2019冠狀病毒病研究紀實：至2020年3月11日

苗 根，丁翠玲，彭浩然，戚中田

2019年12月1日，武漢市出現(xiàn)首例不明原因肺炎病例；2020年1月8日確認病原體為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)；2020年1月31日世界衛(wèi)生組織(WHO)將病原體暫命名為2019新冠病毒(2019-nCoV)；2020年2月8日國家衛(wèi)健委將該不明原因肺炎命名為新型冠狀病毒肺炎；2020年2月11日，WHO依據(jù)規(guī)則將新冠肺炎正式命名為2019冠狀病毒病(COVID-19)；同日，國際病毒分類委員會將2019新冠病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[1-2]。2020年3月11日，WHO將新冠疫情流行趨勢升級為全球大流行狀態(tài)。2019-nCoV是第7種人類冠狀病毒，為有包膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。不同于一般情況下僅引起上呼吸道感染癥狀的HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-HKU1， 2019-nCoV與重癥急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征(MERS)冠狀病毒(MERS-CoV)均為高致病性冠狀病毒。本文擬以時間為軸線，從病原體、病毒宿主、流行病學、檢測方法、致病機制和臨床診療6個方面記述2019冠狀病毒病研究的重要進展。

1 病原體研究時間軸

2020年1月5日，張永振團隊率先公布了2019-nCoV全基因組序列(GenBank: MN908947.3，全長29 903 bp)。2020年1月6日，國家疾病預防控制中心從不明原因肺炎患者臨床樣本中分離到第1株病毒(CHPC 2020.00001；NPRC 2020.00001)。2020年1月24日，新型冠狀病毒國家科技資源服務系統(tǒng)(http://nmdc.cn/#/nCoV)正式啟動并發(fā)布了我國第一株臨床樣本分離毒株的信息及電鏡照片，此后陸續(xù)發(fā)布了病毒核酸檢測引物和探針序列等重要信息。2020年2月7日，上海市疾病預防控制中心和復旦大學團隊利用vero-E6和Huh7細胞分離培養(yǎng)獲得病毒毒株。2020年2月21日，瑞士伯爾尼大學利用反向遺傳學策略，合成有活性的2019-nCoV[3]。2020年3月7日，Peter Doherty研究人員展示了2019-nCoV的mRNA序列[4]。截至2020年3月10日，國家生物信息中心2019新型冠狀病毒信息庫[5]共收集2019新型冠狀病毒序列408條(其中我國193條)，國際GISAID數(shù)據(jù)庫收錄2019新型冠狀病毒基因組序列264條。

從分類學角度，2019-nCoV與SARS-CoV同屬于冠狀病毒科、冠狀病毒亞科、β 冠狀病毒屬、類 SARS 冠狀病毒種。2020年2月17日，廣東省疾病預防控制中心研究指出廣東2019-nCoV基因序列與武漢早期病毒基因組之間基本無突變[6]，2020年2月21日，Yu 等[7]發(fā)現(xiàn)93個2019-nCoV樣本基因組同源性超過99%，編碼區(qū)僅存在120個核苷酸位點差異。2020年3月3日，Tang 等[8]分析了103條2019-nCoV基因組序列，顯示共有149個位點突變，整體突變率較低。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析顯示，病毒目前存在L和S兩個亞型，其中L型分布更廣(70%)，S型相對更古老。2020年3月7日，Shu等[9]分析146個基因組后顯示共80個單倍型、183個突變位點，其中85%(156/183)為單突變位點(singleton)。2020年2月7日，中國醫(yī)學科學院和北京協(xié)和醫(yī)學院研究團隊[10]對首次公布的2019-nCoV基因組(GISAID編碼：EPI_ISL_402119，EPI_ISL_402120，EPI_ISL_402121)進行注釋，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV編碼27種蛋白質，包括15種非結構蛋白(nsp1-nsp10，nsp12-nsp16)、4種結構蛋白(S、E、M和N)和8種輔助蛋白(3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14)。2019-nCoV與SARS-CoV氨基酸序列對比結果顯示兩者組成相似，但編碼的輔助蛋白3b、8b存在顯著差異，且2019-nCoV缺失了SARS-CoV編碼的8a蛋白。進一步對2019-nCoV與SARS/SARS類似冠狀病毒保守序列進行比對，顯示存在380個差異性氨基酸位點，其中S蛋白中差異性位點主要分布在受體結合域(receptor-binding domain, RBD)和抗原表位區(qū)域，這些可能與2019-nCoV傳染性和致病力有關。

2 病毒宿主研究時間軸

中國動物衛(wèi)生與流行病學中心團隊檢測了4 800余份近年來收集的豬、禽、犬、貓等動物樣品，2019-nCoV核酸檢測均為陰性，而在另一項針對武漢華南海鮮市場及其他多家生鮮市場的585份環(huán)境標本及動物標本的檢測中，有33份陽性，其中31份來自經(jīng)營野生動物的西區(qū)，提示此次疫情可能與野生動物交易有關。

蝙蝠是多種冠狀病毒的自然宿主。迄今為止，動物冠狀病毒中云南中華菊頭蝠攜帶病毒(Bat CoV RaTG13)與2019-nCoV全基因組序列一致性最高(96.2%)，提示云南中華菊頭蝠很可能是2019-nCoV的自然宿主[11]。2020年1月22日、2月2日、2月26日的3篇研究分別通過同義密碼子相對使用度(RSCU)偏好性、感染模式分析、S蛋白序列對比分析推測蛇、水貂和龜類可能是將2019-nCoV傳播給人類的潛在中間宿主[12-14]。2019年10月24日，Liu等[15]通過測序揭示馬來西亞穿山甲體內(nèi)病毒基因組片段與SARS-CoV及類SARS-CoV相應序列一致性高達80%～89%。2020年2月13日-2月20日，美國貝勒醫(yī)學院、香港大學、華南農(nóng)業(yè)大學、云南大學、廣東省生物資源應用研究所等研究發(fā)現(xiàn)穿山甲冠狀病毒與2019-nCoV RBD氨基酸序列一致性高于97%，但全基因組序列一致性為85.5%～92.4%[16-20]，而之前的研究證明SARS-CoV與中間宿主果子貍冠狀病毒基因一致性高達99.8%，這似乎并不支持穿山甲為2019-nCoV中間宿主的論點。但2019-nCoV的S蛋白RBD中與受體結合相關的6個氨基酸位點與穿山甲冠狀病毒的相應位點完全相同(L455L、F486F、Q493Q、S494S、N501N和Y505Y)(圖1)，這是在其他冠狀病毒都不存在的[18]，從適應人類細胞受體看，穿山甲似乎符合2019-nCoV為中間宿主的觀點，但是目前尚缺乏進一步的流行病學證據(jù)。因此，穿山甲是否為2019-nCoV從蝙蝠到人的中間宿主，尚有待進一步查證。

蝙蝠CoV RaTG13與2019-nCoV的全基因組同源性高達96.2%，但在S蛋白RBD存在關鍵差別(圖1)。蝙蝠CoV RaTG13 的S蛋白RBD中與ACE2結合的6個關鍵氨基酸位點，在2019-nCoV中突變了5個(L455L、L486F、Y493Q、R494S、D501N和H505Y)，但令人詫異的是，這些突變不但沒有影響2019-nCoV與其受體ACE2的親和力，反使它們的結合能力增強了10倍以上，這種功能增強性變異值得進一步研究。

(L455,F486,Q493,S494,N501,Y505)圖1 新冠病毒S蛋白受體結合域中發(fā)生突變的氨基酸[14-15, 19-20]Fig.1 Amino acid mutations in RBD of 2019-nCoV S protein

3 致病機制研究時間軸

新冠狀病毒S蛋白RBD與宿主細胞表面受體ACE2結合從而介導細胞感染[11, 21]，宿主細胞蛋白酶TMPRSS2是S蛋白的啟動劑，其抑制劑camostat mesylate可以保護細胞免受2019-nCoV感染[22]。因此，進一步解析2019-nCoV S蛋白RBD、ACE2和兩者相互作用的復合物結構將有助于闡明感染機制。

尤其值得注意的是，2019-nCoV基因組的S1和S2亞基交界處多出一段在其他冠狀病毒(如SARS-CoV、蝙蝠-CoV和穿山甲-CoV)中不存在的、連續(xù)的12個核苷酸序列，編碼1個脯氨酸、2個精氨酸和1個丙氨酸(PRRA)，從而形成一個弗林酶(furin)酶切位點(RARR)(圖2)。研究表明，弗林酶切位點有助于禽流感病毒和新城疫病毒的組裝與成熟，與增強傳染性和致病性相關[24, 28, 31-32]。

(S673、T678和S686)圖2 新冠病毒S1與S2亞基交界處的酶切位點和O-糖基化位點[18, 32-33]Fig.2 S1/S2 site of 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site and O-link glycan residues

值得注意的是，COVID-19患者進展為重癥乃至死亡與細胞因子風暴的發(fā)生發(fā)展密切相關。臨床觀察表明重癥患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)過度激活， IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎性細胞因子水平顯著升高，可引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭，最終威脅生命[33-34]。此外，肺部穿刺病理活檢和尸檢報告指出COVID-19患者病理主要表現(xiàn)為肺部炎癥反應[35]。

4 流行病學研究時間軸

2020年1月20日，新冠肺炎被納入我國法定報告的乙類傳染病，并按甲類傳染病采取防控措施。2020年1月23日，全國各省市開始陸續(xù)實施大城市隔離政策。至2020年 1月25日2019-nCoV的R0值(R naught，基本再生數(shù))為2.68(95%CI=2.47～2.86)[36]。后續(xù)研究顯示，全國和武漢總體R0分別為4.5 (95%CI= 4.4～4.6) 和4.4 (95%CI=4.3～4.6)[37]。

SEIR 傳染病模型(Susceptible-Exposed-Infectious-Removed)預測顯示，國內(nèi)疫情在2020年2月底達到峰值，4月底將趨于平緩[38]，但實際在2月中旬即達到峰值，這可能與全國范圍內(nèi)的強力防控措施有關。武漢是最早公開通報發(fā)現(xiàn)疫情的地方，在病原體判定為新型冠狀病毒之后，2020年1月11日武漢市衛(wèi)健委首次通報41例新冠病毒肺炎病例。2020年1月21日國家衛(wèi)健委首次通報全國疫情共3省(區(qū)、市)新增確診病例77例， 2月4日新增病例數(shù)達到3 887例， 2月12日新增病例數(shù)達到整個疫情期間峰值15 152例(含湖北臨床診斷病例13 332例)，此后新增病例數(shù)不斷減少，至2020年3月7日已降至44例。

世界范圍內(nèi)，自2020年1月13日、15日、20日、22日，泰國、日本、韓國和美國分別開始通報出現(xiàn)首例確診病例，疫情開始全球蔓延。2020年1月30日，WHO宣布新冠肺炎疫情為“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”(PHEIC)。停泊日本的“鉆石公主號”郵輪(共3 711人)于2020年2月3日開始檢疫，2月5日確診10例，截至3月2日總共確診706例 。2020年2月28日，WHO將新冠肺炎疫情的風險級別從此前的“高”提至最高級別的“非常高”。2020年3月8日，意大利首次實行隔離，涉及包括倫巴第地區(qū)在內(nèi)的約1 600萬人口。截至2020年3月11日上午10時，中國境外共有113個國家/地區(qū)報告確診病例37 371例，死亡484例，3月10日-11日單日新增確診病例及死亡病例分別超過14%、29%。其中確診病例意大利10 149例、伊朗8 042例、韓國7 755例、法國1 774例、西班牙1 639例、德國1 296例、美國696例、日本568例。

當前認為傳染源主要是新型冠狀肺炎病毒感染的患者，無癥狀感染者也可成為傳染源。2020年1月份，河南安陽市和浙江杭州市篩查出2019-nCoV無癥狀感染者，此后湖北、廣東等地陸續(xù)出現(xiàn)報道，國外亦有相關報道[39-40]。國內(nèi)無癥狀感染者比例約為1.2%(889/44 672)[41]。2020年2月19日的一份研究指出無癥狀感染者上呼吸道病毒載量與有癥狀確診患者相當[42]，并可感染同居家庭成員[43]。值得注意的是部分無癥狀感染者在一段時間后可出現(xiàn)癥狀，因此真正的無癥狀感染者相對少見，不是傳播的主要因素。

病毒主要傳播途徑為呼吸道飛沫和密切接觸傳播，密閉環(huán)境中存在氣溶膠傳播可能。此外多項研究表明除呼吸道和血液樣本外，COVID-19患者糞便、尿液、淚液及結膜分泌物中病毒核酸檢測亦可陽性，其中部分患者糞便中可分離培養(yǎng)出活病毒[44-45]，因此應注意受病毒污染的環(huán)境可能造成病毒傳播。

人群普遍易感，多數(shù)COVID-19患者癥狀較輕，可以痊愈，但是部分可進展為呼吸困難。納入病例時間截至2020年1月22日、1月29日、2月20日的三份研究分別推算潛伏期為5.2 d、4 d、5～6 d[44, 46-47]，而2020年3月4日《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》中指出潛伏期1～14 d，多為3～7 d。

5 檢測方法研究時間軸

核酸檢測是疫情暴發(fā)初期新冠肺炎疑似病例確診的金標準。2020年1月26日，之江生物、捷諾生物和華大生物取得國家藥監(jiān)局頒發(fā)的第一批新冠病毒核酸檢測試劑盒醫(yī)療器械注冊證，此后不斷有新的核酸檢測產(chǎn)品投入使用。截至2020年3月8日，國家藥品監(jiān)督管理局已批準10種2019-nCoV核酸檢測試劑盒。核酸診斷標本多為血液、上呼吸道標本(咽拭子、鼻拭子、痰液)或下呼吸道標本(肺泡灌洗液、支氣管灌洗液)。2020年2月5日，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》曾將CT影像等納入臨床診斷標準。2020年2月18日，天津研發(fā)出CT圖像輔助診斷[48]。2020年2月22日和2月29日，4項針對血清IgM/IgG抗體檢測試劑盒分別獲批(其中兩項膠體金法：萬孚生物、英諾特(唐山)生物，兩項磁微?；瘜W發(fā)光法：博奧賽斯(重慶)生物)，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》將抗體檢測納入血清學診斷標準，2 d后抗體化學發(fā)光微粒子免疫檢測試劑盒(萬泰凱瑞)亦獲批準。美國疾病預防控制中心為應對疫情，于2020年2月4日、2月29日分別緊急審批了兩項診斷產(chǎn)品“CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel (CDC)”和“New York 2019-nCoV Real-time Reverse Transcriptase (RT)-PCR Diagnostic Panel”。

同時，一批新的檢測技術陸續(xù)問世。2020年2月14日，美國張鋒團隊發(fā)布了基于 CRISPR/Cas13檢測2019-nCoV的SHERLOCK 技術，僅需3步可在1 h內(nèi)完成檢測，但尚未進行樣本驗證[49]。2020年2月22日，清華大學參與研發(fā)的恒溫擴增芯片法新冠病毒檢測試劑盒獲批(成都博奧品芯)。此外，2020年2月25日，Lamb等[50-51]報告通過環(huán)介導等溫擴增和反轉錄相結合(reverse transcriptional-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)45 min內(nèi)檢出病毒RNA。2020年3月3日，Wang等[52]通過靶向測序(Nanopore Targeted Sequencing，NTS)檢測覆蓋病毒基因組及毒力相關重要基因。

6 臨床診療研究時間軸

截至目前，國家衛(wèi)健委先后制定了《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(簡稱診療方案，均為試行)共七版。2020年1月21-23日制定了第一至第三版診療方案，2020年1月27日公布了第四版，2020年2月5日公布了第五版，2020年2月10日公布了第五版的修正版，2020年2月18日公布了第六版，2020年3月4日公布了第七版。

診療方案第二版認為發(fā)熱、乏力、干咳為COVID-19患者主要表現(xiàn)。有研究收集2020年1月29日之前分布在全國30多個省市、552家醫(yī)院的1 099個確診病例信息后，認為發(fā)熱(入院時43.8%、住院時88.7%)和咳嗽(67.8%)是COVID-19患者最常見的癥狀，消化系統(tǒng)癥狀較為少見[46]。 納入病例時間截至2020年1月29日、2月11日、2月20日的3份報告指出COVID-19的總體粗病死率為1.4%、2.3%、3.8%[41, 44, 46]，其中病死率隨年齡增長而增加，且男性病死率高于女性。盡管COVID-19病死率低于SARS和MERS，但由于病例數(shù)眾多，其潛在影響更大。

診療方案第二版中提出針對輕型和普通型患者治療方案主要是盡早隔離，加強支持治療、及時給予有效氧療措施和抗病毒治療，中醫(yī)方面可根據(jù)癥候辨證論治，糖皮質激素可酌情短期使用。而針對重型、危重型的治療原則主要是在對癥治療的基礎上，積極防治并發(fā)癥，治療基礎疾病，預防繼發(fā)感染，及時進行器官功能支持。其中抗病毒治療藥物主要為α-干擾素或洛匹那韋/利托那韋(ritonavir/ lopinavir)(2020年1月23日武漢金銀潭醫(yī)院開啟這兩個藥物聯(lián)合治療的第1個藥物臨床試驗(ChiCTR2000029308))。診療方案第四版進一步規(guī)范糖皮質激素適用人群，同時提出針對重癥、危重癥病例，有條件可考慮恢復期血漿治療。診療方案第五版在抗病毒治療方案中加入利巴韋林(ribaviron，ChiCTR2000029387)，基于危重患者體內(nèi)高炎癥反應，可考慮使用體外血液凈化技術。4 d后的診療方案第五版(修正版)對利巴韋林的用法用量進行了修正。診療方案第六版在治療藥物中增加了磷酸氯喹(chloroquine phosphate，ChiCTR2000029609)和阿比多爾(arbidol，ChiCTR2000029621)，同時進一步明確了體外血液凈化技術包括血漿置換、吸附、灌流、血液/血漿濾過等。

COVID-19患者主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀，嚴重者可進展為呼吸窘迫，尸檢發(fā)現(xiàn)2019-nCoV主要引起深部氣道和肺泡損傷為特征的炎性反應[35]，因此診療方案一直不斷更新呼吸支持具體實施細則。診療方案第七版提出要保證患者充分通、換氣，對急性呼吸窘迫患者，若氧療或機械通氣效果不佳，應盡快考慮體外膜肺氧合(ECMO)。同時為阻斷細胞因子風暴，推薦使用IL-6受體抗體托珠單抗(tocilizumab，ChiCTR2000029765)。診療方案第七版還新增兒童重型病例標準，并且提出兒童重型、危重型病例可進行丙種球蛋白治療。此外，有研究指出COVID-19患者還可能合并心肌損害、凝血功能異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等，治療過程中同時需要監(jiān)測患者肝腎功能，盡早應用干預措施以防止疾病進展為器官衰竭[53-55]。

截至2020年3月3日，在中國臨床試驗注冊中心COVID-19臨床研究索引中已有 290個臨床試驗項目，包括治療性臨床試驗、診斷試驗、干預性研究、觀察研究、流行病學研究等。此外，瑞德西韋(remdesivir)的一項II期臨床試驗(NCT04280705)和兩項III期臨床試驗(NCT04252664和NCT04257656)已啟動。冠狀病毒S蛋白是研發(fā)抗病毒藥物的潛在靶點[56-57]，目前處于研究中的SARS特異性人單克隆抗體CR3022[58]、TMPRSS2抑制劑[22]、格瑞弗森(griffithsin)[59]、淋巴細胞抗原6復合體(LY6E)[60]均針對2019-nCoV的S蛋白。Pandolfi等[61]提出CRISPR / Cas13d系統(tǒng)可能是一種潛在的治療方法，其特異性強且可預防病毒耐藥性變異。

疫苗研發(fā)有滅活疫苗、mRNA疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和DNA疫苗等，目前多支疫苗已進入臨床試驗，其中國內(nèi)科興中維的滅活疫苗進入一期臨床試驗，康希諾生物的重組腺病毒疫苗、武漢生物的滅活疫苗進入二期臨床試驗。此外，美國Moderna公司的mRNA疫苗、Inovio公司的DNA疫苗也已進入臨床階段。

7 展 望

新冠疫情是對我國公衛(wèi)體系、醫(yī)療體系和突發(fā)公共衛(wèi)生事件動員能力的一次檢驗和大考，我國迅速開展流行病學調(diào)查、短時間內(nèi)分離鑒定病毒、開展病原學研究、建立檢測方法、完善診療方案、探索致病機制、研發(fā)藥物和疫苗，有效阻止了國內(nèi)疫情蔓延，也為世界疫情防控贏得了時間窗口。而我國肺炎防控方案也從早期“預防為主、防治結合、科學指導、及時救治”到“早發(fā)現(xiàn)、早報告、早診斷、早隔離、早治療”再到“分區(qū)分級精準防控”，根據(jù)疫情形勢變化及研究進展精準施策。我們記錄此次大事記和時間軸，就是為了總結經(jīng)驗補足短板，以進一步加強公共衛(wèi)生體系建設，健全突發(fā)疫情應對處置體系，加強科技儲備與緊急動員能力，加強生物安全立法與野生動物保護，為未來可能出現(xiàn)的重大傳染病疫情做好充分準備。