基于RNAi 技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR 檢測(cè) 方法

楊鎮(zhèn)州 劉剛 許麗

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203）

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)及相關(guān)專業(yè)的發(fā)展，針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的研究和應(yīng)用愈發(fā)廣泛，截至2018 年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.917 億hm2［1］；與此同時(shí)，各國(guó)家和地區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全管理也日趨嚴(yán)格，開始實(shí)施標(biāo)識(shí)制度和系統(tǒng)化管理［2］。

RNA 干擾（RNAi，RNA interference）作為一種新興的熱門轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)，常指一些短鏈的雙鏈RNA（dsRNA）可以通過(guò)促使特異性mRNA 降解來(lái)高效地阻斷生物體內(nèi)特異性基因的表達(dá)［3］。該技術(shù)在基因功能研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，并被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的育種新方法，已在轉(zhuǎn)基因番茄、馬鈴薯等作物上實(shí)現(xiàn)了深入研究［4-6］。但由于RNAi 技術(shù)存在沉默機(jī)制的特異性可能在傳代、生長(zhǎng)環(huán)境等過(guò)程中產(chǎn)生變化、沉默在物種間可能產(chǎn)生的漂移、偶然性觸發(fā)等因素，RNAi 轉(zhuǎn)基因作物的安全評(píng)價(jià)便顯得尤為重要，但目前國(guó)內(nèi)外尚未見對(duì)RNAi 轉(zhuǎn)基因植物有權(quán)威的評(píng)價(jià)及管理方法，這將對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管十分不利。因此，尋找到RNAi 轉(zhuǎn)基因植物的高效檢測(cè)方法，對(duì)其進(jìn)行精確定量的意義 重大。

目前，針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定量檢測(cè)主要依靠PCR技術(shù)［7］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（Real-time PCR）和普通PCR 法相比靈敏度更高，并且能對(duì)基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量。但由于它是依靠Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量的，因此對(duì)于低拷貝數(shù)和來(lái)源復(fù)雜樣品的檢測(cè)有很大的局限性［8］。隨著PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，第三代數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）以其靈敏度高、絕對(duì)定量精確、檢測(cè)線性范圍寬、特異性好等優(yōu)勢(shì)脫穎而出。dPCR 采用分散手段，將完整的PCR體系分散至成千上萬(wàn)個(gè)獨(dú)立體系中，使得每個(gè)獨(dú)立PCR 體系中至多包含一個(gè)模板（實(shí)際樣品中的模板數(shù)符合泊松分布），并對(duì)這些體系是否發(fā)生了PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)從而達(dá)到精確的絕對(duì)定量［9］。由于上述多種優(yōu)勢(shì)，dPCR 技術(shù)在近年來(lái)飛速發(fā)展，已經(jīng)多次被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究中［10］。

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，在過(guò)去數(shù)十年中一直致力于開發(fā)用于作物抗昆蟲侵襲的方法。以前采用的傳統(tǒng)手段如化學(xué)殺蟲劑等，雖效果較理想，但對(duì)非目標(biāo)生物如蚯蚓等也會(huì)造成傷害；并且由于其難以代謝，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致田野貧瘠；更嚴(yán)重的是會(huì)積累于食物鏈中，對(duì)更高端物種將會(huì)誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生。RNAi 能以序列特異性方式下調(diào)基因的表達(dá)，在害蟲防治方面的應(yīng)用已較為成熟。本研究中選用的轉(zhuǎn)基因玉米DBN11061，是一種利用RNAi 技術(shù)以降低或關(guān)閉昆蟲體內(nèi)靶序列表達(dá)來(lái)削弱昆蟲存活、繁殖或是侵襲寄主能力的玉米品系。本研究中將以該轉(zhuǎn)基因玉米品系的特異性dsRNA 為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，建立并優(yōu)化其逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）定量檢測(cè)方法，為RNAi 轉(zhuǎn)基因作物的定量檢測(cè)和基于RNAi 技術(shù)的轉(zhuǎn)基因作物安全評(píng)價(jià)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAi 轉(zhuǎn)基因玉米DBN11061（北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司）；植物RNA 提取試劑盒（ExtrationKits，ET Kits）（PureLinkTMRNA Mini Kit，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；柱式植物總 RNA 抽提純化試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，寶生物工程（大連）有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcription Kits，RT Kits）（ProtoScriptcDNA 第 一 鏈 合 成 試 劑 盒，NEB（北京）有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，寶生物工程（大連）有限公司；Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit， 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；引物、探針合成（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；數(shù)字PCR 系統(tǒng)（QuantStudioTM3D，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；核酸定量?jī)x（Nanodrop2000，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設(shè)計(jì) 針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米DBN11061中引發(fā)特異序列基因沉默的dsRNA 序列設(shè)計(jì)dPCR正反向引物及探針。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因玉米總RNA 的抽提方法優(yōu)化 在提取過(guò)程中，均先使用液氮將葉片磨成粉末，再分別使用不同方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米葉片進(jìn)行總RNA 提取，得到的RNA 存放于-80℃。使用同一反轉(zhuǎn)錄方法對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，并按照QuantStudioTM3D 數(shù)字PCR 儀默認(rèn)程序進(jìn)行數(shù)字PCR并比較結(jié)果，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 的方法優(yōu)化 使用

1.2.2 中最優(yōu)提取方法得到的轉(zhuǎn)基因玉米葉片RNA按照不同方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 按照QuantStudioTM3D 默認(rèn)程序進(jìn)行數(shù)字PCR 并比較結(jié)果，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.4 數(shù)字PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 不同的模板及引物探針?biāo)璧淖罴逊磻?yīng)條件均不相同，其中退火溫度為最關(guān)鍵因素。我們選擇的dPCR 反應(yīng)條件為：（1）酶激活和預(yù)變性階段：96℃，10 min；（2）循環(huán)擴(kuò)增階段：60、58、56、54 和52℃（不同退火溫度）/2 min，98℃/30 s，共40 個(gè)循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s，分別根據(jù)不同退火溫度進(jìn)行數(shù)字PCR 并比較結(jié)果。

1.2.5 數(shù)字PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 數(shù)字PCR 方法的準(zhǔn)確性和反應(yīng)體系中的引物、探針濃度密切相關(guān)，針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米DBN11061 中dsRNA 序列PCR 反應(yīng)體系中的引物、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。dPCR 反應(yīng)體系（總體積為20 μL）中，分別選取探針終濃度為：10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L；外源基因的正反向引物終濃度為50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、1 000 nmol/L；Master mix 體積為10 μL，H2O 體積為8 μL，依次根據(jù)1.5 中最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行數(shù)字PCR 并比較結(jié)果。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)方法的定量檢測(cè)低限的測(cè)定 將cDNA樣品依次稀釋1、10、20、50、100 倍，根據(jù)1.2.4 及1.2.5的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行dPCR，每個(gè)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算測(cè)得平行數(shù)據(jù)的RSD 值，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）≤25%［11］作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷依據(jù)，判斷本文建立的dPCR體系定量檢測(cè)低限的濃度值。

2 結(jié)果

2.1 引物探針的設(shè)計(jì)

針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米品系DBN11061 的dsRNA 序列進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，序列如表1。

表1 引物及探針序列

2.2 轉(zhuǎn)基因植物總RNA的提取方法優(yōu)化

不同的植物總RNA 提取方法的原理基本類似，提取流程主要包括：（1）加入液氮充分研磨，以徹底破碎植物細(xì)胞的細(xì)胞壁；（2）使核蛋白復(fù)合體中的蛋白質(zhì)變性，致使蛋白質(zhì)與核酸分離；（3）抑制RNA 酶活性，以防止釋放出的RNA 被污染；（4）分離RNA 與DNA、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)、多糖等；（5）溶解并得到總RNA，檢測(cè)質(zhì)量與濃度。本實(shí)驗(yàn)主要選取3 種轉(zhuǎn)基因植物總RNA 提取試劑盒，在稱取相同質(zhì)量的轉(zhuǎn)基因玉米葉片提取得到RNA 后，使用同種反轉(zhuǎn)錄方法得到cDNA，再運(yùn)用同種反應(yīng)體系與條件進(jìn)行數(shù)字PCR，通過(guò)比較數(shù)字PCR 的結(jié)果篩選出相對(duì)最優(yōu)的提取方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

取等體積RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，將得到的cDNA按1.2.4、1.2.5 的PCR 體系（引物終濃度為200 nmol/L，探針終濃度為50 nmol/L）及反應(yīng)條件（退火溫度為52℃）進(jìn)行數(shù)字PCR 擴(kuò)增，并比較各提取方法得出的結(jié)果。

綜合3 種提取方法得到RNA 的dPCR 結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，ET-Kit3 提取得的RNA 經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 在進(jìn)行dPCR 實(shí)驗(yàn)中，信號(hào)區(qū)分最顯著、閾值線易劃分。因此后續(xù)相關(guān)轉(zhuǎn)基因玉米R(shí)NA 提取實(shí)驗(yàn)均采用ET Kit 3。

2.3 轉(zhuǎn)基因植物RNA的反轉(zhuǎn)錄方法優(yōu)化

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程為：（1）65℃反應(yīng)不同時(shí)間，冰上冷卻，以使RNA 變性，打開其二級(jí)結(jié)構(gòu)；（2）加入隨機(jī)引物、dNTP、buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶在較低溫度（不同提取方法溫度不同）反應(yīng)，以使引物與模板RNA退火結(jié)合；（3）在逆轉(zhuǎn)錄酶工作溫度（不同提取方法溫度不同）下反應(yīng)；（4）變性：使合成的cDNA和RNA 區(qū)分開；（5）在較高溫度（不同提取方法溫度不同）反應(yīng)，以使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。在上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶的活性和效率至關(guān)重要。因此我們選擇3 種不同的條件進(jìn)行dPCR，篩選最優(yōu)的反轉(zhuǎn)錄方法。

結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，RT Kit B 的逆轉(zhuǎn)錄效率遠(yuǎn)高于另兩種方法，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)所涉及的反轉(zhuǎn)錄步驟均使用RT Kit B。

2.4 數(shù)字PCR反應(yīng)條件及體系優(yōu)化

2.4.1 數(shù)字PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在PCR 反應(yīng)中，退火溫度是最重要的參數(shù)。在反應(yīng)過(guò)程中，退火溫度需要足夠低，以確保引物和目的序列有效退火；并且還需要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。在dPCR反應(yīng)過(guò)程中，合理的退火溫度約為60℃。本文中分別選取退火溫度為60、58、56、54 和52℃并按照

圖1 不同反應(yīng)提取方法得到的dPCR 芯片圖

表2 三種反轉(zhuǎn)錄方法得到cDNA 的dPCR 濃度結(jié)果

1.2.5 中的PCR 體系（引物終濃度為200 nmol/L，探針終濃度為50 nmol/L）依次獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化得到最佳退火溫度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的芯片圖（圖2）我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火溫度為60-56℃時(shí)，信號(hào)尚區(qū)分不明顯，閾值線不能明確劃分；當(dāng)降至52℃時(shí)，信號(hào)區(qū)分最明顯，閾值線顯著。因此dPCR 反應(yīng)條件確定為：酶激活和預(yù)變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴(kuò)增階段：52℃/2 min，98℃/30 s，共40 個(gè)循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

2.4.2 數(shù)字PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 數(shù)字PCR 方法的準(zhǔn)確性和反應(yīng)體系中的引物、探針濃度密切相關(guān)，直接關(guān)系到陽(yáng)性信號(hào)和陰性信號(hào)的區(qū)分，以及后續(xù)dPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確度，為此，我們對(duì)引物、探針濃度進(jìn)行了優(yōu)化，依次進(jìn)行dPCR。

2.4.2.1 探針濃度的優(yōu)化 按照1.2.5 中體系，分別選取探針終濃度為：10、25、50、75、100 nmol/L依次進(jìn)行dPCR，結(jié)果如圖3，當(dāng)探針終濃度為50 nmol/L 時(shí)，信號(hào)區(qū)分最佳，因此確定該濃度為探針濃度。

2.4.2.2 引物濃度的優(yōu)化 按照1.2.5 中體系，采用外源基因的正反向引物終濃度為50、100、200、400、1 000 nmol/L，依次進(jìn)行dPCR，結(jié)果如圖4。當(dāng)引物終濃度為200 nmol/L 時(shí)信號(hào)區(qū)分最佳，因此確定200 nmol/L 為引物終濃度。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法的定量檢測(cè)低限

為了得到通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)所建立方法的定量檢測(cè)低限，我們將使用ETKit 3 試劑盒提取得到的RNA（600 ng/μL）使用RT Kit B 反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 依次稀釋1、10、20、50、100 倍，并依照2.4 中得到的最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行數(shù)字PCR，結(jié)果如表3。

圖2 不同反應(yīng)條件得到的dPCR 芯片圖

當(dāng)cDNA 模板稀釋至50 倍時(shí)，檢測(cè)濃度為21.7 copies/μL，RSD 為14.6%，小于轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)平行數(shù)據(jù)RSD 為25%的接受閾值［11］，可以用于轉(zhuǎn)基因的定量檢測(cè)。而當(dāng)檢測(cè)空白樣品時(shí)，平均值為1.8 copies/μL，標(biāo) 準(zhǔn)差為0.23 copies/μL，RSD為12.4%，根據(jù)定量檢測(cè)中LOD 的計(jì)算方法，判定本文建立的dPCR 體系絕對(duì)定量檢測(cè)低限約為2.5 copies/μL。

3 討論

圖3 不同探針濃度得到的dPCR 芯片圖

在我國(guó)，由于害蟲侵襲造成危害的區(qū)域已逐漸從西北等地蔓延到東北、華北等玉米主要生產(chǎn)區(qū)域。因此，研究出能控制昆蟲蟲害并對(duì)植物損害較小的方法一直是相關(guān)領(lǐng)域研究者的目標(biāo)。本研究中提及的RNAi 技術(shù)通過(guò)下調(diào)靶序列來(lái)控制昆蟲的侵襲，例如破壞昆蟲生長(zhǎng)必須的生物過(guò)程［12］。當(dāng)特定的靶序列表達(dá)被下調(diào)或抑制時(shí)，會(huì)減少至少30%的蟲害威脅。此外，這些靶序列可以僅在昆蟲的生長(zhǎng)特定階段表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以DBN11061 品系中dsRNA 序列為目標(biāo)，設(shè)計(jì)引物探針進(jìn)行dPCR 定量檢測(cè)，從玉米的總RNA 提取方法、RNA 反轉(zhuǎn)錄方法、dPCR 退火溫度、所用引物探針濃度等方面均進(jìn)行條件優(yōu)化，從而建立了一套完整的轉(zhuǎn)基因玉米R(shí)T-dPCR 定量檢測(cè)方法。

圖4 不同引物濃度得到的dPCR 芯片圖

在得到轉(zhuǎn)基因品系玉米的cDNA 過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用ET-Kit 3 提取試劑盒所得RNA 的濃度及純度優(yōu)于其他兩種提取方法；在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，針對(duì)不同的總RNA，不同的反轉(zhuǎn)錄酶活性也大相徑庭。在本實(shí)驗(yàn)中RT-Kit B 反轉(zhuǎn)錄活性顯然優(yōu)于其他兩種反轉(zhuǎn)錄酶。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所用的cDNA 均由ET-Kit 3 提取玉米中的總RNA 后，使用RT-Kit B 進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄。

在數(shù)字PCR 的體系及反應(yīng)條件優(yōu)化過(guò)程中我們將反應(yīng)條件確定為：酶激活和預(yù)變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴(kuò)增階段：52℃/2 min，98℃/30 s，共40 個(gè)循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s；反應(yīng)體系為總體積為20 μL 中，探針終濃度為50 nmol/L，外源基因的正反向引物終濃度為200 nmol/L，Master mix 體積為10 μL，H2O 體積為8 μL，模板為2 μL。

表3 稀釋不同倍數(shù)cDNA 的數(shù)字PCR 結(jié)果

依照本文建立的數(shù)字PCR 檢測(cè)方法，絕對(duì)定量檢測(cè)低限約為2.5 copies/μL，RSD 為12.4%；低濃度實(shí)際樣品達(dá)21.7 copies/μL 時(shí)，相對(duì)偏差為2.7%，RSD 為14.6%，優(yōu)于歐盟的轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識(shí)限［13］。

與傳統(tǒng)PCR 相比，本實(shí)驗(yàn)所采用的dPCR 更高效、更穩(wěn)定，且由于不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，也避免了昂貴的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用和PCR 擴(kuò)增效率差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并優(yōu)化的方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因RNAi 品系玉米dsRNA 檢測(cè)研究，將為我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的定量檢測(cè)工作提供技術(shù)支撐和方法 依靠。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)基于RNAi 技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米品系，通過(guò)對(duì)植物提取方法、逆轉(zhuǎn)錄方法、數(shù)字PCR 條件及體系的摸索，建立了一套逆轉(zhuǎn)錄芯片式數(shù)字PCR定量檢測(cè)該品系玉米雙鏈RNA 的方法，該方法的絕對(duì)定量檢測(cè)低限約為2.5 copies/μL，RSD 為12.4%。