豬傳染性胃腸炎病毒HB-FP 株的分離鑒定 及其S 基因序列分析

袁廣富，肖 娜，劉立輝，陳少杰，王 晶，韓 磊，范京惠，左玉柱

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省定州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 定州 073000）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬成員豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。該病的主要臨床特征為嚴(yán)重腹瀉、脫水及迅速消瘦，2 周齡以下仔豬死亡率可達(dá)100%［1-5］。目前多篇研究報(bào)道了TGEV 常與豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、 豬 輪 狀 病 毒（Porcine rotavirus，PRV）、豬丁型冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）等病毒混合感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［6-7］。TGEV 是囊膜病毒，基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為28.5 kb，病毒主要編碼的結(jié)構(gòu)蛋白有纖突蛋白（S）、膜結(jié)合蛋白（M）、小膜蛋白（sM）、核衣殼蛋白（N）［8-11］。其中S 蛋白是高度糖基化蛋白，共有A、B、C、D 4 個(gè)抗原位點(diǎn)，在不同的分離株之間抗原有一定差異，其中A、B 和D 位點(diǎn)相對(duì)保守，S 基因的點(diǎn)突變或缺失對(duì)抗原位點(diǎn)的改變，可以造成病毒毒力的變化甚至?xí)颖芴禺愋钥贵w的捕捉［12］。S 蛋白不僅是介導(dǎo)病毒入侵機(jī)體、細(xì)胞融合、組織嗜性等方面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，還在刺激機(jī)體產(chǎn)生TGEV 中和性抗體并提供免疫保護(hù)方面起重要作用［13-16］，所以S 蛋白一直是TGEV 診斷鑒別、分子流行病學(xué)調(diào)查、基因工程疫苗、遺傳變異分析的重要蛋白，開展S 基因的研究對(duì)防控TGEV 具有重要意義。

目前，豬傳染性胃腸炎主要通過(guò)接種疫苗來(lái)進(jìn)行預(yù)防控制，但是近年來(lái)流行的毒株處在一個(gè)毒力和生物學(xué)特性不斷變異的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，傳統(tǒng)的弱毒苗已經(jīng)達(dá)不到有效抵抗自然流行毒株的效果，盡管在河北地區(qū)TGE 時(shí)有發(fā)生，但是相關(guān)的病原分離鑒定及流行毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)從河北地區(qū)采集的腹瀉仔豬糞便及小腸內(nèi)容物進(jìn)行了RT-PCR 檢測(cè)，利用PK-15 細(xì)胞成功分離到1 株豬傳染性胃腸炎病毒并對(duì)該病毒S 基因進(jìn)行序列分析，以了解河北省流行毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系及序列變異程度，為該地區(qū)TGEV 防控及候選疫苗毒株的篩選提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

病料采自河北某豬場(chǎng)臨床表現(xiàn)為腹瀉的仔豬糞便或小腸內(nèi)容物，由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃。

1.2 細(xì)胞與主要試劑

豬腎細(xì)胞（PK-15）由本實(shí)驗(yàn)室保存。兔抗TGEV 全病毒陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。pMD19-T 克 隆 載 體、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker 均 購(gòu) 自寶生物（大連）有限公司；Super GelRed?核酸凝膠染料購(gòu)自US Everbright?Inc（蘇州）；0.25% 胰酶、FITC- 羊抗兔IgG 購(gòu)自索萊寶公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO 公司；Trizol reagent 購(gòu)自 Invitrogen 公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)參照GenBank 中TGEV（ 登錄號(hào)DQ201447）基因序列，采用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)擴(kuò)增TGEV M 基因的檢測(cè)引物，設(shè)計(jì)3 對(duì)可覆蓋S 基因全長(zhǎng)的特異性引物，PEDV、PDCoV、PRV 檢測(cè)引物均由本實(shí)驗(yàn)室保存，引物序列見表1，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of all primers

1.4 臨床樣本中TGEV 的檢測(cè)

采用Trizol 法提取糞便或小腸內(nèi)容物中總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用TGEV 特異性檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，對(duì)符合預(yù)期的目的條帶（396 bp）進(jìn)行切膠回收。回收產(chǎn)物與pMD19-T 克隆載體連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性的樣品送去上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.5 病料的處理及TGEV 的分離培養(yǎng)

取臨床樣品中檢測(cè)鑒定為TGEV 陽(yáng)性，PEDV、PDCoV、PRV 為陰性的樣品，加入PBS 反復(fù)凍融3 次，4 000 r/min 離心10 min，分離的上清用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，收集濾液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩⑻幚砗玫牟×辖臃N于長(zhǎng)滿的單層PK-15細(xì)胞上，37 ℃吸附1 h，用DMEM 細(xì)胞維持液洗兩次，加入5 mL 維持液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行盲傳，每天觀察細(xì)胞病變情況，同時(shí)設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照。在第5 代時(shí)進(jìn)行RT-PCR 鑒定。

1.6 TCID50 的測(cè)定

將第10 代細(xì)胞毒進(jìn)行10-1～10-7的倍比稀釋，每個(gè)稀釋度做8 個(gè)重復(fù)，分別接種于PK-15 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置不加病毒的PK-15 細(xì)胞做陰性對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE 孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞毒的TCID50。

1.7 TGEV 分離株的間接免疫熒光鑒定（Indirect immunofluorescence assay，IFA）

將PK-15 細(xì)胞接種于24 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)，將分離的病毒接種于PK-15 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立未接毒的正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照。接毒24 h后棄去上清，用冰冷的4%多聚甲醛固定20 min；加入0.2% 的 TritonX-100 室溫通透10 min，加入5% BSA 室溫封閉2 h。以1∶100 稀釋的兔抗TGEV 全病毒血清為一抗、1∶100 稀釋的FITC-羊抗兔為二抗，進(jìn)行IFA 鑒定。

1.8 TGEV 分離株S 基因擴(kuò)增

以F10 代細(xì)胞培養(yǎng)物cDNA 為模板，通過(guò)上述引物對(duì)分離株S 片段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。切出目的片段凝膠，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，將回收產(chǎn)物與pMD19-T 連接并轉(zhuǎn)化，菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性克隆的樣品，送到上海生工有限公司測(cè)序。

1.9 S 基因序列與氨基酸變異情況分析

根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，利用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar 5.0，將S1 ～S3 片段拼接成完整的S 基因，將所獲得的S 基因序列提交到NCBI 進(jìn)行比對(duì)分析，選出有代表性的TGEV 參考毒株S 基因的全基因序列（表2），運(yùn)用DNAStar、MEGA 等軟件進(jìn)行分析比較，構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析HB-FP 株的序列同源性及氨基酸變異情況。

表2 TGEV 參考毒株及其序列信息Table 2 Rerference strains of TGEV and their sequence information

續(xù)表：

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離與培養(yǎng)

將RT-PCR 鑒 定 為TGEV 陽(yáng) 性，PEDV、PDCoV、PRV 為陰性的病料（圖1）處理后接種于PK-15 細(xì)胞，在PK-15 細(xì)胞上盲傳4 代后出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（CPE），主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓、細(xì)胞透光性增強(qiáng)、細(xì)胞界限不清晰、大片細(xì)胞脫落并出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象，隨著代次的增加，細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時(shí)間逐漸縮短，并從第10 代開始CPE 出現(xiàn)的時(shí)間及形態(tài)逐漸穩(wěn)定（圖 2）。對(duì)F5 代細(xì)胞毒培養(yǎng)物上清提取RNA，RT-PCR 擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，可擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的片段。

圖 1 病料PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of feces

圖 2 PK-15 細(xì)胞感染第10 代細(xì)胞毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變（100×）Fig. 2 CPE on PK-15 cells incubated with HB-FP (10th passages)（100×）

2.2 TCID50 的測(cè)定

將TGEV 分離株連續(xù)傳代，并將第10 代毒接種于PK-15 細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE 孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算得到第10 代毒TCID50為10-5.5/0.1 mL。

2.3 TGEV 分離株的間接免疫熒光鑒定

將分離的TGEV 毒株接種于PK-15 細(xì)胞，利用IFA 方法對(duì)病毒感染的PK-15 細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，未接毒的正常PK-15 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，TGEV 分離株感染細(xì)胞后可以與TGEV兔源全病毒血清發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)特異性免疫熒光，而對(duì)照組則沒(méi)有出現(xiàn)熒光（見圖 3）。

圖3 HB-FP 株感染PK-15 細(xì)胞的間接免疫熒光鑒定Fig. 3 Identification of the isolate HB-FP in PK-15 cell by IFA

2.4 TGEV 分離株S 基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定

對(duì)分離的TGEV HB-FP 株S1、S2、S3 基因片段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)與預(yù)期片段大小相符的條帶。對(duì)目的片段膠回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，菌液PCR 鑒定正確的重組菌進(jìn)行測(cè)序，S 蛋白測(cè)序結(jié)果已上傳至NCBI GenBank 中，登錄號(hào)MN548093。

2.5 TGEV HB-FP 株S 基因序列與氨基酸變異情況分析

利 用DNAStar 中 的MegAlign 軟 件， 參 考GenBank 中已經(jīng)公布的具有代表性的國(guó)內(nèi)外TGEV毒株與本試驗(yàn)分離到的HB-FP 株S 基因序列進(jìn)行比較分析。分離株S 基因與參考株S 基因核苷酸和氨基酸的同源性對(duì)比分析結(jié)果顯示，與參考毒株核苷酸同源達(dá)到94.9% ～98.8%，氨基酸同源性達(dá)到65%～98%，且與我國(guó)分離的TGEV JS2012（KT696544)）株核苷酸同源性最高為98.8%，氨基酸同源性為98%，再次印證本次試驗(yàn)分離的毒株為TGEV。HB-FP 分離株S 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，整個(gè)進(jìn)化樹分為2 個(gè)分支，英國(guó)的分離株TGEV（AF104420）單獨(dú)在1 個(gè)分支，剩下的25 株分離毒株在另外1 個(gè)分支，包括本次分離的HB-FP 株，其中中國(guó)的TGEV JS2012（KT696544)）株、美國(guó)的TOY56-165（M94103）株、韓國(guó)的TGEV（AF298211）株與分離株HB-FP 親緣關(guān)系最近（見圖4）。

使用MegAlign 對(duì)拼接完整的S 基因進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)HB-FP 株與核苷酸同源性最高的TGEV JS2012 株存在22 處氨基酸點(diǎn)突變。分離株與常用的疫苗株存在21 處氨基酸點(diǎn)突變，其中有7處點(diǎn)突變?cè)赟 蛋白的抗原表位區(qū)，分別是C 抗原位點(diǎn)區(qū)域發(fā)生的1 處氨基酸位點(diǎn)突變48（P →S），B抗原位點(diǎn)區(qū)域發(fā)生的2 處氨基酸位點(diǎn)突變分別是97（W →S）、100（R →K），D 抗原位點(diǎn)區(qū)域發(fā)生的2 處氨基酸位點(diǎn)突變分別是378（V →A）、389（I →M），A 抗原位點(diǎn)發(fā)生2 處氨基酸位點(diǎn)突變分別為第542（S →N）、562（N →H）的突變。

圖4 HB-FP 分離株S 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 4 Phylogenetic trees of TGEV HB-FP strain based on the S gene

3 結(jié)論與討論

TGE 最早于1946 年在美國(guó)首次被報(bào)道，隨后世界上多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生和流行，近年來(lái)已經(jīng)成為我國(guó)引起豬群腹瀉的重要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1,2,17,18］。雖然疫苗在TGE 的防控中發(fā)揮了重要作用，但是越來(lái)越多的豬場(chǎng)在使用TGEV疫苗后TGE 仍然會(huì)發(fā)生和流行，這與新的流行野毒株不斷出現(xiàn)，毒株不斷發(fā)生抗原性變異密切相關(guān)。

本試驗(yàn)取河北省某豬場(chǎng)仔豬糞便及小腸內(nèi)容物進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，利用PK-15 細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，盲傳4 代后出現(xiàn)細(xì)胞病變，而且隨著傳代次數(shù)的增加出現(xiàn)細(xì)胞病變的時(shí)間以及形態(tài)逐漸穩(wěn)定，通過(guò)RTPCR、間接免疫熒光鑒定、基因序列測(cè)定，證實(shí)分離到的病毒為TGEV，并命名為HB-FP 株。通過(guò)引物設(shè)計(jì)成功擴(kuò)增出S 基因片段，得到與預(yù)期片段大小一致的S 基因組片段（4 350 bp），共編碼1 450 個(gè)氨基酸。為了解河北省流行毒株的遺傳變異情況，本試驗(yàn)將擴(kuò)增出的HB-FP 株S 基因序列與國(guó)內(nèi)外流行參考毒株序列進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，同源性比對(duì)結(jié)果顯示，雖然TGEV S 基因一直是處在一個(gè)不斷遺傳演化過(guò)程中，但是沒(méi)有出現(xiàn)大片段缺失或者是插入的情況。遺傳進(jìn)化關(guān)系表明HB-FP 株與除英國(guó)外的參考毒株都在同一分支上，其中與中國(guó)的TGEV JS2012 株親緣關(guān)系最近。氨基酸變異情況分析表明，雖然HB-FP 株與我國(guó)分離的TGV JS2012株同源性最高，但是其核苷酸的點(diǎn)突變導(dǎo)致22 處氨基酸的突變，這些突變對(duì) S 蛋白的免疫原性以及病毒致病力是否產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步的研究。分離株與常用的疫苗株相比存在21 處的氨基酸點(diǎn)突變，其中有7 處點(diǎn)突變發(fā)生在S 蛋白的抗原表位區(qū)，相關(guān)研究表明TGEV S 蛋白的抗原位點(diǎn)中氨基酸的突變會(huì)影響病毒受體結(jié)合或中和抗體相互作用，從而影響病毒的抗原性，本研究中A、B、C、D 位點(diǎn)都產(chǎn)生了氨基酸突變，勢(shì)必會(huì)影響S 蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要能力，進(jìn)一步影響到現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效果，也印證了在遺傳進(jìn)化關(guān)系中看到的分離株與常用的疫苗毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這提示若還是應(yīng)用經(jīng)典毒株制成疫苗將不可能為豬群傳染性胃腸炎變異株感染提供較好的保護(hù)效果，這也將是導(dǎo)致豬群免疫失敗的原因之一。如果這些變異的野毒株不能夠引起大家足夠的重視，這將對(duì)現(xiàn)有的豬群防控措施制定以及養(yǎng)豬業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展都會(huì)帶來(lái)不同程度的負(fù)面影響。

本試驗(yàn)成功分離鑒定了1 株河北省豬傳染性胃腸炎病毒并對(duì)該病毒S 基因進(jìn)行序列分析，為了解河北省TGEV 流行毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供了有力依據(jù)，為河北地區(qū)TGEV 流行變異株疫苗的制備以及深入研究TGEV 流行變異株的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。