PRRSV NADC30-like SYBR Green I qPCR 檢測方法的建立與應(yīng)用

項(xiàng)明源 廖倡宇 江地科 張鵬飛 王印 羅燕 楊澤曉 姚學(xué)萍

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2. 動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinere productive and respiratorysyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）引起的一種病毒病。它以母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征［1］。1996 年我國首次報道了PRRS［2］，毒株為以CH-1a、BJ-4 株等為代表的經(jīng)典PRRSV；在2006 年出現(xiàn)了高致病PRRSV 變異株［3］，并迅速成為優(yōu)勢流行毒株，代表株為JXA1、HuN4 和JXwn06 等；在2013 年發(fā)現(xiàn)了PRRSV 的新毒株與美國的NADC30 毒株具有較高的同源性，因此稱為PRRSV NADC30-like［4］。近幾年在中國吉林、黑龍江、河南、北京、天津、山西和浙江等地相繼報道PRRSV NADC30-like 毒株爆發(fā)。隨著臨床檢出率大幅提高，NADC30-like 逐漸成為PRRSV 主要流行毒株［5-6］，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前已有多個PRRSV 檢測方法，如溫青娜［7］等基于qPCR 建立了鑒別歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV 檢測方法，但尚無基于SYBR Green I qPCR 鑒定NADC30-like 毒株的方法，毒株類型確定還需依靠ORF5 序列測定和分子進(jìn)化樹分析［8］，這需要更高技術(shù)要求和更長時間得出結(jié)果。

本研究基于NADC30-Like 毒株在Nsp2 基因存在“111+1+19”aa 氨基酸不連續(xù)缺失且該種缺失在PRRSV 基因分類使用時極為保守的特點(diǎn)［9］，自行設(shè)計特異性引物，建立了鑒定PRRSV NADC30-Like 毒株熒光定量PCR 方法。面對國內(nèi)多種類型PRRSV毒株共存的局面，該方法較于探針法有更低的價格，較于普通PCR 有更高的靈敏度而在市場中更容易推廣，可快速、精確鑒定出PRRSV NADC30-Like 毒株，旨為臨床診斷提供快速、精確的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及疫苗 高致病性豬呼吸與繁殖綜合征活疫苗（HuN4-F112 株）、豬瘟活疫苗（兔源）購自上海海利公司，PRRSV NADC30-like、豬圓環(huán)2 型病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬輪狀病毒均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保存。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α 購自北京天根公司；T-Vector pMD19（Simple）購自大連TakaRa 公司；AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix 購自南京諾唯贊公司；病毒基因組DNA 提取試劑盒、病毒基因組RNA 提取試劑盒、DNA 膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司；1×T3 Super PCR Mix 購自成都擎科梓熙公司；氨芐青霉素購自美國Amresco 公司；T4 連接酶、Prime Script TMRTReagent Kit 購自大連TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI GenBanK 中PRRSV NADC30-like（登錄號：JN654459）的Nsp2基因序列，使用Snapgene 3.2.1 軟件自行設(shè)計特異性引物，上游引物P1-F：5′-TCCAGGTGTGGTAGTTT- GGT-3′，下游引物P1-R：5′-GGGACAGGCACAGGTTCATT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為131 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以病毒基因組RNA 提取試劑盒提取PRRSV NADC30-like 的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備出cDNA，用引物P1-F 和P1-R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過DNA 純化回收試劑盒進(jìn)行膠回收，連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將經(jīng)過PCR 鑒定并且測序正確的重組質(zhì)粒用以配制標(biāo)準(zhǔn)品，在配制之前用核酸蛋白檢測儀測定其濃度并換算成拷貝數(shù)，作為熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 熒光定量PCR 樣品的制備 用病毒基因組DNA 提取試劑盒和病毒基因組RNA 提取試劑盒分別提取豬圓環(huán)2 型病毒、豬偽狂犬病病毒、高致病性豬呼吸與繁殖綜合病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒的DNA或者制備其cDNA 作為熒光定量PCR 反應(yīng)的模板，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，改變引物終濃度（2-20 μmol/L），同時改變退火溫度（52-62℃），通過不同條件的反應(yīng)對反應(yīng)體系與條件進(jìn)行優(yōu)化。最終，以最佳反應(yīng)條件與體系進(jìn)行反應(yīng)，延伸時檢測熒光信號，確定最佳引物的反應(yīng)終濃度。以ddH2O 將標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍系列稀釋成10 成個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中6 梯度（2.25×107-2.25×102copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板，每個濃度度設(shè)立3 個重復(fù)，同時設(shè)立陰性對照，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，利用ABI 7500 Software v2.0.1 分析軟件自動生成擴(kuò)增動力學(xué)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn) 將制備的初始濃度標(biāo)準(zhǔn)品10 倍稀釋至2.25×10-2copies/μL，以梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。使用同樣的模板和引物進(jìn)行普通PCR 檢測，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn) 利用上述所提取的病毒的DNA或cDNA 分別作為樣品模板，以引物P1-F 和P1-R進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，同時設(shè)立陰性對照，用最佳反應(yīng)條件與體系進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線評價此反應(yīng)的特異性。

1.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn) 將制備的初始濃度標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍系列稀釋成10 個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中3 個稀釋度的DNA 樣品作為模板。每個稀釋度做4 個重復(fù)，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行1 次熒光定量PCR 反應(yīng)，根據(jù)每個稀釋度的Ct 值計算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。

1.2.7.2 批間重復(fù)實(shí)驗(yàn) 將制備的初始濃度標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍系列稀釋成10 個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中3 個稀釋度的DNA 樣品作為模板。以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行4 次熒光定量PCR 反應(yīng)，根據(jù)每個稀釋度的Ct 值計算批間變異系數(shù)（CV）。以批內(nèi)、批間的變異系數(shù)評價該熒光定量PCR 的穩(wěn)定性。

1.2.8 臨床樣品的檢測 將2018 年以來四川部分地區(qū)送檢的35 份疑似PRRSV 感染樣品，提取總RNA，制備cDNA，采用本研究建立的熒光定量方法進(jìn)行檢測，同時用同樣的引物進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測。同時設(shè)置陰性對照和陽性對照，計算兩者陽性檢 出率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以P1-F、P1-R 對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到約131 bp 的克隆片段（圖1），測序結(jié)果正確并且未發(fā)生突變。經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定重組質(zhì)粒的濃度，換算成拷貝數(shù)為2.25×1010copies/μL，作為熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

經(jīng)優(yōu)化后確定了最佳反應(yīng)體系和條件，反應(yīng)體系為20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL：RNase-Free ddH2O 7μL，引 物P1-F 和P1-R 各1μL，模板1 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)；95℃終延伸10 s。以最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，取標(biāo)準(zhǔn)品的6 個稀釋度（2.25×107-2.25×102copies/μL）進(jìn)行檢測，ABI 7500Softwarev2.0.1 分析軟件自動生成擴(kuò)增動力學(xué)曲線（圖2-A）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2-B）?？梢姌?biāo)準(zhǔn)品濃度在2.25×107-2.25×102copies/μL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，斜率為-3.304，截距為36.999，擴(kuò)增效率R2為100.7%，即標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.304x+36.999，其中x代表模板的起始拷貝濃度（copies/μL）的對數(shù)，y代表樣品擴(kuò)增的Ct 值。

2.3 敏感性實(shí)驗(yàn)

將陽性重組質(zhì)粒從2.25×1010copies/μL 開始進(jìn)行10 倍梯度稀釋，以每個稀釋度的質(zhì)粒為模板，用本研究設(shè)計的特異性引物分別進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 和普通PCR。結(jié)果（圖3）顯示熒光PCR 的最大檢出量的稀釋度為101，且陰性對照未出現(xiàn)任何曲線；普通PCR 的最大檢出量的稀釋度為103，且陰性對照未出現(xiàn)條帶（圖4），表明該熒光PCR 的敏感性是普通PCR 的100 倍。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

圖2 不同稀釋梯度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線（A）、熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）

圖3 熒光定量PCR 的靈敏性實(shí)驗(yàn)

圖4 普通PCR 的靈敏性實(shí)驗(yàn)

以上述所提取的病毒的DNA 或cDNA 分別作為樣品模板，以引物P1-F 和P1-R 進(jìn)行熒光定量PCR檢測，同時設(shè)立陰性對照，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR 檢測。結(jié)果（圖5）顯示，僅PRRSV NADC30-Like 檢測為陽性；其他病毒以及陰性對照未出現(xiàn)任何明顯的擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果均為陰性。表明該方法具有良好的特異性。

圖5 熒光定量PCR 的特異性實(shí)驗(yàn)

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取 釋 濃 度 為2.25×106、2.25×103、2.25×102copies/μL 的PRRSV NADC30-Like 的cDNA 作為模板，以最佳反應(yīng)條件與體系進(jìn)行熒光定量PCR 的批內(nèi)與批間的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表1）顯示，3 批4 次重復(fù)的批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)（CV）分別為1.04%、0.38%、0.8%；4 次單獨(dú)批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)（CV）分別為1.86%、0.91%、1.24%。批內(nèi)與批間的變異系數(shù)（CV）均小于1.9%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣本的檢測

選取2018 年以來四川部分地區(qū)送檢的疑似存在PRRSV 感染病料，共計35 份，采用本研究建立的熒光定量方法進(jìn)行檢測，同時進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測。最終以本研究建立的SYBR Green I qPCR 方法在35份病料樣本中檢出7 份陽性樣品，陽性檢出率為20%（7/35）；常規(guī)PCR 檢出4 份樣品，陽性檢出率為11.43%（4/35）。對本研究建立的SYBR Green I qPCR 檢測方法中多檢測出3 份陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，NCBI blast 結(jié)果顯示均為PRRSV NADC30-Like毒株。綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的SYBR Green Ⅰ qPCR 方法具有更高的靈敏度與特異性，能較好的應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

表1 SYBRGreen Real-time qPCR 批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

PRRSV NADC30-like 毒株近幾年臨床檢出率逐漸增高，成為PRRSV 主要流行毒株，發(fā)病豬場母豬流產(chǎn)率高達(dá)40%左右，斷奶仔豬呼吸道癥狀嚴(yán)重，容易繼發(fā)鏈球菌、副豬嗜血桿菌、放線桿菌及巴氏桿菌等細(xì)菌感染，部分豬場死淘率高達(dá)20%以上，這給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來了新的挑戰(zhàn)［10-11］。NADC30-Like 與以往的毒株不同，該類病毒與其他PRRSV 重組機(jī)率顯著提升，重組后毒株之間毒力差異較大，導(dǎo)致現(xiàn)有的商品化疫苗不能對其提供有效的免疫保護(hù)［12］。PRRSV 疫苗毒株、田間野毒株分布廣泛，對于準(zhǔn)確診斷加大不少難度，因此建立NADC30-Like 毒株高效、快速且準(zhǔn)確的檢測方法對于防控PRRSV 就顯得十分必要，且在不使用探針的基礎(chǔ)上靈敏而快捷的優(yōu)點(diǎn)使得該檢測方法更具廣闊的應(yīng)用前景。

PRRSV Nsp2 基因具有高度的變異度，因此一直是PRRSV 用以基因分型鑒定的重要基因之一。NADC30-Like 毒株Nsp2 基因基于VR-2332 毒株株序列在aa 323-433、aa 481、aa 533-551 存在“111+1+19”aa 氨基酸不連續(xù)缺失的特點(diǎn)［13］，這在PRRSV 基因分類使用時極為保守，針對此特點(diǎn)設(shè)計特異性引物。通過對反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，從而建立了PRRSV NADC30-Like 熒光定量PCR 檢測方法。在特異性實(shí)驗(yàn)時，利用此方法對本實(shí)驗(yàn)室分離保存的NADC30-Like 毒株進(jìn)行檢測，結(jié)果為陽性；同時對8 種常見感染豬的病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果無任何明顯非特異性擴(kuò)增，表明此方法具有較好的特異性，有利于NADC30-Like 的專一性檢測。本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR 在標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為2.25×107-2.25×102copies/μL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，y=-3.304x+36.999，其擴(kuò)增效率R2為100.7%，可通過此關(guān)系（方程式）來準(zhǔn)確計算出樣品的拷貝數(shù)（即濃度）或者Ct 值，此方法簡便快速，且十分精確。在靈敏度實(shí)驗(yàn)中此熒光PCR 最低可檢測到2.25×101copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒，而普通PCR 只能檢測到2.25×103copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，熒光定量的靈敏性比普通PCR 高約100 倍，由此可見其具有高度的靈敏性，對低含量的NADC30-Like 也十分有效。批內(nèi)與批間的變異系數(shù)均小于1.9%，表明其具有高度的重復(fù)性，在不同的外界條件下，其檢測結(jié)果基本一致，增加了此檢測NADC30-Like熒光PCR技術(shù)的可靠性。在臨床樣品的檢測中，用熒光定量PCR 對35 份疑似PRRSV 感染樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果7 份樣品與陽性對照檢測為NADC30-Like 陽性，而普通PCR 只檢測出3 份陽性樣品，這也證實(shí)了該建立的熒光PCR 方法的靈敏性高于普通PCR，表明該方法可直接用于臨床樣品中PRRSV NADC30-Like 的快速檢測，實(shí)現(xiàn)定量檢測，操作簡便，對疾病的診斷、開展流行病學(xué)調(diào)查與疫苗研發(fā)等方面具有重大意義。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)PRRSV NADC30 毒株Nsp2 基因保守序列設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化確定最佳反應(yīng)條件，并進(jìn)行靈敏度、特異性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及臨床樣品的檢測，建立了PRRSV NADC30-Like 毒株熒光定量PCR 檢測方法，標(biāo)準(zhǔn)品在107copies/μL 到102copies/μL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低可檢測到2.25×101copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品陽性質(zhì)粒；該方 法 與HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV 無交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（CV）小于1.9%，在臨床樣品的檢測中較普通PCR有更高的檢出率。該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高和檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，可用于PRRSV NADC30-Like 感染的早期診斷、樣品的快速檢測與定量分析。