吳昊星 劉百紅 劉雪微 周景云 馬永纓 楊欣艷 李寶春 陳西釗
(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司,北京 100089)
豬瘟(Classical swine fever,CSF)是一種由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接觸性傳染病,對(duì)全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]?!秶?guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020 年)》中將其列為5 種優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一[3]。當(dāng)前CSF 防治的主要手段是疫苗接種,其中中國(guó)研制的豬瘟兔化弱毒疫苗在中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)CSF 的防控起到了積極作用[4]。CSFV 基因組編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、Erns、E1 和E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(C、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)[5-6]。E2 是CSFV 最重要的具有免疫原性的蛋白之一,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染,是研究新型基因工程疫苗和血清學(xué)抗體檢測(cè)方法的首選靶蛋白[7-10]。藺輝星等[11]以原核表達(dá)的E2 蛋白建立了檢測(cè)CSFV 血清抗體的間接ELISA 檢測(cè)方法,其敏感性、特異性和符合率分別為89.07%、77.59%和84.65%。肖麗等[12]通過(guò)液相芯片新技術(shù)分別以原核表達(dá)CSFV E2 蛋白和PCV2 Cap 蛋白,與熒光微球偶聯(lián)建立了一種同時(shí)檢測(cè)CSFV、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗體的方法臨床樣品符合率分別是90.48%、60.32%。袁莉等[13]利用重組抗原E2、Erns和C蛋白建立的CSFV 血清抗體ELISA 檢測(cè)方法,可以用于評(píng)價(jià)CSF 疫苗免疫后血清中針對(duì)3種結(jié)構(gòu)蛋白的抗體消長(zhǎng)特點(diǎn),從而為臨床豬瘟疫苗免疫程序的制定提供參考。
本研究基于鑭系元素Eu 微球標(biāo)記技術(shù)建立了一種CSFV 抗體檢測(cè)的免疫層析方法,結(jié)合熒光分析儀,可以快速方便的對(duì)豬場(chǎng)的血清樣品進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需大型昂貴的儀器。解決了中小型養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)陋問(wèn)題,可廣泛的應(yīng)用于豬場(chǎng)中CSFV抗體的監(jiān)測(cè)。
CSFV E2 抗原由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所表達(dá)純化后提供;鼠IgG、羊抗鼠IgG 購(gòu)自于杭州隆基公司;Eu 納米微球購(gòu)自于Bangs 公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自于賽默飛世爾科技有限公司;活化緩沖液:50 mmol/L MES 用NaOH 調(diào)pH 為6.0;偶聯(lián)緩沖液:50 mmol/L HEPES 用NaOH 調(diào)pH 為8.0;封閉液:用水溶解酪蛋白鈉,終濃度為5%;樣本處理 液:0.1 mol/L Tris、0.1% Casein、0.1% Tween-20用鹽酸調(diào)pH 到7.4;P:CSFV 抗體陽(yáng)性豬血清;N:CSFV 抗體陰性豬血清;豬瘟陽(yáng)性血清國(guó)家參考品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,細(xì)胞中和效價(jià)為1∶(2 138±2)。豬瘟病毒抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。CSFV 強(qiáng)陽(yáng)性樣本(CV1),CSFV 中陽(yáng)性樣本(CV2),CSFV弱陽(yáng)性樣本(CV3)。
AFS-1000 干式熒光分析儀(廣州藍(lán)勃公司);XL-2120 超聲波清洗儀(北京協(xié)力共創(chuàng)公司);D-37520osterode 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司);XYZ30600128 劃膜儀(Biodot 公司);ZQ400 斬切機(jī)(購(gòu)自于上海金標(biāo)公司);硝酸纖維素膜(Sartorius 公司);玻璃纖維、吸水紙、PVC 板(上海杰一生物有限公司)。
1.2.1 試紙條的制備
1.2.1.1 微球標(biāo)記 (1)用500 μL 活化緩沖液洗滌10 μL(0.1 mg)微球溶液1 次,離心,去上清;取出EDC 放室溫(要扭緊蓋子);(2)分別用250 μL活化緩沖液洗滌重懸顆粒,超聲1 min,務(wù)必使微球充分懸?。唬?)分別加入250 μL 含0.005 mg EDC的活化緩沖液,使終體積均為500 μL;(4)室溫下(18-25℃)持續(xù)混勻反應(yīng)25 min,離心;(5)分別用偶聯(lián)緩沖液洗滌2 次,離心,去上清;重懸于250 μL 偶聯(lián)緩沖液中,充分懸??;(6)加入250 μL的抗原-偶聯(lián)緩沖液,立即輕輕上下混勻;(7)室溫下持續(xù)混勻反應(yīng)3 h,離心,去上清;(8)分別加入500 μL 封閉液,洗滌2 次,沉淀用500 μL 封閉液重懸,超聲1 min,室溫下持續(xù)混勻反應(yīng)過(guò)夜,離心,去上清;加入500 μL 保存液,洗滌2 次,用500 μL保存液重懸,超聲1 min;(9)保存在2-8℃冰箱備用。
1.2.1.2 NC 膜制備 將劃線抗原用含1%蔗糖,pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋?zhuān)蚩故驣gG 抗體用含1%蔗糖,pH8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為1.5 mg/mL。用噴膜儀以50 mm/s 的速度、1 μL/cm的濃度,在室內(nèi)環(huán)境中,分別將劃線抗原、羊抗鼠IgG 抗體噴在NC 膜(2.5 cm×30 cm)的T 線、C 線位置,37℃烘箱中烘干2 h 備用。
1.2.1.3 結(jié)合墊的制備 以聚脂纖維膜(1 cm×2.5 cm)作為結(jié)合墊材料,用結(jié)合墊處理緩沖液浸濕,37℃烘箱中烘干后將自制的熒光微球-標(biāo)記抗原復(fù)合物溶液用噴膜儀以50 mm/s、6 μL/cm 的濃度噴于結(jié)合墊上,37℃烘箱中烘干3 h 備用。
1.2.1.4 樣品墊的制備 以玻璃纖維素膜(1.5 cm×30 cm)作為樣品墊材料,用樣品處理緩沖液浸濕,37℃烘箱中烘干4 h 備用。
1.2.1.5 吸水紙的剪切 剪好1.5 cm×30 cm 的吸水紙,備用。
1.2.1.6 檢測(cè)試紙的組裝 組裝環(huán)境要求:常溫,濕度低于30%。根據(jù)上述步驟制備的樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜和吸水紙依照?qǐng)D1 所示的重疊關(guān)系將其依次貼在帶有粘合劑的PVC 底板(8 cm×30 cm)上,具體 為:將NC 膜非點(diǎn)樣面粘貼于PVC 底板;熒光墊粘貼在NC 膜的上方,覆蓋NC 膜1 mm;吸水墊粘貼在NC 膜的上方,覆蓋NC 膜2 mm;樣品墊粘貼在熒光墊的上方,覆蓋熒光墊2 mm;在斬切機(jī)中將粘貼好的檢測(cè)板剪切成4 mm 寬的試紙條,裝在試紙條外殼中,制成帶有結(jié)果觀察窗和加樣口的檢測(cè)卡。用AFS-1000 熒光分析儀檢測(cè)熒光信號(hào),記錄T/C 讀值(圖1)。
圖1 熒光試紙條結(jié)構(gòu)示意圖
1.2.2 試紙條反應(yīng)體系優(yōu)化
1.2.2.1 結(jié)合墊復(fù)溶濃度的優(yōu)化 按照1.2.1 標(biāo)記抗原,納米微球標(biāo)記好的抗原用結(jié)合墊處理液復(fù)溶,復(fù)溶濃度選擇2、4、6、8、10 倍復(fù)溶,噴膜儀以50 mm/s、6 μL/cm 的濃度噴于結(jié)合墊上,37℃烘箱中烘干3 h 備用。然后組裝成試紙條檢測(cè)臨床樣本,依據(jù)熒光信號(hào)值、P/N 比值確定合適的復(fù)溶濃度。
1.2.2.2 包被濃度優(yōu)化 包被抗原含量?jī)?yōu)化:將劃線抗原用含1%蔗糖,pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL,羊抗鼠IgG 抗體用含1%蔗糖,pH=8 的5 mmol/L 硼酸緩沖液稀釋為1 mg/mL。用噴膜儀以50 mm/s 的速度、1 μL/cm 的濃度,在室內(nèi)濕度為45%-65%的條件下,分別將劃線抗體、羊抗鼠IgG 抗體噴在NC 膜(2.5 cm×30 cm)的T 線、C 線位置,37℃烘箱中烘干2 h 備用。
1.2.2.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 加樣后5 min、8 min、10 min、13 min、15 min、20 min、25 min、30 min 讀取數(shù)據(jù),繪制時(shí)間曲線,以P/N、讀數(shù)穩(wěn)定且時(shí)間最短為優(yōu),確定加樣反應(yīng)時(shí)間。
1.2.3 性能評(píng)價(jià)
1.2.3.1 敏感性試驗(yàn) 對(duì)豬瘟陽(yáng)性血清國(guó)家參考品按 照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、 1∶256 進(jìn)行稀釋?zhuān)涗浗Y(jié)果。
1.2.3.2 特異性試驗(yàn) 與豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)2 型、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。
1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)CSFV 抗體陽(yáng)性樣本P 連續(xù)加樣10 次,計(jì)算試紙條變異系數(shù)(CV)。
1.2.3.4 臨床評(píng)價(jià) 采用試紙條、豬瘟病毒抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒(Anheal-ELISA)以及熒光抗體中和試驗(yàn)(FVNT)同時(shí)檢測(cè)131 份豬血清,計(jì)算試紙條與Anheal-ELISA 和FVNT 符合率。
2.1.1 結(jié)合墊復(fù)溶濃度的優(yōu)化 從圖2 中可以看出在復(fù)溶度稀釋6 倍的時(shí)候,T/C 比值較高,P/N 比值最大。因此選擇復(fù)溶度為6 倍時(shí)稀釋度最佳。
圖2 不同復(fù)溶度與T/C 比值、P/N 比值的變化
2.1.2 包被濃度優(yōu)化 從下圖3 中可以看出,在T線濃度為0.1 mg/mL 時(shí),P/N 比值最大。因此T 線濃度選擇0.1 mg/mL 為最佳濃度。
圖3 不同包被濃度與T/C 比值、P/N 比值變化
2.1.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 從圖4 可以看出在15-20 min時(shí),T/C 比值變化不大,13 min 以后P/N 比值逐漸降低,綜合考慮選擇檢測(cè)時(shí)間為15 min。
圖4 不同檢測(cè)時(shí)間與T/C 比值、P/N 比值變化
2.2.1 敏感性 以T/C ≥0.1 時(shí)為陽(yáng)性,將豬瘟陽(yáng)性血清國(guó)家參考品按照倍比稀釋到128 倍仍為陽(yáng)性,如圖5。
2.2.2 特異性 從圖6 可以看出豬瘟陰性血清的測(cè)定值與豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)2 型、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等陽(yáng)性血清測(cè)定值小于0.1。故本方法針對(duì)這7 種動(dòng)物疫病陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。
2.2.3 重復(fù)性 從表1 中看出,CSFV 抗體熒光試紙條批內(nèi)和批間CV 均小于10%。
圖5 豬瘟陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)與T/C 比值的關(guān)系
圖6 CSFV-Ab 納米熒光試紙條交叉反應(yīng)性
表1 CSFV 抗體納米熒光試紙條重復(fù)性
2.2.4 臨床評(píng)價(jià) 從表2 中可以看出試紙條與FVNT的陰性符合率為100%,陽(yáng)性符合率為93%,總符合率為98.5%。從表3 中可得出試紙條與Aheal-ELISA的陰性符合為100%,陽(yáng)性符合率為90%,總符合率為97.7%。
表2 FVNT 試驗(yàn)與試紙條檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
陽(yáng)性符合率=26/(26+2)×100%=93%
陰性符合率=103/(103+0)×100%=100%總符合率=(103+26)/131×100%=98.5%
表3 與Anheal-ELISA 與試紙條檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
豬瘟是一種高度傳染性疫病,是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一[14-15]。急性型豬瘟呈敗血性變化,實(shí)質(zhì)器官出血,壞死和梗死;慢性型豬瘟呈纖維素性壞死性腸炎。目前主要通過(guò)撲殺與疫苗預(yù)防接種相結(jié)合等手段,北美、加拿大、新西蘭等很多國(guó)家已成功實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化,但在中國(guó)豬瘟仍是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一,存在不間斷流行[16]。CSFV 為有囊膜、直徑40-60 nm、單股正鏈RNA 病毒[17]。目前已經(jīng)定位的CSFV 蛋白有5 種,即 Npro、C、Erns(E0)、E1 和E2。它們均由CSFV 的 RNA-ORF 5′一端所編碼。在結(jié)構(gòu)蛋白中,最具有免疫研究?jī)r(jià)值的是Erns和E[9,18-19]。E2 蛋白是CSFV 主要的抗原蛋白,可誘導(dǎo)豬機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體,從而預(yù)防集落刺激因子(Colony stimulating factor,CSF)[20]。
目前市場(chǎng)上豬瘟抗體的檢測(cè)方法,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和膠體金免疫層析技術(shù)的方法為主。商品化的豬瘟抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑主要廠家有IDEXX、Biocheck 等,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法需要專(zhuān)業(yè)的設(shè)備,對(duì)人員的操作技能要求比較高,不利于在基層開(kāi)展工作。商品化的豬瘟抗體膠體金檢測(cè)試劑的廠家有北京世紀(jì)元亨、武漢科前等,膠體金的方法不可以準(zhǔn)確的定量,且靈敏度不高,準(zhǔn)確性差。而時(shí)間分辨熒光分析法是一種新型的非放射性微量分析技術(shù)[21]。它是目前最靈敏的微量分析技術(shù)之一,其靈敏度高達(dá)10-12g/mL,較膠體金法(Colloidal gold immunoassay,GIA)高出3 個(gè)數(shù)量 級(jí)[22]。本技術(shù)利用鑭系微球通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記抗原或抗體,相對(duì)物理偶聯(lián),化學(xué)偶聯(lián)更加結(jié)實(shí),不易脫落。用熒光分析儀測(cè)量熒光,同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨,可有效地排除非特異熒光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。本技術(shù)除滿足了高靈敏檢測(cè)的需求,同時(shí)也不需要復(fù)雜的設(shè)備,操作簡(jiǎn)單方便,符合基層的工作情景。在市場(chǎng)上,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有農(nóng)業(yè)部備案的商品化豬瘟病毒抗體熒光檢測(cè)試劑。因此本文建立的豬瘟抗體的熒光檢測(cè)方法具有一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
馮春花等[23]利用E2 建立了一種豬瘟病毒血清抗體間接ELISA 檢測(cè)方法,該方法與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)、豬I 型皰疹病毒(Pseudorabies virus,PRV)、 豬 圓 環(huán) 病 毒(Porcine circovirus,PCV)、豬細(xì)小病毒( Porcine parvovirus,PPV)陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng);隨機(jī)檢測(cè)80 份豬血清樣品,與進(jìn)口阻斷ELISA 試劑盒相比其陽(yáng)性符合率為83.58%、陰性符合率為76.92%,總體符合率為80.25%。本研究的試紙條測(cè)定臨床血清陽(yáng)性符合為90%、陰性符合率為100%,總符合率為98%。本試紙研制采用雙抗原夾心的方法,利用常用的Eu 微球作為標(biāo)記物,對(duì)E2 抗原進(jìn)行共價(jià)耦合連接標(biāo)記,在NC 膜上包被真核表達(dá)的豬瘟E2 抗原,經(jīng)優(yōu)化最終確定包被濃度為0.1 mg/mL,復(fù)溶濃度為6 倍稀釋?zhuān)瑱z測(cè)時(shí)間為15 min。通過(guò)對(duì)試紙條的性能評(píng)價(jià)可以得出,豬瘟抗體熒光檢測(cè)試紙條的敏感性為豬瘟陽(yáng)性血清國(guó)家參考品稀釋128 倍仍可以檢測(cè)到,對(duì)常見(jiàn)的豬繁殖與呼吸綜合征病、豬I 型皰疹病毒病、豬口蹄疫病、豬圓環(huán)、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉病毒、羊邊界病毒等疾病抗體陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng),批內(nèi)和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10%,試紙條與Anheal-ELISA 的陰性符合為100%,陽(yáng)性符合率為90%,總符合率為97.7%。試紙條與FVNT 的陰性符合率為100%,陽(yáng)性符合率為93%,總符合率為98.5%。
基于鑭系元素Eu 微球標(biāo)記技術(shù),經(jīng)一系列反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立了一種豬瘟病毒抗體檢測(cè)的免疫層析方法,并經(jīng)對(duì)試紙條靈敏度、特異性、重復(fù)性等性能指標(biāo)的優(yōu)化,結(jié)果滿足試劑性能要求,表明可廣泛的用于豬場(chǎng)中豬瘟病毒抗體的免疫評(píng)估,輔助進(jìn)行疫苗免疫策略的調(diào)整,建立合理的免疫 程序。