辣椒根際促生菌的分離篩選及抗病促生特性研究

楊茉 高婷 李滟璟 魏崇瑤 高淼 馬蓮菊

（1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

辣椒（Capsicum annuumL.）為一年生或有限多年生草本植物，屬于茄科辣椒屬，富含維生素及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有解熱、鎮(zhèn)痛、增加食欲、幫助消化、降脂減肥、預(yù)防腫瘤等功效。隨著辣椒種植面積的不斷擴(kuò)大，連作現(xiàn)象十分普遍，長(zhǎng)期連作使土壤從“細(xì)菌型”的高肥土壤轉(zhuǎn)化成性質(zhì)不良的“真菌型”土壤，土傳病原菌日漸積累［1-2］，導(dǎo)致辣椒病害加劇，嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量，造成20%-50%，甚至高達(dá)70%的減產(chǎn)，已嚴(yán)重影響和制約辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展［3］。目前辣椒病害的防治方法主要是使用化學(xué)藥劑，長(zhǎng)期使用化學(xué)試劑不但造成環(huán)境污染，而且威脅人畜健康［4］。研究表明生物防治具有綠色、安全、高效等特點(diǎn)，是最為理想的防治方法之一［5］。

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類生活在植物根際，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量的微生物統(tǒng)稱［6］。PGPR 數(shù)量巨大，種類繁多，不僅對(duì)植物有顯著的促生長(zhǎng)作用，對(duì)抑制土傳病害發(fā)生、增強(qiáng)植物抗逆境脅迫能力、改善和維護(hù)土壤生態(tài)質(zhì)量具有重要作用［7-9］。PGPR 定殖到植物根際或進(jìn)入植物體內(nèi)后，可通過(guò)產(chǎn)抗生素、產(chǎn)水解酶、釋放揮發(fā)性抑菌氣體、誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性（ISR）、分泌鐵載體、分泌植物激素、固氮等機(jī)理，有效抑制病原菌生長(zhǎng)，克服土傳病害及達(dá)到促生增產(chǎn)的功效［7，10］。劉澤平等［11］從水稻根際土壤分離得到6 株P(guān)GPR 菌株，研究發(fā)現(xiàn)6 株菌株均能產(chǎn)生生長(zhǎng)素，其中LZP03、LZP05 和LZP06 具有較強(qiáng)促生能力。容良燕等［12］將PGPR 菌株制成復(fù)合接種劑施于玉米田間，玉米株高、穗長(zhǎng)、穗粗、單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均有提高，并能代替20%-30%化肥。蔣永梅［13］從辣椒等4 種植物根際分離篩選了56 株P(guān)GPR 菌株，其中辣椒根際分離篩選出6 株固氮菌和9 株溶磷菌。呂雅悠等［14］用PGPR 菌株A21-4 灌根處理辣椒，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組辣椒植株成株期莖粗、根系活力和葉綠素含量顯著提高，辣椒果實(shí)的蛋白質(zhì)、維生素C 和硝態(tài)氮的含量也均有提高，且辣椒根系土壤的速效氮、磷、鉀含量等顯著提高。張楊等［15］利用具有產(chǎn)IAA 和ACC 脫氨酶能力的辣椒PGPR 菌株研制成生物育苗基質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)添加菌株的生物基質(zhì)對(duì)辣椒苗有提高根系定殖和促幼苗生長(zhǎng)的能力，且對(duì)移苗后的生長(zhǎng)仍具有顯著的促進(jìn)作用并能有效在根系定殖。

本研究從江蘇省徐州市豐縣辣椒根際土壤中分離根際促生菌，研究其固氮、解磷、促生和抗病能力，旨在篩選高效優(yōu)質(zhì)的多功能根際促生菌，為辣椒根際促生菌作為生物肥料和生物農(nóng)藥的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品及病原菌來(lái)源 供試土樣：2018 年8 月采自江蘇省徐州市豐縣。將采集樣品分別裝入無(wú)菌紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離。

供試病原菌：立枯絲核菌Rhizoctonia solani、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian、辣椒炭疽菌Colletotrichum capsici bulterg和辣椒鐮孢菌Fusarium oxysporum由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L；Ashby培 養(yǎng) 基：KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO45 g，甘露醇10 g，CaSO40.1 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；PKO 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，MnSO40.03 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.5 g，Ca3（PO4）25 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.8-7.0；孟金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蛋 黃 卵磷脂0.2 g，CaCO35 g，酵母膏0.4 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；Salkowski 比色液：FeCl34.5 g，溶于10.8 mol/L 濃H2SO4硫酸中，冷卻后定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 PGPR 菌株的分離純化 供試土樣于2018 年8 月采自江蘇省徐州市豐縣生長(zhǎng)的健康辣椒植株根際，將樣品裝入無(wú)菌紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存。取辣椒根際土10 g，放入帶有玻璃珠的90 mL 生理鹽水中，180 r/min 震蕩30 min，梯度稀釋后涂布于牛肉膏平板和Ashby 平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑取形態(tài)不同菌落進(jìn)一步純化，純化后轉(zhuǎn)接至斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PGPR 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，觀察記錄各細(xì)菌菌落形狀、大小、顏色等特征，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 采用菌落PCR 方法擴(kuò)增16S rDNA。引物采用16S rDNA 的通用引物，由上海生工合成，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′， 采 用50 μL PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由生物工程（上海）股份有限公司完成，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)測(cè)序結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株特性測(cè)定

1.2.3.1 解磷特性測(cè)定 采用透明圈法，將純化的菌株分別點(diǎn)接至PKO 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和孟金娜有機(jī)磷平板，每組3 次重復(fù)，28℃培養(yǎng)14 d，測(cè)量解磷透明圈的直徑與菌落直徑，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑比值D/d 和E/e。

1.2.3.2 分泌IAA 能力 測(cè)定將菌株接種于含L-色氨酸（100 mg/L）的液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min避光震蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值，計(jì)算菌體生長(zhǎng)量。將菌懸液以10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液加入等體積Salkowski 比色液，避光靜置30 min，測(cè)定其OD530值。計(jì)算菌濃度OD600值=1 時(shí)，單位體積發(fā)酵液中IAA 含量。

分別測(cè)定各濃度3-吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液OD530值，繪制IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各菌株分泌IAA 濃度。

1.2.3.3 抗病能力測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法，將病原菌菌餅（直徑5 mm）接種于PDA 平板，將待測(cè)細(xì)菌點(diǎn)接至距病原菌3.5 cm 處，以不接種細(xì)菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。平板置于30℃下培養(yǎng)5-7 d，待對(duì)照組菌落長(zhǎng)滿全皿時(shí)，測(cè)量每個(gè)細(xì)菌的抑菌圈半徑，計(jì)算其抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照組病原菌菌落半徑-處理組病原菌菌落半徑）/對(duì)照組病原菌菌落半徑×100%

2 結(jié)果

2.1 PGPR菌株的分離篩選

從辣椒根際土中共分離到58 株細(xì)菌，經(jīng)進(jìn)一步篩選，最終得到13 株具有固氮功能的根際促生菌，其菌株編號(hào)分別為T22、N1、N3、N7、N8、N9、N12、N16、N26、N29、N30、N31、N32。

2.2 PGPR菌株的鑒定

經(jīng)16S rDNA 序 列BLAST 比 對(duì)，13 株 細(xì) 菌 中T22（MN555349）、N3（MN555366）、N7（MN555367）、N8（MN555368）、N9（MN555369）、N12（MN555375）和N32（MN555373）屬于Bacillus，N29（MN559430）屬 于Pseudomonas，N1（MN555365） 屬 于Lelliottia，N16（MN555377） 屬 于Siccibacter，N26（MN555435）屬于Achromobacter，N30（MN555371）屬 于Microbacterium，N31（MN555372） 屬 于Paenibacillus。用MEGA7.0 構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖1。

2.3 辣椒PGPR菌株解磷能力

2.3.1 解有機(jī)磷能力 在13 株辣椒PGPR 菌中，有7 株菌具有解有機(jī)磷能力，可以在孟金娜有機(jī)磷平板上形成透明圈，其中N1、N16 和N30 解有機(jī)磷能力顯著高于其他菌株，能力最強(qiáng)的菌株為N16，D/d值為1.72±0.30（表1）。

2.3.2 解無(wú)機(jī)磷能力 在13 株辣椒PGPR 菌中，有5 株菌可解無(wú)機(jī)磷，可以在PKO 無(wú)機(jī)磷平板上形成透明圈，其中N3 菌株的解無(wú)機(jī)磷能力最強(qiáng)，E/e 值為1.47（表1）。

2.3.3 分泌IAA 能力 在13 株P(guān)GPR 菌株中，菌株 N1、N16 和N32 具有產(chǎn)生 IAA 能力，其中N1 菌株產(chǎn) IAA 能力顯著高于其他菌株，達(dá)到18.49 μg/mL （表2）。

2.3.4 抗病能力 在13 株P(guān)GPR 菌株中，具有對(duì)辣椒病原菌拮抗能力的菌株5 株，分別為T22、N1、N7、N12 和N16。菌株T22 和N12 對(duì)被測(cè)4 種辣椒病原菌均有拮抗效果，而菌株N1、N7 和N16 只對(duì)其中的兩種病原菌具有拮抗效果。菌株T22 對(duì)立枯絲核菌和辣椒疫霉菌的抑菌率均可達(dá)到50%以上；菌株N7 和N16 對(duì)立枯絲核菌的拮抗能力較好，抑菌率分別達(dá)到74.98±3.10%和75.87±2.69%；菌株N12 對(duì)立枯絲核菌、辣椒疫霉菌和辣椒鐮孢菌3 種病原菌的拮抗能力均較強(qiáng)，抑菌率可達(dá)到55%以上（表3）。

圖1 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的13 株辣椒PGPR 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 13 株P(guān)GPR 菌的解磷結(jié)果

表2 13 株P(guān)GPR 菌分泌IAA 測(cè)定結(jié)果

3 討論

以往人們?yōu)樽非罄苯吩霎a(chǎn)而過(guò)分依賴化肥和農(nóng)藥，對(duì)環(huán)境和土壤造成較多負(fù)面影響，現(xiàn)在已經(jīng)意識(shí)到生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要性，開始尋找化肥和農(nóng)藥的替代品。研究表明PGPR 菌株具有固氮、溶磷、產(chǎn)生嗜鐵素和分泌植物激素等能力，對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用［16］。徐姍姍［17］將PGPR 菌液接種于煙草幼苗中，對(duì)煙草幼苗有顯著的促生效果，也有學(xué)者將PGPR 菌株制成菌肥作用于非宿主植物貓尾草和小黑麥上，貓尾草莖粗增加33.74%，小黑麥根平均直徑和體積分別增加22.5%和152%，有明顯的促生效果［18］。張英等［19］篩選優(yōu)良牧草PGPR 菌株，獲得固氮菌71 株、溶解無(wú)機(jī)磷菌株73 株和溶解有機(jī)磷菌株78 株。本研究篩選僅得到13 株P(guān)GPR 菌株，13 株均具有固氮能力，7 株可解有機(jī)磷，5 株可解無(wú)機(jī)磷，分析原因可能是由于植物本身特性、不同地理氣候、土壤理化性質(zhì)等因素對(duì)根際微生物的數(shù)量產(chǎn)生的影響不同造成的［20-21］。徐偉慧等［22］在研究西瓜PGPR 菌株分泌激素能力和菌株間拮抗作用中發(fā)現(xiàn)，12 株P(guān)GPR均能分泌IAA，制成復(fù)合菌劑接種于西瓜幼苗，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌劑R2 對(duì)西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根部干重分別提高191.8%、302.4%、160.0%、206.5%和139.6%，具有明顯的促生效應(yīng)。本研究篩選到的PGPR 菌株N1、N3 和N16 可分泌IAA，其中N1 分泌IAA 可達(dá)到18.49 μg/mL，說(shuō)明這3 株P(guān)GPR 菌株對(duì)植物生長(zhǎng)有潛在的促生能力。

表3 5 株辣椒PGPR 菌對(duì)辣椒病原菌的拮抗效果

研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用PGPR 菌株不僅能有效提高植物產(chǎn)量，PGPR 菌株對(duì)植物病害還有較好的生防功能。李海云等［23］篩選獲得的57 株P(guān)GPR 菌株中有固氮菌24 株，溶磷菌33 株，其中NCRP2 菌株對(duì)小麥長(zhǎng)蠕孢病菌Helminthosporium triticivulgaris、番茄早疫病菌Alternaria solani、黃瓜枯萎病菌F. oxysporum、馬鈴薯立枯絲核病菌R. solani、油菜菌核病菌Sclerotinias clerotiorum和玉米小斑病菌Bipolaria maydis均有抑制作用。Gowtham等［24］在溫室實(shí)驗(yàn)中用PGPR 菌株對(duì)辣椒種子進(jìn)行預(yù)處理并接種病原菌C. truncatum，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組抗病效果顯著，其中B. amyloliquefaciens抗病率最高達(dá)到71%，且與對(duì)照組相比，PGPR 菌株處理過(guò)的辣椒種子的發(fā)芽率、幼苗活力、株高、鮮重、干重和葉片數(shù)均有不同程度的提高。本研究13 株P(guān)GPR菌 種 中T22、N3、N7、N8、N9、N12 和N32 都 屬于Bacillus，且T22、N7 和N12 都對(duì)病原菌有較強(qiáng)的拮抗能力，T22 和N12 對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的4 種病原菌均有拮抗功能，N7 對(duì)R. solani的拮抗率高達(dá)74.98±3.10%。PGPR 菌株綠膿假單胞菌SLC-2 和枯草芽孢桿菌YJ20 能有效拮抗9 種病原真菌，抑制病原真菌菌絲和孢子的正常生長(zhǎng)；兩菌株處理感染尖孢鐮刀菌的紫花苜蓿后，可以顯著提高紫花苜蓿木質(zhì)素、抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD、PAL、LOX）以及病程相關(guān)蛋白含量（幾丁質(zhì)酶、β-1，3 葡聚糖酶），提高紫花苜蓿抗病能力［25］。本研究中，菌 株T22、N1、N7、N12 和N16 能 有 效 拮 抗4 種辣椒病原真菌，抑制病原菌正常生長(zhǎng)，表示這5 株P(guān)GPR 菌株對(duì)植物生長(zhǎng)有潛在的抗病能力。

研究表明當(dāng)PGPR 菌株實(shí)際應(yīng)用于作物時(shí)，其性能將會(huì)受到土壤、植物、氣候、溫度、土壤微生物等諸多因素影響，因此本研究中所得PGPR 菌株還需要盆栽實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從江蘇省徐州市豐縣辣椒根際土壤中分離篩選出13 株P(guān)GPR 菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA 序列比對(duì)鑒定分別屬于Bacillus、Pseudomonas、Lelliottia、Siccibacter、Achromobacter、Microbacterium和Paenibacillus；13 株P(guān)GPR 菌株均有固氮功能，其中7 株可解有機(jī)磷，5 株可解無(wú)機(jī)磷，3 株具有分泌IAA 能力，5 株具有抗病能力。