豬瘟病毒抗體納米熒光檢測試紙條方法建立及性能評價(jià)

吳昊星 劉百紅 劉雪微 周景云 馬永纓 楊欣艷 李寶春 陳西釗

（北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100089）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是一種由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的高度接觸性傳染病，對全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1-2］?！秶抑虚L期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020 年）》中將其列為5 種優(yōu)先防治的動物疫病之一［3］。當(dāng)前CSF 防治的主要手段是疫苗接種，其中中國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗在中國乃至世界范圍內(nèi)CSF 的防控起到了積極作用［4］。CSFV 基因組編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、Erns、E1 和E2）和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（C、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）［5-6］。E2 是CSFV 最重要的具有免疫原性的蛋白之一，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染，是研究新型基因工程疫苗和血清學(xué)抗體檢測方法的首選靶蛋白［7-10］。藺輝星等［11］以原核表達(dá)的E2 蛋白建立了檢測CSFV 血清抗體的間接ELISA 檢測方法，其敏感性、特異性和符合率分別為89.07%、77.59%和84.65%。肖麗等［12］通過液相芯片新技術(shù)分別以原核表達(dá)CSFV E2 蛋白和PCV2 Cap 蛋白，與熒光微球偶聯(lián)建立了一種同時(shí)檢測CSFV、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）抗體的方法臨床樣品符合率分別是90.48%、60.32%。袁莉等［13］利用重組抗原E2、Erns和C蛋白建立的CSFV 血清抗體ELISA 檢測方法，可以用于評價(jià)CSF 疫苗免疫后血清中針對3種結(jié)構(gòu)蛋白的抗體消長特點(diǎn)，從而為臨床豬瘟疫苗免疫程序的制定提供參考。

本研究基于鑭系元素Eu 微球標(biāo)記技術(shù)建立了一種CSFV 抗體檢測的免疫層析方法，結(jié)合熒光分析儀，可以快速方便的對豬場的血清樣品進(jìn)行檢測，無需大型昂貴的儀器。解決了中小型養(yǎng)殖場實(shí)驗(yàn)室簡陋問題，可廣泛的應(yīng)用于豬場中CSFV抗體的監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

CSFV E2 抗原由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所表達(dá)純化后提供；鼠IgG、羊抗鼠IgG 購自于杭州隆基公司；Eu 納米微球購自于Bangs 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自于賽默飛世爾科技有限公司；活化緩沖液：50 mmol/L MES 用NaOH 調(diào)pH 為6.0；偶聯(lián)緩沖液：50 mmol/L HEPES 用NaOH 調(diào)pH 為8.0；封閉液：用水溶解酪蛋白鈉，終濃度為5%；樣本處理 液：0.1 mol/L Tris、0.1% Casein、0.1% Tween-20用鹽酸調(diào)pH 到7.4；P：CSFV 抗體陽性豬血清；N：CSFV 抗體陰性豬血清；豬瘟陽性血清國家參考品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，細(xì)胞中和效價(jià)為1∶（2 138±2）。豬瘟病毒抗體ELISA 檢測試劑盒購自于北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。CSFV 強(qiáng)陽性樣本（CV1），CSFV 中陽性樣本（CV2），CSFV弱陽性樣本（CV3）。

AFS-1000 干式熒光分析儀（廣州藍(lán)勃公司）；XL-2120 超聲波清洗儀（北京協(xié)力共創(chuàng)公司）；D-37520osterode 高速臺式冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；XYZ30600128 劃膜儀（Biodot 公司）；ZQ400 斬切機(jī)（購自于上海金標(biāo)公司）；硝酸纖維素膜（Sartorius 公司）；玻璃纖維、吸水紙、PVC 板（上海杰一生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試紙條的制備

1.2.1.1 微球標(biāo)記 （1）用500 μL 活化緩沖液洗滌10 μL（0.1 mg）微球溶液1 次，離心，去上清；取出EDC 放室溫（要扭緊蓋子）；（2）分別用250 μL活化緩沖液洗滌重懸顆粒，超聲1 min，務(wù)必使微球充分懸?。唬?）分別加入250 μL 含0.005 mg EDC的活化緩沖液，使終體積均為500 μL；（4）室溫下（18-25℃）持續(xù)混勻反應(yīng)25 min，離心；（5）分別用偶聯(lián)緩沖液洗滌2 次，離心，去上清；重懸于250 μL 偶聯(lián)緩沖液中，充分懸??；（6）加入250 μL的抗原-偶聯(lián)緩沖液，立即輕輕上下混勻；（7）室溫下持續(xù)混勻反應(yīng)3 h，離心，去上清；（8）分別加入500 μL 封閉液，洗滌2 次，沉淀用500 μL 封閉液重懸，超聲1 min，室溫下持續(xù)混勻反應(yīng)過夜，離心，去上清；加入500 μL 保存液，洗滌2 次，用500 μL保存液重懸，超聲1 min；（9）保存在2-8℃冰箱備用。

1.2.1.2 NC 膜制備 將劃線抗原用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋，羊抗鼠IgG 抗體用含1%蔗糖，pH8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為1.5 mg/mL。用噴膜儀以50 mm/s 的速度、1 μL/cm的濃度，在室內(nèi)環(huán)境中，分別將劃線抗原、羊抗鼠IgG 抗體噴在NC 膜（2.5 cm×30 cm）的T 線、C 線位置，37℃烘箱中烘干2 h 備用。

1.2.1.3 結(jié)合墊的制備 以聚脂纖維膜（1 cm×2.5 cm）作為結(jié)合墊材料，用結(jié)合墊處理緩沖液浸濕，37℃烘箱中烘干后將自制的熒光微球-標(biāo)記抗原復(fù)合物溶液用噴膜儀以50 mm/s、6 μL/cm 的濃度噴于結(jié)合墊上，37℃烘箱中烘干3 h 備用。

1.2.1.4 樣品墊的制備 以玻璃纖維素膜（1.5 cm×30 cm）作為樣品墊材料，用樣品處理緩沖液浸濕，37℃烘箱中烘干4 h 備用。

1.2.1.5 吸水紙的剪切 剪好1.5 cm×30 cm 的吸水紙，備用。

1.2.1.6 檢測試紙的組裝 組裝環(huán)境要求：常溫，濕度低于30%。根據(jù)上述步驟制備的樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜和吸水紙依照圖1 所示的重疊關(guān)系將其依次貼在帶有粘合劑的PVC 底板（8 cm×30 cm）上，具體 為：將NC 膜非點(diǎn)樣面粘貼于PVC 底板；熒光墊粘貼在NC 膜的上方，覆蓋NC 膜1 mm；吸水墊粘貼在NC 膜的上方，覆蓋NC 膜2 mm；樣品墊粘貼在熒光墊的上方，覆蓋熒光墊2 mm；在斬切機(jī)中將粘貼好的檢測板剪切成4 mm 寬的試紙條，裝在試紙條外殼中，制成帶有結(jié)果觀察窗和加樣口的檢測卡。用AFS-1000 熒光分析儀檢測熒光信號，記錄T/C 讀值（圖1）。

圖1 熒光試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.2 試紙條反應(yīng)體系優(yōu)化

1.2.2.1 結(jié)合墊復(fù)溶濃度的優(yōu)化 按照1.2.1 標(biāo)記抗原，納米微球標(biāo)記好的抗原用結(jié)合墊處理液復(fù)溶，復(fù)溶濃度選擇2、4、6、8、10 倍復(fù)溶，噴膜儀以50 mm/s、6 μL/cm 的濃度噴于結(jié)合墊上，37℃烘箱中烘干3 h 備用。然后組裝成試紙條檢測臨床樣本，依據(jù)熒光信號值、P/N 比值確定合適的復(fù)溶濃度。

1.2.2.2 包被濃度優(yōu)化 包被抗原含量優(yōu)化：將劃線抗原用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，羊抗鼠IgG 抗體用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為1 mg/mL。用噴膜儀以50 mm/s 的速度、1 μL/cm 的濃度，在室內(nèi)濕度為45%-65%的條件下，分別將劃線抗體、羊抗鼠IgG 抗體噴在NC 膜（2.5 cm×30 cm）的T 線、C 線位置，37℃烘箱中烘干2 h 備用。

1.2.2.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 加樣后5 min、8 min、10 min、13 min、15 min、20 min、25 min、30 min 讀取數(shù)據(jù)，繪制時(shí)間曲線，以P/N、讀數(shù)穩(wěn)定且時(shí)間最短為優(yōu)，確定加樣反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 性能評價(jià)

1.2.3.1 敏感性試驗(yàn) 對豬瘟陽性血清國家參考品按 照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、 1∶256 進(jìn)行稀釋，記錄結(jié)果。

1.2.3.2 特異性試驗(yàn) 與豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)2 型、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等陽性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 對CSFV 抗體陽性樣本P 連續(xù)加樣10 次，計(jì)算試紙條變異系數(shù)（CV）。

1.2.3.4 臨床評價(jià) 采用試紙條、豬瘟病毒抗體ELISA 檢測試劑盒（Anheal-ELISA）以及熒光抗體中和試驗(yàn)（FVNT）同時(shí)檢測131 份豬血清，計(jì)算試紙條與Anheal-ELISA 和FVNT 符合率。

2 結(jié)果

2.1 試紙條反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1 結(jié)合墊復(fù)溶濃度的優(yōu)化 從圖2 中可以看出在復(fù)溶度稀釋6 倍的時(shí)候，T/C 比值較高，P/N 比值最大。因此選擇復(fù)溶度為6 倍時(shí)稀釋度最佳。

圖2 不同復(fù)溶度與T/C 比值、P/N 比值的變化

2.1.2 包被濃度優(yōu)化 從下圖3 中可以看出，在T線濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，P/N 比值最大。因此T 線濃度選擇0.1 mg/mL 為最佳濃度。

圖3 不同包被濃度與T/C 比值、P/N 比值變化

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 從圖4 可以看出在15-20 min時(shí)，T/C 比值變化不大，13 min 以后P/N 比值逐漸降低，綜合考慮選擇檢測時(shí)間為15 min。

圖4 不同檢測時(shí)間與T/C 比值、P/N 比值變化

2.2 性能評價(jià)

2.2.1 敏感性 以T/C ≥0.1 時(shí)為陽性，將豬瘟陽性血清國家參考品按照倍比稀釋到128 倍仍為陽性，如圖5。

2.2.2 特異性 從圖6 可以看出豬瘟陰性血清的測定值與豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)2 型、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等陽性血清測定值小于0.1。故本方法針對這7 種動物疫病陽性血清無交叉反應(yīng)。

2.2.3 重復(fù)性 從表1 中看出，CSFV 抗體熒光試紙條批內(nèi)和批間CV 均小于10%。

圖5 豬瘟陽性血清稀釋倍數(shù)與T/C 比值的關(guān)系

圖6 CSFV-Ab 納米熒光試紙條交叉反應(yīng)性

表1 CSFV 抗體納米熒光試紙條重復(fù)性

2.2.4 臨床評價(jià) 從表2 中可以看出試紙條與FVNT的陰性符合率為100%，陽性符合率為93%，總符合率為98.5%。從表3 中可得出試紙條與Aheal-ELISA的陰性符合為100%，陽性符合率為90%，總符合率為97.7%。

表2 FVNT 試驗(yàn)與試紙條檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

陽性符合率=26/（26+2）×100%=93%

陰性符合率=103/（103+0）×100%=100%總符合率=（103+26）/131×100%=98.5%

表3 與Anheal-ELISA 與試紙條檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

豬瘟是一種高度傳染性疫病，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一［14-15］。急性型豬瘟呈敗血性變化，實(shí)質(zhì)器官出血，壞死和梗死；慢性型豬瘟呈纖維素性壞死性腸炎。目前主要通過撲殺與疫苗預(yù)防接種相結(jié)合等手段，北美、加拿大、新西蘭等很多國家已成功實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化，但在中國豬瘟仍是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，存在不間斷流行［16］。CSFV 為有囊膜、直徑40-60 nm、單股正鏈RNA 病毒［17］。目前已經(jīng)定位的CSFV 蛋白有5 種，即 Npro、C、Erns（E0）、E1 和E2。它們均由CSFV 的 RNA-ORF 5′一端所編碼。在結(jié)構(gòu)蛋白中，最具有免疫研究價(jià)值的是Erns和E［9，18-19］。E2 蛋白是CSFV 主要的抗原蛋白，可誘導(dǎo)豬機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，從而預(yù)防集落刺激因子（Colony stimulating factor，CSF）［20］。

目前市場上豬瘟抗體的檢測方法，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和膠體金免疫層析技術(shù)的方法為主。商品化的豬瘟抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑主要廠家有IDEXX、Biocheck 等，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法需要專業(yè)的設(shè)備，對人員的操作技能要求比較高，不利于在基層開展工作。商品化的豬瘟抗體膠體金檢測試劑的廠家有北京世紀(jì)元亨、武漢科前等，膠體金的方法不可以準(zhǔn)確的定量，且靈敏度不高，準(zhǔn)確性差。而時(shí)間分辨熒光分析法是一種新型的非放射性微量分析技術(shù)［21］。它是目前最靈敏的微量分析技術(shù)之一，其靈敏度高達(dá)10-12g/mL，較膠體金法（Colloidal gold immunoassay，GIA）高出3 個(gè)數(shù)量 級［22］。本技術(shù)利用鑭系微球通過共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記抗原或抗體，相對物理偶聯(lián)，化學(xué)偶聯(lián)更加結(jié)實(shí)，不易脫落。用熒光分析儀測量熒光，同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。本技術(shù)除滿足了高靈敏檢測的需求，同時(shí)也不需要復(fù)雜的設(shè)備，操作簡單方便，符合基層的工作情景。在市場上，并沒有發(fā)現(xiàn)具有農(nóng)業(yè)部備案的商品化豬瘟病毒抗體熒光檢測試劑。因此本文建立的豬瘟抗體的熒光檢測方法具有一定的技術(shù)優(yōu)勢。

馮春花等［23］利用E2 建立了一種豬瘟病毒血清抗體間接ELISA 檢測方法，該方法與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬I 型皰疹病毒（Pseudorabies virus，PRV）、 豬 圓 環(huán) 病 毒（Porcine circovirus，PCV）、豬細(xì)小病毒（ Porcine parvovirus，PPV）陽性血清均無交叉反應(yīng)；隨機(jī)檢測80 份豬血清樣品，與進(jìn)口阻斷ELISA 試劑盒相比其陽性符合率為83.58%、陰性符合率為76.92%，總體符合率為80.25%。本研究的試紙條測定臨床血清陽性符合為90%、陰性符合率為100%，總符合率為98%。本試紙研制采用雙抗原夾心的方法，利用常用的Eu 微球作為標(biāo)記物，對E2 抗原進(jìn)行共價(jià)耦合連接標(biāo)記，在NC 膜上包被真核表達(dá)的豬瘟E2 抗原，經(jīng)優(yōu)化最終確定包被濃度為0.1 mg/mL，復(fù)溶濃度為6 倍稀釋，檢測時(shí)間為15 min。通過對試紙條的性能評價(jià)可以得出，豬瘟抗體熒光檢測試紙條的敏感性為豬瘟陽性血清國家參考品稀釋128 倍仍可以檢測到，對常見的豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒病、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等疾病抗體陽性血清無交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10%，試紙條與Anheal-ELISA 的陰性符合為100%，陽性符合率為90%，總符合率為97.7%。試紙條與FVNT 的陰性符合率為100%，陽性符合率為93%，總符合率為98.5%。

4 結(jié)論

基于鑭系元素Eu 微球標(biāo)記技術(shù)，經(jīng)一系列反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了一種豬瘟病毒抗體檢測的免疫層析方法，并經(jīng)對試紙條靈敏度、特異性、重復(fù)性等性能指標(biāo)的優(yōu)化，結(jié)果滿足試劑性能要求，表明可廣泛的用于豬場中豬瘟病毒抗體的免疫評估，輔助進(jìn)行疫苗免疫策略的調(diào)整，建立合理的免疫 程序。