio-Rad CFX96 qPCR 儀進(jìn)行，程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，以確定引物的特異性?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用公式2-ΔΔCt計算。

2 結(jié)果

2.1 HbAIH的克隆及序列特征

通過對巴西橡膠樹轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析，獲得了一條與植物AIH 基因序列高度同源的unigenes。利用RT-PCR 和3′-RACE 技術(shù)獲得了該序列完整開放閱讀框（ORF，open reading frame）和全部3′端序列（圖1）。序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得的基因全長1 462 bp，ORF 長為1 137 bp，編碼378 個氨基酸。同源序列比對結(jié)果表明，該蛋白與木薯、蓖麻、麻風(fēng)樹、毛果楊等AIH 蛋白序列一致性較高，故將該基因命名為HbAIH。

預(yù)測HbAIH 分子量為42.28 kD，理論等電點(diǎn)為5.09。不穩(wěn)定系數(shù)為39.09，為穩(wěn)定蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，HbAIH 不含有信號肽，為胞內(nèi)蛋白。疏水性分析表明，該蛋白親水性氨基酸為152 個，占40.21%；疏水性氨基酸為167 個，占44.18%，平均疏水系數(shù)為-0.411，為親水性蛋白。氨基酸組成中帶有負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）共有51 個，占13.49%；帶有正電荷的氨基酸（Arg+Lys）共有35 個，占9.26%?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，HbAIH 不含跨膜結(jié)構(gòu)域，為非膜蛋白。

2.2 HbAIH基因結(jié)構(gòu)分析

將HbAIHcDNA 序列在橡膠樹熱研-73397 基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對，獲得HbAIH基因組序列，序列全長8 446 bp。編碼區(qū)含有10 個外顯子和9 個內(nèi)含子（圖2），外顯子長度介于56-233 bp，內(nèi)含子長度介于95-1 799 bp 之間。所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合真核生物“GT-AG”規(guī)則。利用GSDS 2.0 在線工具分析了橡膠樹、木薯、麻風(fēng)樹、蓖麻、可可、擬南芥和玉米等的AIH 基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明這些植物AIH具有相同的外顯子/內(nèi)含子組織形式，都由10 個外顯子和9 個內(nèi)含子組成（圖2）。

2.3 HbAIH同源比對及二級結(jié)構(gòu)特征

圖1 HbAIH cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

將HbAIH 與其它物種AIH 基因的氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果（圖3）表明HbAIH 與木薯MeAIH 氨基酸序列一致性最高，達(dá)90.74%。其次是大戟科的蓖麻RcAIH 和麻風(fēng)樹JcAIH，一致性分別是87.57%和85.57%。與原核生物糞鏈球菌EfAIH 和變形鏈球菌SmAIH 氨基酸序列一致性最低，分別為43.57%和45.34%。利用在線程序SOPMA 對HbAIH 進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果表明HbAIH 二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件，占42.86%；其次是α-螺旋和被β 片層結(jié)構(gòu)，占比例分別為26.19%和22.75%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)最少，僅占8%。

2.4 HbAIH系統(tǒng)進(jìn)化分析

在橡膠樹與與其他物種AIH 氨基酸同源比對分析的基礎(chǔ)上，利用NJ 法進(jìn)行了分子進(jìn)化樹聚類分析。如圖4 所示，巴西橡膠樹HbAIH 與木薯MeAIH、麻風(fēng)樹JcAIH 位于同一進(jìn)化分枝，親緣關(guān)系最近，而其它植物AIHs 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；細(xì)菌AIHs 單獨(dú)聚類為一大枝。

圖2 HbAIH 及其他植物AIH 基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.5 HbAIH組織表達(dá)特性及對橡膠樹死皮的響應(yīng)

組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明，HbAIH在巴西橡膠樹莖尖、膠乳、葉、樹皮、雌花、雄花等各組織中均有表達(dá)，其中，在雌花中表達(dá)量最高，雄花中表達(dá)量最低（圖5-A）。比較健康和死皮橡膠樹中表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，HbAIH基因在膠乳中的表達(dá)量高于樹皮，且在死皮橡膠樹膠乳和樹皮中的表達(dá)量均高于健康樹（圖5-B）。在葉片不同發(fā)育階段，HbAIH基因的表達(dá)也存在差異，其中，在淡綠期表達(dá)量最高，接下來依次是變色期、衰老期、古銅期，穩(wěn)定期表達(dá)量最低（圖5-C）。

2.6 HbAIH響應(yīng)逆境脅迫及激素處理的表達(dá)模式

膠乳中HbAIH表達(dá)受H2O2、乙烯利和MeJA 調(diào)控。H2O2處理抑制HbAIH表達(dá)，處理6 hHbAIH表達(dá)水平顯著低于處理前，24 h 達(dá)到最低，48 h 略有升高但仍低于處理前水平（圖6-A）。乙烯利處理前8 h，HbAIH表達(dá)水平持續(xù)下降，處理24、48 和72 h該基因表達(dá)水平基本一致但仍低于處理前（圖6-B）。MeJA 處理下，膠乳中HbAIH的表達(dá)呈下降-上升-下降波浪式變化，處理4 h 該基因表達(dá)量最低，24 h該基因的相對表達(dá)量達(dá)到最高（為處理前1.5 倍），此后該基因的表達(dá)量開始下降，至48 h 恢復(fù)到處理前水平（圖6-C）。

圖3 HbAIH 與其它AIH 多序列比對及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 HbAIH 與其它物種AIHs 蛋白序列聚類分析

圖5 HbAIH 在巴西橡膠樹不同組織（A）、健康及死皮橡膠樹膠乳和樹皮（B）及葉片不同發(fā)育時期（C）表達(dá)模式

葉片中HbAIH的表達(dá)也受低溫、干旱和高鹽的影響。低溫脅迫下，HbAIH的表達(dá)呈現(xiàn)出波浪形變化，處理3 h 該基因相對表達(dá)量降低，然后開始升高，處理24 h 該基因相對表達(dá)量達(dá)到最高值，為處理前的1.4 倍，然后又開始下降，處理48 h 基本恢復(fù)處理前水平（圖6-D）。PEG 模擬干旱脅迫3 h，葉片中HbAIH表達(dá)量高于處理前，為處理前的1.3 倍；此后，該基因表達(dá)開始下降，處理48 h 恢復(fù)處理前水平（圖6-E）。高鹽脅迫3 h，葉片中HbAIH表達(dá)基本沒有變化；隨后，HbAIH的表達(dá)快速升高，脅迫48 h 時該基因的表達(dá)量達(dá)到最高，為處理前的3倍（圖6-F）。

3 討論

圖6 不同處理?xiàng)l件下HbAIH 的表達(dá)模式

真核生物中僅植物能夠通過精氨酸途徑合成腐胺，AIH 是該途徑中的第二個酶。根據(jù)結(jié)構(gòu)分類，AIH 屬于戊烷超家族中的卟啉單胞菌型肽基精氨酸脫氨酶家族成員，具有該家族特有的以5 個αββαβ重復(fù)單元組成的螺旋槳式結(jié)構(gòu)特征［31-32］。研究表明，AIH 是一個同源二聚體蛋白，且參與2 個亞基間氫鍵形成的氨基酸高度保守［20，22，33］。本研究克隆獲得了巴西橡膠樹AIH 基因HbAIH，該基因序列全長1 462 bp，ORF 序列長1 137 bp，編碼378 個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，HbAIH 為親水性蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。蛋白序列比對分析結(jié)果表明，酶活性位點(diǎn)形成和參與底物結(jié)合的11 個氨基酸在HbAIH 及其他植物AIH 氨基酸高度保守。氨基酸相似性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明HbAIH 與大戟科木薯MeAIH 和麻風(fēng)樹JcAIH 等的相似性最高，預(yù)示著它們親緣關(guān)系較近，這與植物學(xué)傳統(tǒng)分類一致。

組織表達(dá)譜表明HbAIH表達(dá)無組織特異性，在本研究所檢測的橡膠樹6 個組織中均有表達(dá)但表達(dá)量具有差異。HbAIH在雌花中表達(dá)量最高而在雄花中表達(dá)量最低，推測HbAIH可能與橡膠樹雌花發(fā)育有關(guān)。此外，不同發(fā)育階段葉片中HbAIH的表達(dá)也存在一定差異。死皮和健康橡膠樹膠乳和樹皮表達(dá)結(jié)果表明，HbAIH在死皮橡膠樹膠乳和樹皮中表達(dá)均有上調(diào)。橡膠樹死皮是割面部分或全部不排膠的現(xiàn)象，這暗示HbAIH可能參與橡膠樹死皮發(fā)生和膠乳再生的分子調(diào)控過程。乙烯利（Ethephon，ET）在天然橡膠生產(chǎn)中常用于刺激膠乳合成和排膠，具有明顯的增產(chǎn)效果［34］；茉莉酸是乳管分化和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化，調(diào)節(jié)橡膠生物合成［29，35-36］。本研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利和茉莉酸甲酯處理后HbAIH表達(dá)存在波動，但整體呈下調(diào)趨勢，暗示其可能負(fù)向調(diào)控橡膠樹ET 反應(yīng)和產(chǎn)排膠過程。

我國屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹生長周期內(nèi)經(jīng)常遭受季節(jié)性干旱、低溫、臺風(fēng)等逆境的影響，這些逆境因子嚴(yán)重制約著巴西橡膠樹的膠乳產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)低溫、干旱、高鹽等逆境脅迫下，HbAIH的表達(dá)有不同程度上調(diào)，表明該基因可能參與了巴西橡膠樹逆境響應(yīng)過程。過氧化氫誘導(dǎo)的氧化脅迫下，HbAIH的表達(dá)明顯下調(diào)，表明該基因可能負(fù)向調(diào)控巴西橡膠樹氧化脅迫應(yīng)答。

4 結(jié)論

從巴西橡膠樹中克隆獲得HbAIH，其開放閱讀框1 137bp，編碼378 個氨基酸，預(yù)測其是一個親水性蛋白。HbAIH表達(dá)無組織特異性，在檢測的組織中均有表達(dá)。HbAIH可能參與巴西橡膠樹葉片生長發(fā)育、逆境應(yīng)答等過程，并可能參與橡膠樹死皮發(fā)生和膠乳再生的調(diào)控。