轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性PCR 方法驗證結(jié)果分析

王顥潛 肖芳 楊蕾 繆青梅 張旭冬 張秀杰

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021）

隨著轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的不斷發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增長，已從1996 年的170 萬hm2增加到2018 年的1.917 億hm2，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益［1］。大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)，培育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品種已成為各國保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的趨勢。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，離不開健全的轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管制度。為了有效的監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物，保護消費者的知情權(quán)，包括我國在內(nèi)的全球60 多個國家和地區(qū)相繼頒布實施了轉(zhuǎn)基因生物安全管理制度、標識管理制度以及配套的辦法規(guī)定 等［2-3］。2001 年以來，我國先后頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》等配套規(guī)章制度，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的試驗研究、生產(chǎn)、加工、標識、進口等環(huán)節(jié)進行全過程嚴格管理。轉(zhuǎn)基因生物安全的跟蹤監(jiān)管必須以有效的檢測方法為基礎(chǔ)。針對商業(yè)化生產(chǎn)或國內(nèi)批準安全證書的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品建立特異、靈敏、標準化的檢測方法是落實轉(zhuǎn)基因生物安全管理制度的重要保障，更是我國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作的重要技術(shù)支撐。

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）統(tǒng)計，目前全球已批準商業(yè)化種植31 種轉(zhuǎn)基因作物，共涉及517 種轉(zhuǎn)化體，其中玉米轉(zhuǎn)化體237 種，是獲得商業(yè)化批準最多的轉(zhuǎn)基因作物［4］。玉米作為中國重要的糧食及飼料作物之一，是國內(nèi)轉(zhuǎn)基因研發(fā)領(lǐng)域的重點。我國自2008 年啟動實施轉(zhuǎn)基因重大專項以來，自主基因、自主技術(shù)、自主品種的研發(fā)能力顯著提升，研發(fā)出一批具有商業(yè)化應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因作物品種。2020 年1 月21 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布2019 年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用）批準清單，其中包括2 個玉米品種和1 個大豆品種。這是2009 年轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1 號”、“Bt 汕優(yōu)63”和轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米“BVLA430101”獲得轉(zhuǎn)基因生物安全證書之后，又有主要農(nóng)作物品種獲批。特別是“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃提出“占領(lǐng)制高點、推進產(chǎn)業(yè)化”的戰(zhàn)略目標，我國轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化進程將進一步加快，加之申請進口安全證書的國外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也越來越多，我國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的任務(wù)也將越來越重，對于轉(zhuǎn)基因檢測方法的要求也越來越高。

抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5（瑞豐125）是本次獲批的玉米品種之一，該品種由浙江大學(xué)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化而成，轉(zhuǎn)入獨立發(fā)掘的抗蟲基因和耐草甘膦基因，表現(xiàn)出良好的抗蟲性和除草劑（農(nóng)達）耐受性，具有廣闊的應(yīng)用前景。未來，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 的成功推廣和應(yīng)用，離不開有效的轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管。為此，我們組織了8 家實驗室：吉林省農(nóng)科院（編號1）、山東省農(nóng)科院（編號2）、浙江省農(nóng)科院（編號3）、中國農(nóng)科院植保所（編號4）、中國農(nóng)科院生物所（編號5）、中國農(nóng)科院棉花所（編號6）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部天津環(huán)保所（編號7）、天津市農(nóng)科院（編號8），對研發(fā)單位提供的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性和定量PCR 方法進行了實驗室間驗證，并參照農(nóng)業(yè)部2259 號公告-4-2015［4］、農(nóng)業(yè)部2259 號公告-5-2015［5］及專家認定的驗證方案對檢測方法進行評價與分析，為后續(xù)標準方法的建立和轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性、定量PCR 方法循環(huán)驗證所涉及的共13 種樣品（包括7 種單一組分樣品、6 種混合樣品，見表1）。其中，涉及定性PCR 方法的有10 種樣品，涉及定量PCR 方法的有12 種樣品，陽性對照、陰性對照和特異性檢測樣品在定性和定量PCR 檢測方法驗證中共用。以上樣品均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心統(tǒng)一提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 參照《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA 提取和純化》（農(nóng)業(yè)部1485 號公告-4-2010）［6］執(zhí)行。每個樣品提2 份DNA，每份DNA 做3 次平行。將所有樣品研磨成粉末，按照植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書，提取樣品基因組DNA，使用紫外分光光度計對DNA 樣品濃度和純度進行測定，確認OD260/280比值在1.7-2.0 之間，再用0.1×TE 緩沖液將純化的DNA 溶液稀釋至終濃度25 ng/μL，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)雙抗12-5 研發(fā)單位提供的技術(shù)資料，轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 引物為：F ：5′-CAACGTCGTGACTGGGAAAA-3′，R ：5′-TGGAAGACAAGTTCTACGGGCT-3′， 擴 增 產(chǎn)物大小為256 bp。轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR 引物為：F ：5′-GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3′，R ：5′-GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA-3′，P：FAMAGCTCAACCACATCGCCCGACGC-BHQ1，擴增產(chǎn)物大小為94 bp。定性PCR 和定量PCR 引物位置見圖1。

表1 樣品信息表

圖1 定性PCR 和定量PCR 引物位置示意圖

1.2.3 定性PCR 反應(yīng) 根據(jù)雙抗12-5 研發(fā)單位提供的技術(shù)資料，定性PCR 反應(yīng)程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35 次循環(huán)；72℃延伸7 min。定性PCR 反應(yīng)體系見表2。

1.2.4 定量PCR 反應(yīng) 根據(jù)雙抗12-5 研發(fā)單位提供的技術(shù)資料，定量PCR 反應(yīng)程序為：95℃變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，共進行50 次循環(huán)；在第二階段的退火延伸（60℃）時段收集熒光信號。定量PCR 反應(yīng)體系見表3。

表2 雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 檢測反應(yīng)體系

表3 雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR 檢測反應(yīng)體系

1.2.5 建立標準曲線 提取雙抗12-5 樣品中的基因組DNA，用0.1×TE 緩沖液按照1∶5 稀釋成5 個拷貝數(shù)梯度為3.6×104、7.2×103、1.44×103、2.8×102和5.7×101的標準溶液，分別進行zSSIIb內(nèi)標準基因和雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體的實時熒光定量PCR，每個梯度設(shè)置3 個平行。以模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以Ct 值為縱坐標建立雙抗12-5 和zSSIIb內(nèi)標準基因的標準曲線，并得到標準曲線公式：（n：模板拷貝數(shù)，y：測試樣品的Ct 值，a：標準曲線的斜率，b：標準曲線的截距）。實時熒光定量PCR 體系及程序見1.2.3，玉米內(nèi)標基因zSSIIb的引物為：zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′，zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′，zSSIIb-P：FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTGBHQ1，擴增產(chǎn)物大小為88 bp。

1.2.6 定量PCR 方法準確性測試 對質(zhì)量分數(shù)為5%和0.5%的準確性樣品分別進行定量PCR，每個樣品做3 次平行，重復(fù)2 次試驗。根據(jù)測定出的Ct 值，按照標準曲線公式計算出式樣中雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體和zSSIIb內(nèi)標基因的模板拷貝數(shù)，再根據(jù)下面公式［7］計算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量：

2 結(jié)果

2.1 定性PCR方法循環(huán)驗證結(jié)果

按照上述定性PCR 反應(yīng)體系，用雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性引物擴增相應(yīng)的待測樣品。經(jīng)8 家實驗室驗證結(jié)果顯示，在定性PCR 方法特異性檢測中，所有實驗室均從含有雙抗12-5 樣品中擴增出其轉(zhuǎn)化體特異性序列，且片段大小與預(yù)期一致，在其他轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、非轉(zhuǎn)基因玉米混樣和陰性樣品中均未擴增出雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性序列；在靈敏度檢測中，所有實驗室均從質(zhì)量分數(shù)為0.1%的雙抗12-5 樣品中擴增出其轉(zhuǎn)化體特異性序列，且片段大小與預(yù)期一致，以3 號實驗室的結(jié)果為例，見圖2。8 家實驗室具體驗證結(jié)果見表4。綜上說明，研發(fā)單位提供的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR方法具有良好的特異性，檢測靈敏度達到0.1%。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 方法的靈敏度檢測

表4 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 方法驗證結(jié)果匯總表

2.2 實時熒光定量PCR方法循環(huán)驗證結(jié)果

2.2.1 特異性及靈敏度檢測 按照上述定量PCR 反應(yīng)體系，用雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定量引物擴增相應(yīng)的待測樣品。由于第4 家實驗室空白對照中有明顯的擴增信號，將該實驗室驗證結(jié)果列為異常數(shù)據(jù)剔除。在定量PCR 方法特異性檢測中，7 家實驗室均從含雙抗12-5玉米轉(zhuǎn)化體的樣品中獲得擴增信號，而在其他轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、非轉(zhuǎn)基因玉米混樣和陰性樣品中均未獲得擴增信號；在靈敏度檢測中，7 家實驗室均從質(zhì)量分數(shù)為0.05%的雙抗12-5 樣品中獲得擴增信號。8 家實驗室具體驗證結(jié)果見表5。

表5 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR 方法驗證結(jié)果匯總表

綜上說明，研發(fā)單位提供的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR 檢測方法具有良好的特異性，檢測靈敏度達到0.05%。

2.2.2 標準曲線的建立及擴增效率測試 對8 家實驗室建立的雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體和zSSIIb內(nèi)標基因的標準曲線數(shù)據(jù)匯總分析，具體如下：內(nèi)標基因zSSIIb的標準曲線斜率范圍在-3.572--3.128 之間，平均值為-3.309。根據(jù)斜率計算的PCR 擴增效率為90.55%-108.75%之間，平均值為100.94%，符合農(nóng)業(yè)部標準［5］中大于90%和小于110%的要求。決定系數(shù)R2值均大于0.98，平均值為0.996，符合農(nóng)業(yè)部標準［5］中大于0.98 的要求；雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體的標準曲線斜率范圍在-3.569-3.127 之間，平均值為-3.372。根據(jù)斜率計算的PCR 擴增效率為90.65%-108.85%之間，平均值為98.36%，符合農(nóng)業(yè)部標準［5］大于90%和小于110%的要求。決定系數(shù)R2值均大于0.98，平均值為0.996，符合農(nóng)業(yè)部標準［5］大于0.98 的要求。具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 玉米內(nèi)標基因zSSIIb 和雙抗12-5 的擴增效率及標準曲線決定系數(shù)

綜上，8 家實驗室的雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體和zSSIIb內(nèi)標基因檢測體系的擴增Ct 值與模板拷貝數(shù)間均存在良好的線性關(guān)系，所建立的標準曲線均可用于定量PCR 結(jié)果分析。

2.2.3 準確性測試 將8 家實驗室提供的數(shù)據(jù)和結(jié)果進行匯總分析，采用科克倫（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法對測試結(jié)果進行異常值檢驗，在實驗室數(shù)量為8、置信區(qū)間為5%的條件下，科克倫檢驗和格拉布斯檢驗的臨界值分別為：0.680 和2.126［8］，分別計算8 家實驗室的科克倫統(tǒng)計量C 值和格拉布斯統(tǒng)計量G 值［8］。經(jīng)計算，5%質(zhì)量分數(shù)樣品中1 號實驗室的G 值和6 號實驗室的C 值大于臨界值，為2 組異常值，0.5%質(zhì)量分數(shù)樣品無異常值。剔除異常值后，計算出每個實驗室2 份準確性樣品的測量平均值，得出測量值與真值的偏差（Bias），6 家實驗室5%樣品測試值與真值的偏差的范圍在-8.30%-0.40%之間，8 家實驗室0.5%樣品測試值與真值的偏差的范圍在-10.0%-62.0%之間（見圖3）。綜合8 家實驗室中的有效數(shù)據(jù)計算5%和0.5%準確性樣品的測量平均值分別為4.88%和0.61%，偏差分別為2.47%和21.38%，大多數(shù)的偏差主要是正值，具體數(shù)據(jù)見表7。質(zhì)量分數(shù)為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品的偏差小于25%。驗證結(jié)果表明，雙抗12-5 定量方法能準確地定量檢測質(zhì)量分數(shù)為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品。

圖3 8 家實驗室測量值與真值相對偏差示意圖

2.2.4 重復(fù)性和再現(xiàn)性 根據(jù)剔除異常值后的準確性樣品測試結(jié)果，計算8 家實驗室內(nèi)重復(fù)性相對標準偏差（RSDr值）和實驗室間再現(xiàn)性的相對標準偏差（RSDR值），見表8。8 家實驗室定量檢測質(zhì)量分數(shù)為5%、0.5%雙抗12-5 樣品的RSDr值均介于1.13%-20.20%之間，符合農(nóng)業(yè)部標準中RSDr ≤ 25%的要求［5］，說明該方法在實驗室內(nèi)具有良好的重復(fù)性；8 家實驗室定量檢測質(zhì)量分數(shù)為5%、0.5% 雙抗12-5 樣品的RSDR值分別為4.52%、18.43%，符合農(nóng)業(yè)部標準中RSDR≤ 35%的要求［5］，說明該方法在實驗室間具有良好的再現(xiàn)性。

3 討論

目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法主要分為兩類：基于外源核酸的檢測技術(shù)和基于外源蛋白的檢測技術(shù)［9］。由于核酸在提取、保存及穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢，使得基于核酸的檢測方法在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中得到快速發(fā)展。根據(jù)檢測靶標的不同，基于核酸的檢測方法分為篩查檢測、基因特異性、構(gòu)建特異性檢測和轉(zhuǎn)化體特異性檢測4 種類型［10］。轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法以外源插入序列與植物基因組的連接區(qū)為檢測靶標，不僅能檢出轉(zhuǎn)入基因序列，還可判定待測樣品的轉(zhuǎn)基因作物品系，具有高度特異性，是國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準建立的主要方法［11-12］。基于核酸的檢測方法有普通定性PCR、實時熒光定量PCR、多重復(fù)合PCR［13］、數(shù)字PCR［14］、重組聚合酶擴增（RPA）［15］、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)PCR 方法［16］等，其中定性PCR、實時熒光定量PCR 應(yīng)用最為廣泛［17］。中國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準以定性PCR 方法為主，而歐盟聯(lián)合實驗室則以實時熒光定量PCR 方法為主［18］。定性PCR 操作相對簡單，儀器和試劑成本較低，但是相應(yīng)的分辨率低，只可以做定性判斷。實時熒光定量PCR 相對準確靈敏，不僅可以定性，而且可以判斷轉(zhuǎn)基因成分準確含量，但儀器和成本大幅提高，且需要制備標準品。

表7 準確性樣品的測試結(jié)果

表8 RSDr 值和RSDr 值計算結(jié)果

本研究對2020 年獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性、定量PCR 方法進行驗證和評價。雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 方法從特異性和靈敏度等指標進行驗證，結(jié)果顯示，該方法能從含有雙抗12-5 的樣品中特異性地檢測出預(yù)期片段，而在Bt11 等19 種其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、GTS40-3-2 等14 種轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、TT51-1 等8種轉(zhuǎn)基因水稻混樣、MON1445 等7 種轉(zhuǎn)基因棉花混樣、MS1 等10 種轉(zhuǎn)基因油菜混樣中未檢出雙抗12-5轉(zhuǎn)化體成分，有效區(qū)別其他常見轉(zhuǎn)基因品種，未出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶，具有高度特異性，檢測靈敏度可以穩(wěn)定達到0.1%，而且8 家實驗室驗證結(jié)果一致，表明方法有較好的實驗室間再現(xiàn)性。

雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR 方法從特異性、靈敏度、準確性、精密度等指標來進行驗證和評價。驗證結(jié)果顯示，雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR 具有高度特異性，且檢測靈敏度可以穩(wěn)定達到0.05%。準確性是評價方法的基本要求，我們對8 家實驗室建立的標準曲線進行了分析，雙抗12-5 的標準曲線斜率范圍在-3.569--3.127 之間，擴增效率在90.65%-108.85%之間，R2值均大于0.98，說明模板的量和Ct 值有很好的相關(guān)性，均滿足定量分析的要求［5］。采用科克倫（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法剔除異常值后，得出5%、0.5%準確性樣品對應(yīng)的測量平均值分別為4.88%、0.61%，偏差分別為2.47%、21.38%，表明雙抗12-5 定量方法能準確地定量檢測質(zhì)量分數(shù)為5%和0.5%的樣品，具有較好的準確性。精密度是用來表示測試結(jié)果之間的接近程度，精密度越高，說明各次測量數(shù)據(jù)比較接近［19］。RSDr 值和RSDR值是反映方法精密度的重要指標［8］。8 家實驗室RSDr 值均介于1.13%-20.20%之間，兩個準確性樣品的RSDR值分別為4.52%、18.43%，精密度符合要求［5］，說明該方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

4 結(jié)論

本研究組織了8 家實驗室對我國新批準安全證書的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5 轉(zhuǎn)化體特異性定性、定量PCR 方法進行了循環(huán)驗證，驗證結(jié)果表明定性與定量PCR 檢測方法均具有穩(wěn)定性好、特異性強和靈敏度高的特點，定量PCR 方法能精確地定量檢測質(zhì)量分數(shù)為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品，并且具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。本研究有助于后續(xù)標準方法的建立和完善，為我國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐和決策依據(jù)。