抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 定性PCR 檢測方法

李蔥蔥 謝蘋 董立明 夏蔚 蘭青闊 閆偉 龍麗坤 李飛武

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，長春 130033；2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381）

根據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA）最新統(tǒng)計顯示，2017 年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達到5 970 萬hm2［1］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為新的農(nóng)業(yè)科技革命的強大動力。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的持續(xù)增長和全球公眾對于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品安全性的關(guān)注度不斷提升，包括我國在內(nèi)的全球62 個國家相繼頒布實施了轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理制度［2-3］。根據(jù)我國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》及其配套管理規(guī)章的規(guī)定，我國對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實行安全評價、產(chǎn)品標(biāo)識、生產(chǎn)許可、經(jīng)營許可、進口許可、加工許可等制度。其中，針對各個轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體建立特異、靈敏、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法是保證標(biāo)識管理制度順利實施的重要技術(shù)支撐［4］。

轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 是由北京奧瑞金公司研發(fā)的轉(zhuǎn)mG2-aroA基因和mcry1Ah基因抗蟲耐除草劑玉米新品系。研發(fā)人采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將mG2-aroA和mcry1Ah兩個外源基因的表達框?qū)胗衩资荏w中，然后通過多代篩選獲得對玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲具有抗性、耐草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米GH5112E-117C 轉(zhuǎn)化體［5］，該轉(zhuǎn)化體正在申請生產(chǎn)應(yīng)用安全證書階段，在我國具有重要產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。建立GH5112E-117C 玉米的檢測方法，將對該轉(zhuǎn)化體的安全評價、行政監(jiān)管和知識產(chǎn)權(quán)保護提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 轉(zhuǎn)基因玉米GH5112E-117C、轉(zhuǎn) 基 因 玉 米 混 合 樣 品（Bt11、Bt176、MON810、M O N 8 6 3、G A 2 1、N K 6 0 3、T 2 5、T C 1 5 0 7、MON88017、MIR604 每種轉(zhuǎn)化體含量為1%，以非轉(zhuǎn)基因玉米為填充物）；轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品（包括GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127、356043、305423、CV127 每種轉(zhuǎn)化體含量為1%，以非轉(zhuǎn)基因大豆為填充物）；轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品（包括科豐6 號、科豐8 號、克螟稻、M12、TT51-1 每種轉(zhuǎn)化體含量為1%，以非轉(zhuǎn)基因水稻為填充物）；轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品（包括MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913 每種轉(zhuǎn)化體含量為1%，以非轉(zhuǎn)基因棉花為填充物）；轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品（包括MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2 每種轉(zhuǎn)化體含量為1%，以非轉(zhuǎn)基因油菜為填充物）；非轉(zhuǎn)基因玉米樣品。以上樣品均由本實驗室收集保存。

植物基因組DNA 提取試劑盒；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等PCR 試劑；其他生化試劑（分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 C1000 型梯度PCR 儀；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)；ND8000 紫外可見光分光光度儀。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 將所有樣品研磨成粉末，按照北京天根公司的植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書，提取樣品基因組DNA，用紫外可見光分光光度儀測定DNA 質(zhì)量和濃度，用1×TE 緩沖液將純化的DNA 溶液稀釋至25 mg/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)奧瑞金公司提供的GH5112E-117C 玉米外源載體插入片段的5′端和3′端側(cè)翼序列信息，采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0，綜合考慮核苷酸序列GC 含量和引物Tm 值，設(shè)計 了1 對PCR 檢 測 引 物，GH5112-117C-F：5′- ACCAGCACCAGGTCCGAGTTGAGA -3′；GH5112-117C -R：5′- CCCAGGTACATTAAAAACGTCCGC -3′，擴增產(chǎn)物大小為179 bp。引物由上海生工有限公司合成，用1×TE 緩沖液稀釋至10 μmol/L 的工作液。

1.2.3 PCR 反應(yīng) 優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系包括：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 混合溶液2 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、HS Taq DNA 聚合酶0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O 補齊至25 μL。優(yōu)化后的PCR 擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35 個循環(huán)；72℃ 5 min；10℃保存。PCR 擴增結(jié)束后，取10 μL 擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 特異性檢測

將抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 制備成質(zhì)量分數(shù)為1%的粉末作為測試樣品，利用5 種轉(zhuǎn)基因作物混合樣作為比對樣品，對建立的抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 定性PCR 方法進行特異性測試，測試樣品和比對樣品均以轉(zhuǎn)基因材料與非轉(zhuǎn)基因材料作為填充物進行混合磨制而成，提取DNA 按照要求進行PCR 反應(yīng)。

檢測結(jié)果（圖1）表明，僅從含有GH5112E-117C 玉米的測試樣品中擴增到179 bp 的預(yù)期DNA片段，而在其他樣品中均未擴增到預(yù)期大小的條帶，表明建立的抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 玉米檢測方法具有高度特異性。

2.2 靈敏度測試

將抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 與其非轉(zhuǎn)基因按不同質(zhì)量比混合，制成GH5112E-117C 轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的樣品，提取基因組DNA，進行PCR 擴增。

圖1 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的特異性測試

結(jié)果（圖2）顯示，利用建立的方法在PCR 檢測反應(yīng)體系中加入50 ng DNA 模板，在GH5112E-117C 轉(zhuǎn)化體含量為0.05%及以上的樣品中均能穩(wěn)定得到與預(yù)期大小一致的擴增產(chǎn)物，表明方法的靈敏度可達到0.05%。

圖2 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的靈敏度測試

在使用普通PCR 進行轉(zhuǎn)基因成分定性檢測時，一般要求方法的檢測限應(yīng)穩(wěn)定達到0.1%。根據(jù)國際公認的檢測限判定程序，隨機稱取60 份GH5112E-117C 玉米質(zhì)量分數(shù)為0.1%的樣品，提取基因組DNA，用本方法進行測試。結(jié)果如圖3 所示，60 份試樣中連續(xù)59 次檢出預(yù)期片段，表明在PCR 檢測反應(yīng)體系中加入50 ng DNA 模板時，本方法的檢出限為0.1%，適用于對抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 品系的高靈敏檢測。

2.3 加工品測試

加工品中的高溫處理過程往往會降解DNA，對轉(zhuǎn)基因檢測有較大的影響。為測試本研究建立的GH5112E-117C 玉米檢測方法對加工品的適用性，采用兩種常用的高溫方法制備了2 份GH5112E-117C 玉米加工品，1 份是將質(zhì)量分數(shù)為1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末制成玉米面窩頭，并蒸熟；另一份是將質(zhì)量分數(shù)為1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末在121℃下高溫高壓處理20 min。提取2 份加工品的基因組DNA，進行PCR 擴增。結(jié)果（圖4）表明，利用建立的方法在2 份加工品中均能特異性地擴增到179 bp 的預(yù)期產(chǎn)物，表明該方法適用于GH5112E-117C 玉米加工品的定性PCR 檢測。

圖3 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的檢出限測試

圖4 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法對加工品的測試

2.4 穩(wěn)健性測試

針對PCR 檢測方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，選擇退火溫度和引物濃度梯度兩個關(guān)鍵參數(shù)進行正交試驗。設(shè)置50、52、54、56、58 和60℃等6 個 退火溫度，0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L 和0.5 μmol/L 等5 個引物濃度梯度，每對引物共測試30 個退火溫度/濃度梯度組合。結(jié)果（圖5）表明，在不同的引物濃度和退火溫度處理中本方法均表現(xiàn)出非常好的擴增特異性，而且，當(dāng)引物終濃度為0.2 μmol/L 時，不同退火溫度表現(xiàn)出較為一致的擴增效率，特異性擴增條帶清晰、無非特異擴增、引物二聚體較少。綜合考慮玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的定性PCR 檢測方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，結(jié)合本研究結(jié)果，反應(yīng)體系中的引物終濃度確定為0.2 μmol/L，反應(yīng)程序中的退火溫度設(shè)定為58℃。

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積持續(xù)增長和全球公眾對于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品安全性的關(guān)注度不斷提升，轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)也迅速發(fā)展［6］。轉(zhuǎn)基因玉米檢測方法的研發(fā)，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實行安全評價、產(chǎn)品標(biāo)識、生產(chǎn)許可、經(jīng)營許可、進口許可、加工許可等制度的實施提供了重要技術(shù)支撐［7］。

在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測過程中，PCR 技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，應(yīng)用最為廣泛［8］。根據(jù)所檢測的目的DNA 片段的特異性差異，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品PCR 檢測方法又可分為篩選、基因特異性、構(gòu)建特異性和轉(zhuǎn)化體特異性4 類［9］。其中，轉(zhuǎn)化體特異性PCR 檢測方法以轉(zhuǎn)基因生物的旁側(cè)序列（與外源插入片段連接的受體基因組序列）與外源插入片段的連接即轉(zhuǎn)化體特異序列為檢測對象，具有高度特異性，已逐步成為國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的首選［10］，我國近年來發(fā)布的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)絕大多數(shù)為轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法。本研究開發(fā)的方法是精準(zhǔn)檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 的一種新的技術(shù)手段。該方法具有低成本、便利、普及性高的技術(shù)優(yōu)勢，但是檢測通量、精準(zhǔn)定量和自動化檢測方面。還存在一定的技術(shù)弊端。因此，本研究下一步將開發(fā)該轉(zhuǎn)化體實時熒光PCR［11］和數(shù)字PCR 方法［12］。

4 結(jié)論

本方法以轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 轉(zhuǎn)化體特異性DNA 序列為靶標(biāo)，能特異性地檢測樣品中是否含有GH5112E-117C，檢測靈敏度可穩(wěn)定達到0.1%。