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    基于數(shù)字PCR 的不同品種鴨組織中線粒體與核DNA拷貝數(shù)差異研究

    2020-06-09 08:43:00紀(jì)藝徐曉麗姜媛媛汪小福徐俊鋒李玥瑩陳笑蕓
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:腿肉微滴麻鴨

    紀(jì)藝 徐曉麗 姜媛媛 汪小福 徐俊鋒 李玥瑩 陳笑蕓

    (1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,沈陽(yáng) 110034;2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310021)

    食品安全關(guān)乎人們的身體健康和生命安全,已經(jīng)成為當(dāng)前全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)肉制品摻假屢禁不止,肉制品以次充好,引起人們對(duì)食品安全的高度關(guān)注[1]。肉及肉制品動(dòng)物源性成分核酸檢測(cè)是判斷摻假肉的最常用技術(shù)之一[2]。與核DNA相比,線粒體DNA 具有其特殊的母系遺傳方式和胞內(nèi)多拷貝帶來(lái)的高靈敏度檢測(cè)的特征,因此,除被廣泛用于飼料、生鮮及肉制品的來(lái)源追蹤和物種成分鑒別等研究外,線粒體DNA 在國(guó)內(nèi)外還被用于摻假肉類的定量檢測(cè)[3-7]。

    鴨肉是我國(guó)較為便宜的畜牧業(yè)肉類品種,也是最常見的被用于摻假的肉品。近年來(lái),在國(guó)內(nèi)外PCR 技術(shù)在肉類摻假以及肉類品種來(lái)源分析中以及得到廣泛應(yīng)用[8-9]。林霖等[10]構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法用于檢測(cè)番鴨、家鴨DNA 成分,為識(shí)別摻假肉類提供了技術(shù)支持。但是,熒光定量PCR 需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線,由于不同組織中線粒體的拷貝數(shù)不同[11-12],使得基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測(cè)存在客觀的技術(shù)局限性。微滴式數(shù)字PCR 可以通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理,對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

    本研究通過(guò)數(shù)字PCR 技術(shù)測(cè)定不同品種鴨不同組織中線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數(shù),對(duì)線粒體和核DNA 的拷貝數(shù)比值進(jìn)行分析,旨在探尋鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最佳組織來(lái)源,并為檢測(cè)機(jī)構(gòu)定量鴨肉摻假比例篩選合適的靶DNA 提供一定的 借鑒。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    不同品種(紹興鴨、北京鴨、縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨、金定麻鴨、山麻鴨、GD-紹興鴨和馬太湖鴨)的生鮮鴨來(lái)源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,其中北京鴨和紹興鴨的取樣組織包括鴨血、鴨胸、鴨肝、鴨皮、鴨心及鴨腿;縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨和GD-紹興鴨的取樣組織包括鴨胸和鴨腿;山麻鴨、金定麻鴨、攸縣鴨和馬太湖鴨的取樣組織為鴨血。

    動(dòng)物組織DNA 試劑盒購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司;血液DNA 提取試劑盒購(gòu)自浙江易思得生物科技有限公司;預(yù)混液ddPCR Supermix for Probes 和Droplet Generation Oil for Probes 購(gòu) 自 美 國(guó)Bio-Rad;引物和探針由杭州尚亞賽生物科技有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品處理和DNA 提取 用無(wú)菌手術(shù)刀將試驗(yàn)材料切成小塊,先在液氮中將樣品迅速冷凍并研磨成粉末。按照試劑盒說(shuō)明書的要求稱取一定量的樣品,采用相應(yīng)的試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行 DNA 提取,每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)。

    1.2.2 DNA 濃度、純度和鹽殘留測(cè)定 各取1 μL 的DNA 樣品溶液用Qubit 2.0 進(jìn)行DNA 的濃度檢測(cè),利用NanoDrop 2000 進(jìn)行純度和鹽殘留等指標(biāo)的 檢測(cè)。

    1.2.3 鴨源性微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)體系的建立 鴨線粒體基因和核單拷貝基因的PCR 引物和探針序列參考文獻(xiàn)合成[13],線粒體12S rRNA 基因的上游引物序列為5′-GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC-3′;下游引物序列為5′-GACCTGTCTTATTAGCGGGGTGCTG-3′;探針序列為FAM-CCCTAAATCTTGATACTTACCCTACCGAA-BHQ1;IL-2 核基因的上游序列為5′-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3′,下 游 序列 為5′-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3′,探針序列為FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1。將上述提取的不同鴨組織DNA 稀釋至同一濃度后作為模板,進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)。PCR 體系為20 μL,含前述步驟所得的DNA 模板2 μL,2×ddPCR Supermix for Probes 反應(yīng)液10 μL,10 μmol/L 的上下游引物各1 μL,10 μmol/L 的探針0.5 μL,其余用ddH2O 補(bǔ)足到20 μL。

    PCR 反應(yīng)程序中退火溫度的高低對(duì)微滴下雨現(xiàn)象有顯著的影響,在反應(yīng)程序的退火環(huán)節(jié),設(shè)置了溫度梯度。根據(jù)PCR 反應(yīng)的熱圖,鴨源性基因組DNA 在不同的退火溫度下,微滴的熒光強(qiáng)度存在較顯著差異(圖1)。比較不同退火溫度的數(shù)字PCR 擴(kuò)增熱圖,發(fā)現(xiàn)在退火溫度為60℃時(shí),沒(méi)有明顯的下雨現(xiàn)象,確定數(shù)字PCR 的最佳退火溫度60℃。最終,確定微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性10 min;40 個(gè)循環(huán)(94℃ 變性15 s,60℃退火延伸1 min);98℃變性10 min;4℃保存。

    圖1 微滴式數(shù)字PCR 退火溫度優(yōu)化擴(kuò)增熱圖

    1.2.4 DNA 拷貝數(shù)定量分析 微滴式數(shù)字PCR 結(jié)束后,將96 孔板置入微滴讀取儀中讀取信號(hào),使用軟件QuantaSoft Version 1.6.6.0320 分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),獲得DNA 模板拷貝數(shù)的絕對(duì)定量結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 DNA質(zhì)量測(cè)定

    采用熒光計(jì)Qubit 2.0 測(cè)定DNA 濃度,利用NanoDrop 2000 核酸蛋白測(cè)定儀來(lái)測(cè)定DNA 純度和鹽殘留情況,提取DNA 的濃度及純度等參數(shù)見表1。結(jié)果顯示,提取的DNA 濃度在20 ng/μL-200 ng/μL 之間,說(shuō)明在不同組織中都能提取到較理想的DNA;OD260/OD280比值基本都在1.8-2.0 之間,說(shuō)明蛋白質(zhì)和RNA 等雜質(zhì)殘留少;OD260/OD230比值普遍大于2.0,說(shuō)明核酸中鹽分等雜質(zhì)殘留少,提取的DNA 質(zhì)量較好。鑒于所提取組織的DNA 濃度不同,因此將工作濃度統(tǒng)一調(diào)整為8.89 ng/μL,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2 鴨源性微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)體系的建立

    微滴式數(shù)字PCR 可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量,如在反應(yīng)體系中加入GD-紹興鴨胸和馬太湖麻鴨血的DNA,利用微滴式數(shù)字PCR 分別讀取IL-2核基因和12S rRNA 線粒體基因的拷貝數(shù)。從圖2 可知,灰色為陰性微滴,藍(lán)色為陽(yáng)性微滴,在FAM 熒光通道上均擴(kuò)增出鴨源性的信號(hào),且得到良好的擴(kuò)增,滿足分析要求。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,不同鴨品種間的DNA 其IL-2 核基因的拷貝數(shù)較為穩(wěn)定,而12S rRNA 線粒體基因的拷貝數(shù)變化較大,表明線粒體的豐度存在較大差異。

    2.3 DNA拷貝數(shù)分析

    結(jié)果如表2 所示,微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)測(cè)得8.89 ng/μL 的DNA 中含有的核DNA 拷貝數(shù)平均值為13 470,與理論值[14]接近,所有組織中核DNA 拷貝數(shù)的變異系數(shù)為11.16%,小于線粒體DNA 拷貝數(shù)的變異系數(shù)(26.23%),表明核DNA 是開展鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最適DNA 來(lái)源。線粒體DNA的拷貝數(shù)在不同鴨品種乃至同一品種不同組織間存在較大差異。整體而言,鴨肝中線粒體拷貝數(shù)最高;鴨心、鴨胸肉、鴨腿肉和鴨皮中的線粒體拷貝數(shù)次之;鴨血中的線粒體拷貝數(shù)最低。

    表1 不同品種鴨組織DNA 的提取質(zhì)量

    2.4 線粒體和核DNA拷貝數(shù)穩(wěn)定性分析

    線粒體DNA 的拷貝數(shù)和核DNA 拷貝數(shù)的比值能反映提取DNA 中線粒體的相對(duì)豐度。如表2 所示,鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值最高;鴨心及鴨胸/腿肉中的拷貝數(shù)比值次之;鴨皮的拷貝數(shù)比值再次之;鴨血的拷貝數(shù)比值最低。分析6 個(gè)不同組織中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值后可知,鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值的變異系數(shù)最大;鴨血和鴨心次之;而鴨腿肉的變異系數(shù)最小(4.10%)。

    圖2 微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)不同品種鴨組織DNA 核和線粒體DNA 的拷貝數(shù)

    3 討論

    以DNA 為基礎(chǔ)的PCR 技術(shù)被廣泛用于食品中動(dòng)物源性成分的鑒別,目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用線粒體基因來(lái)開展肉類摻假的定性和定量檢測(cè)[15-18]。眾所周知,線粒體是產(chǎn)生ATP 的細(xì)胞器,在能量代謝旺盛的細(xì)胞中,線粒體的數(shù)量相對(duì)豐富[19]。然而,由于不同組織的能量代謝水平不同,其線粒體的豐度也不盡相同,這勢(shì)必影響基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究提取了9 個(gè)鴨品種不同組織的總DNA,并測(cè)定了線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數(shù)及其比例情況。

    從檢測(cè)結(jié)果可知,不同品種鴨源性核DNA 的拷貝數(shù)穩(wěn)定性好,而線粒體DNA 拷貝數(shù)在不同組織中存在較大的差異,核DNA 是開展鴨肉摻假定量檢測(cè)的最優(yōu)選擇。在檢測(cè)的6 個(gè)組織中,鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值及其最大,這與肝臟是重要的代謝器官密切相關(guān)[20];鴨胸肉、鴨心、鴨腿肉和鴨皮次之,這與心肌細(xì)胞參與心臟舒縮活動(dòng)和骨骼肌參與機(jī)體運(yùn)動(dòng)密不可分[21];鴨血中拷貝數(shù)比值最低,說(shuō)明在開展基于線粒體DNA 的摻假比例定量檢測(cè)時(shí)須充分考慮摻假物的組織來(lái)源,以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)鴨腿肉的變異系數(shù)最小,這可能與腿部骨骼肌在鴨子日常運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮動(dòng)力作用緊密相關(guān)[22]。因此,在開展基于核DNA 的鴨肉摻假比例定量檢測(cè)時(shí),不同品種以及組織均可進(jìn)行測(cè)定;線粒體DNA 作為靶基因的鴨肉摻假比例定量檢測(cè)時(shí),鴨腿肉來(lái)源的肉制品是最佳選擇。本文為鴨肉制品甚至其他肉制品開展摻假定量檢測(cè)選擇合適的靶DNA 提供參考。

    表2 不同品種鴨組織中線粒體和核DNA 拷貝數(shù)及拷貝數(shù)比值情況

    4 結(jié)論

    核DNA 的拷貝數(shù)在不同品種鴨組織中具有良好的穩(wěn)定性,是開展鴨肉制品摻假定量檢測(cè)的最適DNA 來(lái)源。在開展利用線粒體DNA 為參比的摻假定量檢測(cè)時(shí),需充分考慮不同組織中線粒體的豐度問(wèn)題,以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。不同品種鴨腿肉中線粒體/核DNA 拷貝數(shù)比值的變異系數(shù)最小。

    致謝:

    感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供實(shí)驗(yàn)材料。

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