丟糟和磷礦粉高溫堆肥中耐高溫解磷菌的篩選及性能 分析

張芮瑞 邱樹(shù)毅 周少奇 王雪酈，4

（1. 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3. 貴州科學(xué)院，貴陽(yáng) 550001； 4. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

磷是植物生長(zhǎng)中不可缺少的大量元素，是農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的必要條件［1］，然而土壤中磷元素主要以難溶性形式存在，作物可利用率低［2］?；谖覈?guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀，迫切需要在現(xiàn)有磷礦資源水平上提高土壤中難溶性磷的利用效率，而解磷微生物是一類能夠?qū)⑼寥乐须y溶性的磷化合物轉(zhuǎn)化成植物可吸收利用的可溶性磷的微生物［3］?，F(xiàn)有報(bào)道中證明具有解磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌 等［4-8］，其中以芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudo-monas）、固氮菌（Azotobacter）、洋蔥伯克霍爾德菌（Burkhol-deria）、根瘤菌（Rhizobium）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）等為主的解磷細(xì)菌的數(shù)量和種類較多，而解磷真菌則以曲霉屬（Aspergillus）和青霉（Penicillium）等為主［9］。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域利用上述解磷微生物不僅可以提高磷素的轉(zhuǎn)化率和利用率，實(shí)現(xiàn)作物產(chǎn)量的增產(chǎn)，還能減少傳統(tǒng)磷肥施用過(guò)程因磷素流失對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染，解磷微生物的研究對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

近年來(lái)，雖有大量的解磷微生物被分析篩選及鑒定，但大多都是一些非耐高溫菌［4-8，10］，如果將它們應(yīng)用于高溫環(huán)境中，其生長(zhǎng)和解磷能力往往會(huì)受到限制，最終導(dǎo)致其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的可行性和廣泛性受到極大的影響。所以，為解決高溫環(huán)境中的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及環(huán)境修復(fù)等問(wèn)題，需要挖掘出能適應(yīng)高溫環(huán)境的解磷微生物。在我國(guó)，耐高溫解磷微生物主要從高溫堆肥樣品中分離篩選得到，同時(shí)也主要被應(yīng)用于高溫堆肥過(guò)程，如將篩選馴化后制成的耐高溫解磷菌劑接種于含磷固體廢棄物的好氧堆肥中，借耐高溫解磷菌等多種微生物的作用促使堆肥快速腐熟，實(shí)現(xiàn)含磷固體廢棄物的資源化利用［11-12］。因此，篩選更多具有耐高溫能力的解磷菌，構(gòu)建并完善極端解磷微生物的菌種資源庫(kù)，不僅可以為高溫條件下不同應(yīng)用背景中磷的轉(zhuǎn)化利用提供技術(shù)支撐，還可以緩解我國(guó)磷肥資源緊缺以及環(huán)境污染和生態(tài)破壞的壓力，具有很好的社會(huì)和生態(tài) 效益。

丟糟作為白酒生產(chǎn)中的主要有機(jī)廢棄物，不但含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的微生物菌群，是堆肥的理想原料［13］。本研究從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的角度出發(fā)，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基定向篩選，從丟糟和磷尾礦的高溫堆肥樣品中分離篩選耐高溫解磷微生物，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定和解磷能力比較，擬為適用于高溫環(huán)境條件下解磷微生物菌劑的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 篩選材料 樣品取自于以酒糟為主要原料，磷礦粉為輔料的高溫堆肥反應(yīng)堆（50℃-55℃），采集地點(diǎn)為貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要設(shè)備 101-1AB 電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BMJ-250C 培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；JJCJ-IFD 型超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；正置熒光顯微鏡：奧林巴斯 Olympus；FA-2004N 電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R 大容量冷凍離心機(jī)：美國(guó) Thermo Fisher 公司；721 可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C 型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；PCR 擴(kuò)增儀：德國(guó) Jena；核酸電泳儀：德國(guó) Jena。

1.1.3 主要試劑 細(xì)菌和真菌基因組 DNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。磷酸三鈣、葡萄糖、氯化鈉和瓊脂等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基：葡 萄 糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.5。其中以 Ca3（PO4）2作為磷源，需與其他藥品分開(kāi)滅菌后混合。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0-7.4。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯浸粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，瓊脂 14 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8-6.2

上述培養(yǎng)基的配方中去掉瓊脂即可制成對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐高溫解磷菌的分離及純化

1.2.1.1 初篩 稱取高溫階段（50-55℃）的堆肥樣品10 g，裝入有90 mL 無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)搖勻后，將三角瓶置于50℃搖床中振蕩培養(yǎng)30 min，作為母液。吸取1 mL 樣品母液于裝有 9 mL 無(wú)菌水的無(wú)菌試管中，依次按照 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的梯度進(jìn)行稀釋。取10-4，10-5，10-6三個(gè)梯度涂布于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度重復(fù)3 次，作為平行。將涂布好的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中于 50℃培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)后接種于斜面培養(yǎng)基并于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩得到的耐高溫解磷細(xì)菌接種于裝有50 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的100 mL 的三角瓶中，置于30℃，180 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，制備種子懸浮液，經(jīng)鏡檢菌種量約1×107CFU/mL。將初篩得到的耐高溫解磷真菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)數(shù)天至菌落布滿整個(gè)平板，加無(wú)菌水洗脫并用脫脂棉過(guò)濾，制備孢子懸浮液，經(jīng)鏡檢孢子量約為1×107CFU/mL。

將種子懸浮液或孢子懸浮液以 1% 接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，并以1%無(wú)菌水代替1%種子及孢子懸浮液接入作空白對(duì)照，重復(fù)3 次，作為平行。置于 50℃、180 r/min 恒溫振蕩器中培養(yǎng) 6 d 后取出，10 000 r/min 條件下離心 5 min，上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后采用鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵上清液中的磷含量［14］。

1.2.2 解磷微生物的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定［15-16］將純化好的斜面上的解磷細(xì)菌菌株分別點(diǎn)種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，2 d 后觀察單菌落特征，記錄其顏色、形狀、透明度、表面光澤度、邊緣特征、隆起程度等特征。經(jīng)革蘭氏染色，在奧林巴斯Olympus 正置熒光顯微鏡1 000×下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。

將純化好的斜面上的解磷真菌菌株分別點(diǎn)種在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7 d 不等，觀察菌落形態(tài)學(xué)特征。制作玻片，將1 滴乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液滴在干凈的載玻片中央，用無(wú)菌挑針挑取少許菌絲或孢子，蓋上蓋玻片，在奧林巴斯Olympus 正置熒光顯微鏡1 000×下觀察觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將活化后的解磷細(xì)菌菌株接入裝有50 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30℃，180 r/min 的搖床中振蕩2 d。以細(xì)菌基因組提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取 DNA。采用細(xì)菌 16S rDNA 通用上游引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)解磷細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。細(xì)菌 PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL：細(xì) 菌 DNA 模 板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。細(xì)菌 PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min 后，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將活化后的解磷真菌菌株接入裝有50 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30℃，160 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌絲球后用紗布過(guò)濾，收集菌絲球，再用無(wú)菌濾紙吸干水分，用液氮研磨成粉末。以真菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA 采用真菌通用上游引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和下 游 引 物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)解磷真菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。真菌 PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL：真 菌 DNA 模 板 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL。細(xì)菌 PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性 30 s，55℃退火 33 s，72℃延伸 2 min，33 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DNA 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果所得序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLASTn 分析比對(duì)，選取同源性較高的菌株序列作為參照。

1.2.3 耐高溫解磷菌的解磷特性

1.2.3.1 耐高溫解磷菌的解磷曲線 利用1.2.1.2 所述方法制備細(xì)菌種子懸浮液和真菌孢子懸浮液，分別以1%接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，并以1%無(wú)菌水代替1%種子及孢子懸浮液接入作空白對(duì)照，重復(fù)3 次，作為平行。置于 50℃、180 r/min 恒溫振蕩器中培養(yǎng)7 d，每 1 d 取樣5 mL，經(jīng)10 000 r/min 條件下離心 5 min，上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后用鉬銻抗比色法檢測(cè)各發(fā)酵液中的可溶性磷含量，繪制各耐高溫解磷菌株的解磷曲線。

1.2.3.2 溫度對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響 將細(xì)菌種子懸浮液和真菌孢子懸浮液以1% 的接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，分別置于 40、45、50、55、60℃ 下，置于180 r/min 恒溫振蕩器中培養(yǎng)至其解磷量分別出現(xiàn)最大值的天數(shù)，并以1%無(wú)菌水代替1%種子及孢子懸浮液接入作空白對(duì)照，重復(fù)3 次，作為平行。檢測(cè)各發(fā)酵液中可溶性磷含量。

1.2.3.3 pH 對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響 將細(xì)菌種子懸浮液和真菌孢子懸浮液以1% 的接種量接入 pH 值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，置于 50℃、180 r/min 恒溫振蕩器中培養(yǎng)至其解磷量分別出現(xiàn)最大值的天數(shù)，并以1%無(wú)菌水代替1%種子及孢子懸浮液接入作空白對(duì)照，重復(fù)3 次，作為平行。檢測(cè)各發(fā)酵液中可溶性磷含量。

2 結(jié)果

2.1 耐高溫解磷菌株的分離篩選

經(jīng)初篩和復(fù)篩純化后，從堆肥樣品中分離純化得到5 株形態(tài)各異的耐高溫解磷菌株，分別為耐高溫解磷細(xì)菌GDB1 和GDB2 以及耐高溫解磷真菌GDF1、GDF2 和GDF3。

經(jīng)50℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d 后，通過(guò)鉬銻抗比色法測(cè)定上述菌株的解磷能力，其解磷量范圍在 135.52-164.06 μg/mL，其中以GDF1 的解磷量最大，為164.06 μg/mL。試驗(yàn)表明5 株菌株在高溫環(huán)境下均對(duì)磷酸鈣有較強(qiáng)的溶解能力，且解磷能力在經(jīng)歷多次傳代培養(yǎng)后并未出現(xiàn)減弱的情況。

2.2 耐高溫解磷菌株的鑒定

2.2.1 耐高溫解磷菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 各菌株的菌落形態(tài)如圖1 所示，鏡檢圖如圖2 所示。

GDB1 在NA 培養(yǎng)基平板上，單菌落呈不規(guī)則圓形，顏色為灰白色或者略帶一些黃色，表面不濕潤(rùn)粗糙，無(wú)光澤，有較多隆起、皺褶等；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢顯示，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性（G+）桿菌。 GDB2 在NA 培養(yǎng)基平板上，單菌落呈不規(guī)則圓形，顏色為灰白色，表面濕潤(rùn)且分泌較黏稠液體，有光澤，易挑起；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢顯示，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性（G+）桿菌。GDF1 在PDA 培養(yǎng)基平板上，單菌落呈圓形，凸起絮狀，菌落中心部分呈微黃色，菌絲為白色、質(zhì)密，背面呈淡黃色；經(jīng)石炭酸棉蘭染色，顯微鏡結(jié)果清晰可見(jiàn)菌絲體和分生孢子，分生孢子梗呈瓶頸狀，小型分生孢子較多，自側(cè)生分生孢子梗產(chǎn)生，以鏈狀著生于散生或聚生的孢子梗上，呈橢圓至卵圓形。

圖1 耐高溫解磷微生物菌落形態(tài)

圖2 耐高溫解磷微生物鏡檢圖（×1 000）

GDF2 在PDA 培養(yǎng)基平板上，單菌落呈圓形，絨毛狀，生長(zhǎng)初期菌落中心部分呈淡綠色，后期呈深綠色，且邊緣泛白色，背面呈蒼白色或淡黃色；經(jīng)石炭酸棉蘭染色，顯微鏡結(jié)果清晰可見(jiàn)分生孢子梗，各分枝頂端著生球形孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)大量球形、橢圓形、壁薄、光滑的孢囊孢子。

GDF3 在PDA 培養(yǎng)基平板上，單菌落呈圓形，絨毛狀，菌落中心部分呈白色，四周呈灰黃色，且邊緣為乳白色，背面呈蒼白色或淡黃色；經(jīng)石炭酸棉蘭染色，顯微鏡結(jié)果清晰可見(jiàn)分生孢子梗，不分枝的球形分生孢子的末端形成分生孢子鏈。

2.2.2 耐高溫解磷菌株的分子學(xué)鑒定結(jié)果 通過(guò) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，將測(cè)序得到的2 株解磷細(xì)菌16S rDNA 序列及3 株解磷真菌ITS 區(qū)域基因序列與其他菌株進(jìn)行序列比對(duì)分析，再通過(guò)MEGA 5.0 軟件，將5 株解磷微生物與其同屬親緣關(guān)系較近的模式菌株進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果得到如圖3、4 所示的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖3 基于16S rDNA 序列的解磷細(xì)菌GDB1 和GDB2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDB1 與命名為KU922443 的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高，其相似度為 99.90%；GDB2 與命名為KF158804 的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，其相似度為 99.50%；結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF1 與命名為MG458699 的多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）同源性最高，其相似度為 100.00%；GDF2 與命名為MK732095 的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）同源性最高，其相似度為100.00%；GDF3 與命名為MK299125 的構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）同源性最高，其相似度為100.00%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果［17-19］，基本可判定各菌株的菌種名稱。

結(jié)合菌落及菌株的形態(tài)特征及16S rDNA 或ITS 序列分析結(jié)果，分別將GDB1、GDB2、GDF1、GDF2 及GDF3 鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）及構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）。

2.3 耐高溫解磷菌的解磷特性

2.3.1 耐高溫解磷菌的解磷曲線 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用磷酸三鈣為唯一磷源，在50℃高溫下對(duì)其進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，采用鉬銻抗比色法測(cè)定了不同耐高溫解磷菌的解磷能力，并繪制解磷曲線（圖 5）。

圖4 基于ITS 序列的解磷真菌GDF1、GDF2 和GDF3 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 耐高溫解磷菌解磷量的變化

如圖5 所示，5 株耐高溫解磷菌在 7 d 液態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液內(nèi)可溶性磷含量總體均呈先增加，后逐漸減少的變化趨勢(shì)。5 株耐高溫解磷菌發(fā)酵液中的可溶性磷含量在 0-2 d 內(nèi)均變化顯著，分別迅速升高至 115.26 μg/mL、134.48 μg/mL、142.26 μg/mL、104.37 μg/mL 及126.83 μg/mL。然后隨時(shí)間緩慢增加，GDB2、GDF1 和GDF3 發(fā)酵液中可溶性磷含量在第4 天達(dá)到最高，分別為159.44 μg/mL、174.33 μg/mL和136.85 μg/mL。GDF2 發(fā)酵液中可溶性磷含量在第5 天達(dá)到最高，為158.90 μg/mL；GDB1 發(fā)酵液中可溶性磷含量在第6 天達(dá)到最高，為145.13 μg/mL。表5 說(shuō)明各菌株達(dá)到最大解磷量的時(shí)間具有一定差異性，而這種變化主要來(lái)源于菌種種類的差異，不同菌株其生長(zhǎng)代謝速率及其生長(zhǎng)曲線是不同步的。當(dāng)所有耐高溫解磷菌發(fā)酵液中可溶性磷含量逐漸增加并達(dá)到最大值后，可溶性磷含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均有明顯下降。

2.3.2 溫度對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響 溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一，主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物的形成、發(fā)酵液的物理性質(zhì)和生物合成方向等方面。由圖6 可知，隨著溫度的升高，各耐高溫解磷微生物的解磷量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。篩選得到的5 株菌耐熱范圍較廣，在 40℃-60℃溫度范圍內(nèi)均具有解磷能力，均在50℃時(shí)出現(xiàn)最佳解磷效果，GDB1 為145.55 μg/mL，GDB2 為159.77 μg/mL，GDF1 為175.21 μg/mL，GDF2 為160.52 μg/mL，GDF3 為150.12 μg/mL。 在某些溫度范圍條件下，發(fā)酵液中解磷量較高，說(shuō)明此溫度范圍有利于菌株的解磷作用，其中以GDB2和GDF2 的最適解磷溫度范圍最廣，40℃-55℃下均有較好的解磷能力；GDF1 和GDF3 在55℃下也有一定的解磷量，而GDB1 在55℃時(shí)的解磷量較50℃有明顯下降，僅為62.52 μg/mL。5 株菌在60℃時(shí)雖保持著一定解磷能力，但解磷量均出現(xiàn)大幅度下降，其中GDF1 的解磷量最低，僅為29.53 μg/mL。該結(jié)果說(shuō)明所篩的5 株解磷微生物均屬于耐高溫微生物，可在高溫環(huán)境下保持較好的解磷能力，且最適解磷溫度均為50℃。

圖6 溫度對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響

2.3.3 初始pH 對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響 微生物的生長(zhǎng)繁殖和生物合成通常都在一個(gè)最適的和最能耐受的pH 范圍，pH 不僅影響微生物生物膜表面電荷的性質(zhì)及通透性，而且還影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，因此不同初始pH 值對(duì)耐高溫解磷菌株解磷量的影響研究具有重要意義。由圖7可知，各耐高溫菌株均對(duì)培養(yǎng)液 pH 值表現(xiàn)出較廣泛的適應(yīng)能力，初始pH 值范圍在 4-9 時(shí)都具有一定的解磷能力。隨著初始pH 值的升高，各耐高溫解磷微生物的解磷量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中GDB1、GDB2 和GDF1 在初始pH 值為4-6 時(shí)，解磷量大小與初始pH 值高低呈正相關(guān)，在初始pH值為6.0 時(shí)，解磷量達(dá)到最高，分別為163.36 μg/mL、179.49 μg/mL 及191.22 μg/mL，當(dāng)初始pH＞6.0 時(shí)，解磷量大小與初始pH 值高低呈負(fù)相關(guān)，在初始pH 值為9.0 時(shí)，解磷量低至91.47 μg/mL、138.81 μg/mL 和137.48 μg/mL，說(shuō)明這3 株耐高溫解磷微生物在實(shí)際應(yīng)用中適用于偏酸性環(huán)境。然而，GDF2 和GDF3 在初始pH 值為4-7 時(shí)，解磷量隨初始pH 值的增加而增加，在初始pH 值為7.0 時(shí)，解磷量達(dá)到最高，分別為159.61 μg/mL 及148.62 μg/mL，當(dāng)初始pH＞7.0 時(shí)，解磷量隨初始pH 值的增加明顯下降，在初始pH 值為9.0 時(shí)，解磷量低至111.69 μg/mL 和110.19 μg/mL，說(shuō)明這2 株耐高溫解磷微生物在實(shí)際應(yīng)用中適用于中性環(huán)境。

圖7 初始pH 值對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響

3 討論

目前，研究者們已從不同樣品中分離得到多種具有耐高溫能力的解磷微生物。Chang 等［20］以生物質(zhì)堆肥為分離樣品，并經(jīng)過(guò)一系列解磷實(shí)驗(yàn)得到具有耐高溫解磷能力的3 株細(xì)菌，斯密氏芽孢 桿 菌（Bacillus smithii，F(xiàn)18）、凝 結(jié) 芽 孢 桿 菌（Bacillus coagulans，C45）及地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，A3）；1 株放線菌，Sphaerobacter ther-mophilusJ57；1 株真菌，煙曲霉（Aspergillus fumigatus，O4），其中斯密氏芽孢桿菌（Bacillus smithii，F(xiàn)18）在50℃下解磷量最高可達(dá)544.2 μg/mL。楊天學(xué)等［12］從添加磷礦粉的高溫堆肥樣品中分離篩選到2 株具有較高解無(wú)機(jī)磷性能的耐高溫解磷菌，分別為軟化芽孢桿菌（Bacillus.Macerans）和巨大芽孢桿菌（Bacillus.Megaterium），在50℃下解磷量最高分別可達(dá)到263.8 和 242.0 μg/mL。目前所篩的耐高溫解磷細(xì)菌多以芽孢桿菌屬為主，本研究中所篩的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GDB1 和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）GDB2 也均屬于該類，主要是因?yàn)檠挎邨U菌能形成對(duì)環(huán)境溫度具有很強(qiáng)抗性的芽孢，借助芽孢結(jié)構(gòu)的“保護(hù)”機(jī)制使得高溫解磷微生物在高溫條件下也能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝。然而，耐高溫解磷真菌以曲霉屬的研究報(bào)道居多，本研究中所篩的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）GDF2 及構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）GDF3 也均屬于該類。

將本研究所篩菌株的解磷能力與對(duì)應(yīng)菌株早期報(bào)道的解磷研究進(jìn)行比較，結(jié)果如表1 所示。

由表1 可知，在相關(guān)解磷微生物的報(bào)道中，除多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）外，其余4 株菌在非高溫條件下均具有良好的解磷性能；而在高溫極端環(huán)境下，所篩的5 種解磷菌株中只有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）解磷效果良好，構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）在高溫條件下的解磷能力并未報(bào)道。多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）更是首次被證實(shí)為解磷微生物，且具有良好的耐受高溫的能力，能作為耐高溫解磷微生物進(jìn)行深入研究。

表1 本研究所篩菌株在解磷方面的早期研究情況

目前有報(bào)道指出，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及常用的16S rDNA 鑒定對(duì)芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的菌株而言，很難證實(shí)種水平上的鑒定，因?yàn)檠挎邨U菌屬（Bacillussp.）內(nèi)的部分菌種間無(wú)論是表型上還是同源性上都很類似，還需進(jìn)一步鑒定。比如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）與其相近菌種就具有很高的同源性，目前己從枯草芽孢桿菌中分化出萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）等3 個(gè)菌種及2 個(gè)亞種［26］。為了對(duì)芽孢桿菌屬（Bacillussp.）進(jìn)行進(jìn)一步的研究分類，增加鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性，相繼出現(xiàn)了很多方法，比如利用yya0 基因在tetL 的位置來(lái)區(qū)別鑒定解淀粉芽飽桿菌和枯草芽飽桿菌［26］；擴(kuò)增gyrB、rpoB 等靶基因片段進(jìn)一步對(duì)比同源性，以確定其種類［27-28］。本研究中所涉及的兩株芽孢桿菌屬（GDB1和GDB2）可于后期參照上述方法進(jìn)行再次驗(yàn)證，增加鑒定的可靠性。

解磷曲線的繪制實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)后期發(fā)酵液中可溶性磷含量出現(xiàn)不增反減的原因主要有兩點(diǎn)，第一是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗滿足發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的變化規(guī)律，培養(yǎng)基內(nèi)底物濃度下降至最低值，微生物生長(zhǎng)代謝變緩，發(fā)酵液中可溶性磷含量不再增加；第二，微生物為滿足自身生長(zhǎng)代謝需要，將已轉(zhuǎn)化為可溶性的有效磷作為底物消耗，用于核酸的合成等，以上兩個(gè)因素導(dǎo)致發(fā)酵液中可溶性磷含量在發(fā)酵后期出現(xiàn)不增反減的現(xiàn)象［14］。

5 株耐高溫解磷菌中，以真菌GDF1 的解磷能力最優(yōu)，在發(fā)酵第4 天達(dá)到174.33 μg/mL；細(xì)菌GDB1和GDF2 的解磷能力次之，分別在發(fā)酵第4 天達(dá)到159.44 μg/mL 和在發(fā)酵第6 天達(dá)到158.90 μg/mL。從結(jié)果來(lái)看，所篩的耐高溫解磷細(xì)菌和解磷真菌在解磷能力上并無(wú)太大差異，與趙小蓉等［29］研究提及的解磷真菌比解磷細(xì)菌解磷效果顯著的結(jié)果不一致，這可能是由于不同種屬的不同菌株在高溫條件限制下其解磷機(jī)制與普通條件下有所差異，比如酸解機(jī)制中由于高溫導(dǎo)致代謝分泌的有機(jī)酸種類及濃度發(fā)生變化，從而對(duì)難溶性無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷的過(guò)程產(chǎn)生正向或負(fù)向的影響，最后導(dǎo)致上述結(jié)果。

本研究具有兩個(gè)創(chuàng)新性的試驗(yàn)結(jié)果：第一，多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）是第一次被證實(shí)具有解磷能力，且可作為耐高溫解磷微生物；第二，首次就構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的高溫解磷能力進(jìn)行研究。本研究篩選獲得的其他3 株解磷微生物其高溫解磷能力雖早有報(bào)道，但與已有文獻(xiàn)相比，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）GDB2 和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）GDF2 在50℃時(shí)的解磷 量 最 高 分 別 可 達(dá)159.44 μg/mL 和158.90 μg/mL，該值較Chang 等［20］所篩地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，A3）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus，O4）在50℃下 的 最 高 解 磷 量80.2 μg/mL 和11.6 μg/mL 有明顯提高。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GDB1 最高解磷量可達(dá)145.13 μg/mL，該解磷能力在芽孢桿菌屬的耐高溫解磷菌株［12，30］中屬良好水平。

本實(shí)驗(yàn)篩得的5 株耐高溫解磷菌最佳解磷能力均在150 μg/mL 左右，除煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是致病菌不宜作為應(yīng)用于土壤的微生物外，其余4 株均是具有較高解磷能力的菌種，可作為應(yīng)用于高溫環(huán)境下的新型微生物制劑的潛在原料，為推動(dòng)耐高溫解磷微生物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

（1）本研究選取添加了磷尾礦粉和酒糟的高溫堆肥樣品為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，成功從中分離篩選出5 株耐高溫解磷菌株。通過(guò)微生物形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)和理論，初步鑒定菌株GDB1、GDB2、GDF1、GDF2 及GDF3 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）及構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）。

（2）將所篩的5 株耐高溫解磷微生物置于以磷酸三鈣為唯一磷源的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，在 50℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d，作其解磷曲線，測(cè)得GDB1、GDB2、GDF1、GDF2 和GDF3 的最大解磷量分別為 145.13 μg/mL、159.44 μg/mL、174.33 μg/mL、158.90 μg/mL 和136.85 μg/mL。

（3）本研究探討了溫度對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響，研究結(jié)果顯示，5 株耐高溫解磷微生物溫度耐受范圍較廣，在40℃-60℃之間均可生長(zhǎng)，但在50℃時(shí)其解磷能力均達(dá)到最大值。

（4）通過(guò)初始pH 對(duì)耐高溫解磷菌解磷量的影響研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液初始pH 值為6 時(shí)，GDB1、GDB2 和GDF1 的解磷效果最佳，當(dāng)培養(yǎng)液初始pH值為7 時(shí)，GDF2 和GDF3 的解磷效果最好。