等溫擴增技術(shù)及其結(jié)合CRISPR 在微生物快速檢測中的研究進展

高威芳 章禮平 朱鵬，2

（1. 寧波海洋研究院，寧波 315832；2. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，寧波 315832）

病原微生物是指可以侵犯人體與動植物、引發(fā)感染甚至傳染現(xiàn)象的微生物，其中以細(xì)菌和病毒的危害性最大［1-4］。病原微生物威脅著人類公共衛(wèi)生系統(tǒng)，它們通過環(huán)境（空氣、水源）或食物進入到動物或人體，引發(fā)多種疾病，甚至爆發(fā)大面積、突然的疫情，嚴(yán)重威脅動物和人類的生命，因此，對病原微生物的防控至關(guān)重要，而針對病原微生物的準(zhǔn)確快速的檢測技術(shù)是防控病原微生物的必要手段。

對病原微生物檢測的傳統(tǒng)策略主要是微生物培養(yǎng)及鑒定方法，操作繁瑣，費時費力。然而準(zhǔn)確的判定致病微生物來源具有時間關(guān)鍵性（Timecritical）［5-6］，若不能及時得出正確的結(jié)論，很可能錯過最佳時機。這樣的延遲是造成發(fā)病率和死亡率上升的重要原因，不適當(dāng)?shù)目咕煼ㄒ驯蛔C明能使嚴(yán)重感染的存活率降低5 倍［5］。而且傳統(tǒng)培養(yǎng)法只適用于可培養(yǎng)的活菌，對于活的但非可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)下的微生物或者對生長培養(yǎng)環(huán)境非常挑剔的微生物無法進行分離、培養(yǎng)和鑒定，這就需要其他的檢測手段。

核酸體外擴增技術(shù)的發(fā)明補充了傳統(tǒng)檢測方法的不足，相關(guān)技術(shù)被大量應(yīng)用于傳染病、食源性致病菌污染、環(huán)境污染、腫瘤的遺傳標(biāo)記物等分析中［7］。其中PCR 是比較成熟的一項技術(shù)，通過快速擴增病原微生物中帶有其物種特異性信息的核酸，在幾個小時內(nèi)就能將病原微生物鑒定出來。但是因為PCR需要精密控溫的溫度循環(huán)器，該儀器的價格比較昂貴，又不夠便攜。而且，由于許多樣品中含有PCR反應(yīng)抑制物，使得PCR 檢測中通常對樣品準(zhǔn)備的要求比較嚴(yán)苛。以上這些因素使PCR 技術(shù)往往在實驗室中使用，而不能在現(xiàn)場檢測中發(fā)揮作用。所以，不依賴熱循環(huán)儀的等溫擴增技術(shù)得到了廣泛關(guān)注。等溫擴增技術(shù)對儀器要求簡單，在保證較高的靈敏度和特異性基礎(chǔ)上，對樣品中抑制劑的抗性也較強，擴增時間短，便于實現(xiàn)現(xiàn)場實時監(jiān)控，非常適用于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測。

通常，基于核酸等溫擴增技術(shù)的快速檢測有3個關(guān)鍵步驟：核酸提取、等溫擴增和產(chǎn)物檢測。核酸等溫擴增技術(shù)發(fā)展過程中需要解決一些問題，比如如何進一步簡化并提高核酸提取效率、盡可能擺脫儀器約束以適應(yīng)條件有限的現(xiàn)場環(huán)境、拓寬等溫擴增的反應(yīng)溫度范圍、提高反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和對抑制劑的抗性、提高核酸擴增效率、降低檢測成本等。為了解決這些困難，諸多研究者針對核酸擴增技術(shù)的3 個關(guān)鍵步驟進行了優(yōu)化與改進，使該類技術(shù)在準(zhǔn)確度、靈敏度、便攜性等方面的優(yōu)勢更加突出，促進核酸等溫擴增技術(shù)的科學(xué)、快速發(fā)展。本文分別從這3 個環(huán)節(jié)出發(fā)，詳細(xì)闡述基于等溫擴增的核酸快速檢測技術(shù)的發(fā)展，介紹本課題組研究涉及到的兩項等溫擴增技術(shù)：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA），主要關(guān)注其在病原微生物快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展，并結(jié)合最新研究成果，對核酸快速檢測技術(shù)未來發(fā)展進行思考和展望，以期對相關(guān)研究起到推動作用。

1 核酸快速提取技術(shù)研究

核酸提取是核酸擴增技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，但因為從生物樣品中提取核酸的實驗室方法通常比較繁瑣，其在現(xiàn)場檢測的使用常受到限制。研究者試圖尋找一種簡便、快速、高效、低耗能的核酸提取方法。

常用的固相提取試劑盒快速提取核酸的原理是在離液序列高的環(huán)境（Chaotropic agents）下［8］將核酸結(jié)合在固相二氧化硅支持物上，雜質(zhì)則通過一系列的清洗和離心步驟去除，最后在低濃度鹽溶液中將核酸從支持物中洗脫下來。但是這樣的方法仍然依靠離心機。而且膜基質(zhì)上殘留的物質(zhì)（如乙醇、Chaotropic agents）可能抑制下游DNA的擴增［9］。另外，磁珠法提取核酸采用經(jīng)過特殊修飾的磁珠進行核酸的特異性捕捉和純化［10］，擺脫了對離心的依賴，通過外磁場作用分離固液相，防止在清洗和洗脫過程中核酸的流失，磁珠法能夠快速地提取核酸，約需10 min，而且不需要電器設(shè)備。因此，磁珠法通常適合基質(zhì)成分復(fù)雜的樣品檢測，如用于提取糞便標(biāo)本的核酸［11-12］，但因為磁珠處理成本較高，限制了此方法在快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。由此，研究者致力于篩選穩(wěn)定、靈敏的抗體的同時，需要考慮該方法在實際應(yīng)用中的成本問題，或考慮尋找成本更加低廉的核酸提取材料，以滿足經(jīng)濟條件較差的地區(qū)的要求。

目前有一些關(guān)于膜法快速提取核酸的報道，包括氧化鋁膜［13］、基于二氧化硅的Fusion 5 號 膜［14-15］、基于纖維素膜的FTA 卡紙［16］。這些新的方法直接將核酸從膜上轉(zhuǎn)移到擴增體系中，省去核酸洗脫步驟，達到簡化核酸純化的目的。盡管這樣，這些方法仍然因為復(fù)雜的制造工藝或?qū)嶒炃疤幚矶拗破湓诤怂峥焖贆z測中得到更實際有效的應(yīng)用。然而纖維素膜便宜、易得、一次性且易修飾，顯然是非常理想的材料［17-19］。因此，如何發(fā)揮纖維素膜材料的自身優(yōu)勢，開發(fā)既操作簡便，又能與下游核酸擴增反應(yīng)順利銜接的膜法核酸快速提取方法，是核酸快速提取技術(shù)發(fā)展中非常有意思的切入點。從這一點來看，纖維素膜材料的篩選、改性以及核酸提取試劑的優(yōu)化將是未來值得研究的方向。

2 核酸等溫擴增技術(shù)研究

核酸擴增是關(guān)系到后續(xù)檢測準(zhǔn)確性的一個必要步驟，因為核酸指數(shù)擴增步驟為結(jié)果判斷提供了足夠的核酸濃度，能夠避免由于樣品濃度過低或受到背景值影響較大而被判斷為假陰性的情況。近幾年，一些等溫擴增技術(shù)已有商業(yè)化的產(chǎn)品，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）［20］、重組酶聚合酶擴增（RPA）［21］、等溫指數(shù)擴增反應(yīng)（Isothermal exponential amplification reaction，EXPAR）［22］、依賴解旋酶恒溫擴增反應(yīng)（Helicase-dependent amplification，HDA）［23］、 鏈置換擴增（Strand displacement amplification，SDA）［24］、依 賴核酸序列型擴增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）［25］、滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）［26］等。等溫擴增技術(shù)是核酸快速檢測發(fā)展中的后起之秀，兼具準(zhǔn)確性和現(xiàn)場檢測適用性，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、疾病診斷等相關(guān)病原微生物快速檢測領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用研究

在等溫擴增技術(shù)中，LAMP 是研究較多的一種方法，該方法最初由Notomi 等［20］設(shè)計，通過針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計了4 種特異性引物，利用具鏈置換活性的BstDNA 聚合酶在恒溫條件下（60-65℃）高效（0.5-1 h）擴增目標(biāo)DNA。如今，LAMP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品過敏源、轉(zhuǎn)基因成分及致病菌的快速檢測中。不僅如此，結(jié)合了LAMP 的快速、高效與側(cè)向流層析試紙條（Lateral flow dipstick，LFD）的便攜、靈敏、結(jié)果可視化等優(yōu)勢，LAMPLFD 技術(shù)應(yīng)用于病原微生物快速檢測領(lǐng)域的相關(guān)研究已蔚然成風(fēng)（表1），檢測靈敏度能夠達到pg 數(shù)量級的DNA，甚至更微量，或者是單拷貝數(shù)和單菌落的病原微生物等。

本課題研究者主要關(guān)注LAMP 技術(shù)在有毒有害藻類快速檢測中的應(yīng)用（表1），在此基礎(chǔ)上拓寬LAMP 技術(shù)的應(yīng)用范圍將是未來的一個意義重大的研究方向。而且LAMP 已成為商檢行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)常用方法。根據(jù)國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的食品安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，LAMP 方法已被應(yīng)用于23 個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)涉及20 種食源性致病菌的快速檢測［27-49］，這說明LAMP 方法得到了制度層面的認(rèn)可。為了保護我國的食品安全，需要研究者開發(fā)更多針對食源性致病菌的基于LAMP 方法的穩(wěn)定、高效、快速的適用于野外現(xiàn)場條件的快速檢測方法，以促進相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)更快、更科學(xué)的制定。

2.2 核酸等溫擴增技術(shù)與基因編輯技術(shù)結(jié)合的創(chuàng)新研究

重組酶聚合酶擴增技術(shù)是本實驗室關(guān)注的另一種非常適用于現(xiàn)場快速檢測的核酸等溫擴增技術(shù)。RPA 于2006 年被發(fā)明出來，該方法反應(yīng)條件溫和（37-42℃），并且能在20 min 以內(nèi)完成核酸擴增，檢測靈敏度卻可與LAMP 相媲美，針對RPA 的原理及其在醫(yī)療診斷、食品、農(nóng)業(yè)等方面的研究進展我們已經(jīng)做過專題綜述［75］，本文將關(guān)注等溫擴增技術(shù)與基因編輯技術(shù)的創(chuàng)新結(jié)合，期望對核酸等溫擴增檢測技術(shù)的未來發(fā)展帶來啟發(fā)。

2.2.1 RPA 與基因編輯技術(shù)的結(jié)合 2017 年，美國麻省理工學(xué)院張鋒教授所在團隊對RPA 技術(shù)的檢測能力做了全新詮釋，即等溫擴增技術(shù)與基因編輯技術(shù)的雙劍合璧為核酸等溫擴增檢測技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)建了一個新的平臺。研究表明，RPA 能與一種被稱為CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/ Cas13a 的基因編輯系統(tǒng)相結(jié)合，其檢測靈敏度達到了attomolar 級（attomolar =10-3fmol），能夠識別單個堿基差異［76］。檢測的原理是通過RPA 或RT-RPA 實現(xiàn)目標(biāo)核酸的指數(shù)擴增，反轉(zhuǎn)錄成RNA，Cas13a 蛋白在crRNA 引導(dǎo)下定位目標(biāo)RNA，切割核酸，同時激活Cas13a 蛋白的附屬效應(yīng)（Collateral effect），切割帶有熒光和猝滅基團標(biāo)記的二核苷酸（Di-nucleotide motifs），使反應(yīng)體系發(fā)出熒光，熒光信號被捕捉，實現(xiàn)目標(biāo)基因的檢測。研究者賦予這種結(jié)合一個新的名稱：SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）（ 圖1-A），并將其應(yīng)用于寨卡病毒、登革熱病毒、病原菌、人類基因分型及游離DNA 癌變基因檢測，靈敏度和特異性都非常理想［76］。2018 年，張峰團隊對SHERLOCK 進行完善［77］，降低反應(yīng)體系引物濃度為240 nmol/L，開發(fā)多重?zé)晒舛繖z測多個靶標(biāo)的方法，定量檢測限低至2 amol/L 的寨卡病毒RNA。

表1 LAMP 快速檢測在病原微生物及藻類中的應(yīng)用研究

同年，張峰團隊與哈佛大學(xué)研究人員合作，進一步推進SHERLOCK 在病毒快速檢測方面的實際應(yīng)用。采用RPA 擴增20 min 后，用CRISPR/ Cas13系統(tǒng)孵育1 h 即可完成寨卡病毒cDNA 的檢測，靈敏度達到0.9 amol/L，也就是說能夠檢測到1 μL 里的單拷貝數(shù)的寨卡病毒［78］。同時，他們提出，通過加熱消除核酸酶但不對核酸進行專門的提取純化 （Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases，HUDSON）（圖1-B）也可以實現(xiàn)微生物核酸的高靈敏檢測，即通過加熱使病毒和核酸酶失活。研究者采用HUDSON 處理樣品，結(jié)合SHERLOCK，并通過試紙條顯色將檢測結(jié)果可視化，實現(xiàn)2 h 內(nèi)體液中寨卡病毒的RNA 快速檢測，全血、血清、唾液、尿液4 種不同基質(zhì)中的靈敏度分別為90 amol/L、90 amol/L、0.9 amol/L 和20 amol/L。

不僅如此，美國加利福尼亞大學(xué)Doudna 研究團隊通過實驗證明，Cas12a 也可以與RPA 結(jié)合（圖1-C），他們將這種結(jié)合起名為“DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter（DETECTR）”［79］。DETECTR 被用于HPV 病毒的快速檢測，靈敏度達到了attomolar 水平，特異性為≤ 7 個堿基。因為Cas12a-crRNA 能夠識別單鏈或雙鏈DNA，DETECTR不需要將底物轉(zhuǎn)換成RNA，省去了反轉(zhuǎn)錄步驟，因此，與SHERLOCK 相比，DETECTR 的操作更加簡便。2018 年10 月，Doudna 團隊將新發(fā)現(xiàn)的一種更小的Cas14 蛋白［80］與RPA 結(jié)合，進行高靈敏度、高特異性的診斷和檢測方法研究。實驗證明，Cas14-DETECTR 比Cas12-DETECTR 的特異性更高，能達到單堿基。作者將該方法應(yīng)用于SNP 基因分型，進行核酸等溫擴增技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域的創(chuàng)新探究。

圖1 CRISPR 與RPA 結(jié)合［76，78-79］

2.2.2 EXPAR 與基因編輯技術(shù)的結(jié)合 華南師范大學(xué)周小明研究團隊［81］利用Cas9 能作用于ssDNA的特性，將CRISPR/ Cas9 與等溫指數(shù)擴增反應(yīng)（EXPAR）結(jié)合（圖2），特異性高，檢測靈敏度為0.82 amol/L，并將此方法成功應(yīng)用于DNA 甲基化和單增李斯特菌mRNA 的快速檢測。

Cas12、Cas13、Cas14 及Cas9，都將等溫擴增技術(shù)的檢測水平提升到了更靈敏、更特異、更高效、更便捷的水平。因此，等溫擴增技術(shù)與基因編輯技術(shù)的結(jié)合在檢測領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿赡艹跸胂?，相關(guān)的應(yīng)用研究意義重大。期望這兩項技術(shù)的結(jié)合在未來能夠被更加廣泛地應(yīng)用于病原微生物的快速檢測、SNP 檢測、腫瘤篩選、抗生素抗性篩選等領(lǐng)域中，發(fā)揮核酸等溫擴增技術(shù)最大的優(yōu)勢。

3 擴增產(chǎn)物檢測技術(shù)研究

核酸等溫擴增產(chǎn)物有多種檢測方法，繁簡程度不同，有研究者將其分為電化學(xué)檢測方法和光學(xué)檢測方法［82］。然而適用于現(xiàn)場快速檢測場合的理想方法是操作簡單、不需要昂貴的儀器，甚至是不借助任何儀器，比如用肉眼就可以讀出結(jié)果，而且結(jié)果的呈現(xiàn)方式便于使用者進行判斷。從這個角度來說，基于比色和熒光的光學(xué)檢測方法更加適合配搭核酸等溫擴增技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用［83］。

常用的核酸等溫擴增產(chǎn)物的便攜的光學(xué)檢測方法有實時熒光法、可視化熒光染料法、免疫試紙條法、濁度法、比色法等。有學(xué)者對核酸等溫擴增產(chǎn)物的檢測方法做了詳細(xì)的介紹［82，84］，這里不再贅述。這里將探討既廉價又方便的紙質(zhì)材料在核酸等溫擴增產(chǎn)物檢測中的應(yīng)用前景。

圖2 CAS-EXPAR 的原理圖［81］

紙質(zhì)材料作為最便宜的基質(zhì)，具有輕、薄、靈活、便于儲存、環(huán)保的特點，其白色的表面非常適用于比色檢測。而且紙能夠利用毛細(xì)作用推動液體流動，省去了對泵的需求。因此，紙質(zhì)材料是目前低廉核酸等溫擴增檢測設(shè)備的最理想材料。側(cè)向流層析試紙條（LFD）是紙基檢測設(shè)備中深受歡迎、應(yīng)用頻繁的一種核酸擴增產(chǎn)物分析工具［83］，非常適用于未經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練的操作者使用，而且具有至少一年的保存期，這些優(yōu)點推動了LFD 的商業(yè)化發(fā)展。但是直接使用試紙條檢測存在靈敏度不足的問題。

解決這個難題的一種途徑是將紙基材料與其他工具結(jié)合起來，實現(xiàn)相得益彰的效果。事實上，這一方面的研究已取得進展，比如聯(lián)合量子點技術(shù)檢測妊娠測試中的人絨毛膜促性腺激素［85］，聯(lián)合生物傳感器檢測獸藥殘留［86］，以及聯(lián)合等溫擴增技術(shù)檢測致病菌［77，87-89］等。這些LFD 主要采用的是膠體金作為標(biāo)記物，借助核酸等溫擴增技術(shù)快速、便攜等優(yōu)勢，核酸等溫擴增-LFD 技術(shù)在病原微生物的檢測方面得到了快速發(fā)展，涉及醫(yī)療診斷、藥物測試以及食品質(zhì)量監(jiān)督等多個領(lǐng)域。由此可見，核酸等溫擴增-LFD 技術(shù)的創(chuàng)新開發(fā)與研究將仍是未來快速檢測研究的熱點。

4 總結(jié)與展望

為了滿足核酸等溫擴增檢測的需要，必須明確三大關(guān)鍵步驟相關(guān)技術(shù)上的短板，才能針對每一個環(huán)節(jié)選擇正確的材料和技術(shù)。隨著研究的發(fā)展，新的技術(shù)與材料擴寬了研究思路，并且已有的研究表明，創(chuàng)新的嘗試有很多驚喜的發(fā)現(xiàn)和突破。比如紙基材料在核酸提取和檢測方面的創(chuàng)新增加了現(xiàn)場檢測設(shè)備的靈活性，為現(xiàn)場快速檢測提供更多的可能；隨著研究的不斷深入，核酸等溫擴增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多種微生物快速檢測，還有更多領(lǐng)域值得探究；以及核酸等溫擴增技術(shù)與最新的基因編輯技術(shù)的結(jié)合，將檢測診斷技術(shù)的靶標(biāo)精準(zhǔn)性與檢測速度都提升到了更高的水平?？偠灾徽撌菑募夹g(shù)方面，還是材料改進方面，已經(jīng)報道出來的研究都表明研究者正努力推動著核酸等溫擴增技術(shù)快速發(fā)展，為中心實驗室外的病原微生物快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用創(chuàng)造更多的便利，為進一步實現(xiàn)核酸等溫擴增檢測技術(shù)更低的材料成本、更簡化的操作步驟提供新思路。