定點突變對低溫脂肪酶活性和熱穩(wěn)定性的影響

陳海清，于 凡，王紅靜，張先舟，亢春雨，馬 雯，檀建新

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院 / 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北 保定 071000)

近年來，通過定點突變的理性設(shè)計來達到改造酶分子的目的，已被人們廣泛采用且證明是可行的［11］。張曉鳳等人利用理性設(shè)計的方法提高了來源于土曲霉（Aspergillus terreus）的脂肪酶的催化活力，突變體ATL-Lid 和ATL-V218W 的酶活性分別比野生型提高了2.26 倍和3.38 倍［12］。郭靜等［13］使用在線預(yù)測軟件PoPMuSiC-2.1 預(yù)測了源自Streptomyces kathirae SC-1 的酪氨酸酶的自由能變化，進行單點突變，證明點突變Arg95Tyr 和Gly123Trp 在60 ℃下的半衰期分別比野生型提高了1.35 和1.82 倍［14］。Mohammadi 等［15］報道采用定點突變技術(shù)，獲得了粘質(zhì)沙雷氏菌的脂肪酶的突變體G2P 和G59P，突變后脂肪酶酶蛋白的t1/2分別比野生型高2.3 倍和2.9 倍，但最適溫度和最適pH 并沒有改變。實踐證明，蛋白質(zhì)分子內(nèi)作用力的種類和數(shù)量的改變對酶分子的催化活性和穩(wěn)定性會有重要影響［16-17］。因此，通過點突變可改變酶分子局部區(qū)域氨基酸殘基之間、酶與環(huán)境之間的相互作用，或可提高酶的活性或穩(wěn)定性。

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）菌株L1是本實驗室前期從土壤樣品中篩選獲得的脂肪酶高產(chǎn)菌株，該菌株所產(chǎn)胞外脂肪酶（lipase A，lipA）活性可達3.6 U/mL，經(jīng)克隆測序后證明脂肪酶基因由1 845 堿基組成，編碼614 氨基酸，其三維模型結(jié)構(gòu)與SML 2QUB.pdb 具有高度相似性，活性位點由氨基酸殘基Ser207、Asp256 和His314 組成［18］，該酶屬于I.3 脂肪酶家族。本試驗擬采用定點突變技術(shù)進一步提高粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的酶活力或熱穩(wěn)定性，為該酶的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

克隆宿主菌E. coli DH5α、表達宿主E. coli Rosetta（DE3）購于博邁德，脂肪酶生產(chǎn)菌粘質(zhì)沙雷菌菌株L1 由本實驗室保存。

T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I 和Hind III 購于寶生物工程（大連）有限公司。2×Easy Taq DNA supermix、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA marker 購于天根生化科技（北京）有限公司。蛋白Marker 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。氨芐青霉素、IPTG 和鎳-瓊脂糖凝膠為北京索萊寶公司產(chǎn)品。對硝基苯棕櫚酸酯（pNPP）購自阿拉丁試劑有限公司。其他試劑均購買自本地經(jīng)銷商。本研究所用PCR 引物由金唯智生物科技有限公司合成，見表1。

表1 重疊延伸PCR 擴增引物Table 1 Primers for overlap extension PCR amplification

1.2 主要儀器

PCR 儀：德 國Biometra 公 司；GL-20G- Ⅱ冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-10C 型電泳儀：北京市六一儀器廠；BL-300-X 電子天平：廈門佰倫斯電子科技有限公司；雙層恒溫振蕩器ZHWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司；恒溫金屬?。荷虾Ｒ缓憧萍加邢薰荆籎Y04S-3E 凝膠成像分析系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 同源建模和突變氨基酸選擇

將菌株L1 脂肪酶蛋白序列提交至SWISSMODEL 進行同源建模，同源搜索比對表明，脂肪酶lipA 與脂肪酶SML（PDB 登錄號：2QUB）同源性最高（97%），并以2QUB 為模版進行同源建模。之后將菌株L1 脂肪酶3D 結(jié)構(gòu)提交至PoPMuSiC 在線服務(wù)器，預(yù)測脂肪酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG），Asn 突變?yōu)镚lu 或Lys 后，去折疊自由能為負值并且變化顯著，故選Asn86 和Asn132 氨基酸殘基作為突變位點。

1.4 定點突變及構(gòu)建重組表達菌株

構(gòu)建過程采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的重疊引物法進行構(gòu)建。以pET-22b(+)-lipase 質(zhì)粒為模板，用Asn86Glu FP（或Asn132Lys FP）/ Lipase HindIII RP 引物對，Lipase BamHI FP /Asn86Glu RP（Asn132Lys RP）引物對進行第一步PCR 反應(yīng)，分別擴增出脂肪酶突變點前后2 個片段，PCR 反 應(yīng)體系為10 μL，包括模板pET-22b(+)-lipase 質(zhì)粒1 μL，上、下游引物各1 μL，pfu mix 5 μL，ddH2O 2 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min 30 s，25 個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。將上述PCR 產(chǎn)物電泳并膠回收后得到突變點上、下游片段，以此為引物和模板（各2.5 μL），pfumix 5.0 μL，進行第二步PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，14個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。隨后，以此步得到的PCR 產(chǎn)物做模版（4 μL），Lipase BamHI FP /HindIII RP 為上下游引物（各1 μL），pfumix 8 μL，ddH2O 6 μL，總體積20 μL，進行第三步PCR 反應(yīng)，程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min 30 s，25 個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。第三步PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamH I/Hind III 雙酶切后與pET22b連接構(gòu)建表達載體pET22b-Asn86Glu（或pET22b-Asn132Lys），轉(zhuǎn)到E. coli DH5α 中，在抗性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子并送至深圳華大基因股份有限公司測序，將測序正確的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)到E. coli Rosetta（DE3）中，挑選陽性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達。

1.5 脂肪酶基因lipA 在E. coli Rosetta（DE3）中表達和lipA 酶蛋白純化

將重組的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ～0.8 時，添加IPTG 至其終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h，10 000 r/min 離心10 min 收集菌體。超聲波破碎后10 000 r/min 離心20 min 后，得到的上清液即為蛋白粗酶液。將粗酶液加入到鎳柱中混勻后靜置10 min，4 ℃下用咪唑濃度為20 和200 mmol/L 的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10% 甘油，pH 8.0）洗脫帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白質(zhì)，將200 mmol/L 咪唑濃度沖洗下來的蛋白經(jīng)透析12 h 后進行濃縮，得到的即為純化后濃縮的脂肪酶蛋白。

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1.6 脂肪酶的酶活性和蛋白質(zhì)含量測定

參照文獻［12］采用對硝基苯酚棕櫚酸酯法（pNPP）測定酶活。酶活定義：每分鐘催化生成 1 μmol/L 產(chǎn)物p-NP 的酶量定義為一個酶活單位（U）。p-NP 的測量在410 nm 的吸光度下進行。脂肪酶的蛋白含量測定根據(jù)BCA 試劑盒來測定純化后脂肪酶的蛋白濃度。

1.7 突變脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.7.1 最適溫度測定 根據(jù)酶活測定方法，將突變酶分別置于10、20、30、35、40、50 和60 ℃的溫度下反應(yīng)15 min 后測酶的活性。把酶活力最大值所對應(yīng)的溫度作為酶的最適溫度，并且設(shè)定為100%，然后計算其余溫度條件下的相對酶活力，即得到脂肪酶在不同溫度下的活力變化。

1.7.2 最適pH 測定 在最適溫度下，將脂肪酶置于不同的緩沖液體系中：檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 2.0 ～7.0）、Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0 ～9.0）、甘氨酸-NaOH 緩沖液（pH 10.0 ～11.0），測定酶活。酶活最高的pH 為最適pH，并將其設(shè)定為100%，計算其他pH 條件下的相對酶活力。

1.7.3 半衰期t1/2將脂肪酶分別置于50℃水浴中處理15、30、45 和60 min，然后置于冰浴10 min后在最適反應(yīng)條件下測殘余酶活。

酶的失活方程為：ln(Et/E0)=-kt，其中E0：孵育0 時刻的相對酶活，Et：t 時刻的相對酶活；半衰期t1/2計算公式為：t1/2=ln2/k

1.7.4 脂肪酶動力學(xué)研究 在最適反應(yīng)條件下，以對pNPP 為底物，測定其不同濃度（0.25 ～2.0 μmol/L）下脂肪酶活性，根據(jù)米氏方程，使用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法，計算出不同突變脂肪酶動力學(xué)常數(shù)。

1.7.5 突變脂肪酶三級結(jié)構(gòu)模擬 酶分子的折疊自由能變化值ΔΔG 用在線軟件PoPMuSiC-2.1（http://dezyme.com）計算。將脂肪酶突變后的蛋白序列提交至SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）［19］網(wǎng)站，以PDB 數(shù)據(jù)（2QUB）的晶體結(jié)構(gòu)為模板進行同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶突變位點的選擇和構(gòu)建

將S. marcescens 脂肪酶lipA 解析的晶體結(jié)構(gòu)提交至PoPMuSiC 在線服務(wù)器預(yù)測計算脂肪酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化(ΔΔG)。一般認(rèn)為，ΔΔGmut 值是負值，表明突變后能量下降，酶穩(wěn)定性提高，反之突變后能量上升，酶穩(wěn)定性較 差［20］，根據(jù)突變后每個突變點ΔΔG 的變化，選擇 Asn86Glu（ΔΔG：-0.19 kcal/mol）、Asn132Lys（ΔΔG：-0.1 kcal/mol）作為突變位點。

如圖1 所示，用PCR 方法先將lipA 基因突變點兩側(cè)的長、短片段分別擴增出來，使lipA 基因序列中編碼Asn86 的密碼子AAT 突變?yōu)榫幋aGlu 的密碼子GAA；編碼Asn132 的密碼子AAT 突變?yōu)榫幋aLys 的密碼子AAG，再通過融合PCR 擴增獲得突變后的全長lipA 基因，插入pET22b 表達載體中，構(gòu)建了表達載體pET22b-Asn86Glu 和pET22b-Asn132Lys。用限制性內(nèi)切酶BamH I 和Hind III 雙酶切驗證表明2 個突變體構(gòu)建成功。

圖1 Asn86Glu 和Asn132Lys 突變體的構(gòu)建Fig.1 Construction of lipA Asn86Glu and Asn132Lys mutations

2.2 重組脂肪酶的表達和純化

將野生型和2 個突變體的表達載體分別轉(zhuǎn)化到E. coli Rosetta(DE3) 中獲得陽性轉(zhuǎn)化子，用IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白16 h 后，離心收集菌體并超聲破碎，離心所得上清液含有可溶的脂肪酶蛋白（圖2，泳道1 ～3），說明lipA 的野生型和突變體都得到了高效表達。使用Ni-NTA 分離純化lipA，用咪唑濃度為200 mmol/L 的緩沖液洗脫目的蛋白，SDSPAGE 電泳結(jié)果（圖2，泳道4 ～6）顯示，純化后的酶蛋白呈現(xiàn)單一條帶，大小為65 kD，與野生型一致，表明lipA 脂肪酶的野生型和突變體均得到了完整高效的表達。

圖2 脂肪酶lipA 粗提液及純化后酶蛋白SDS-PAGE 分析Fig.2 MSDS-PAGE analysis of crude enzyme extracts and purified lipA

2.3 重組脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組脂肪酶的酶活力 用純化后的脂肪酶及其突變體測定了脂肪酶的活性，結(jié)果如圖3 所示，測得野生型脂肪酶的比酶活為171.62 U/mg，lipAAsn86Glu 的比酶活為185.35 U/mg，lipA-Asn132Lys的比酶活為138.97 U/mg。lipA-Asn86Glu 的相對酶活比野生型提高了8%，lipA-Asn132Lys 的相對酶活較野生型下降了19%。表明點突變Asn86Glu 提高了酶的活性，而Asn132Lys 卻降低了酶活性。

圖3 野生型及突變體脂肪酶的酶活力Fig.3 The activity of the wild type and mutant lipases

2.3.2 重組脂肪酶的最適溫度和最適pH 分別測定重組脂肪酶及突變體的最適溫度，結(jié)果見圖4。野生型脂肪酶的最適溫度為30 ℃，2 個脂肪酶突變體Asn86Glu、Asn132Lys 的最適溫度沒有發(fā)生變化，均為30 ℃。10 ～30 ℃之間隨溫度提高，3 種酶的活力都在上升，野生型和Asn86Glu 都保持了較高的活力，10 ℃和20 ℃下分別為最適溫度酶活力的50%和80%以上，而突變體Asn132Lys 的脂肪酶活性則有明顯降低。35 ℃時，野生型和Asn86Glu 的活力略有下降，之后隨著溫度提高酶活力都大幅度降低，突變體Asn86Glu 較野生型的酶活力下降更為顯著，表明Asn86Glu 突變可能導(dǎo)致lipA 在高溫下容易發(fā)生構(gòu)象變化，最終導(dǎo)致酶活力的喪失。對于突變體Asn132Lys 來說，盡管最適溫度沒有發(fā)生變化，但是所有被測溫度下，其活性較野生型都有明顯降低，表明該突變并未像預(yù)期的結(jié)果一樣可以提高酶的穩(wěn)定性，相反卻降低了酶的穩(wěn)定性。

圖4 野生型脂肪酶及突變體的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of the wild type and mutant lipases

如圖5 所示，不同pH 下野生型和2 種突變體lipA 的活性呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，pH 8 時酶活性最高，為最適pH；pH 2 ～8 之間，隨著pH 的增加酶活性也增加，pH 8 ～11 之間酶活性隨pH 增加而顯著下降，pH 5 ～9 之間可以表現(xiàn)出相對較高的活性。這結(jié)果證明Asn86Glu、Asn132Lys 這2 個突變體對脂肪酶活性的最適pH 沒有影響，也沒有影響其在高于或低于最適pH 前后酶活性的變化趨勢。

圖5 野生型脂肪酶及突變體的最適pHFig.5 Optimal pH of the wild type and mutant lipases

2.3.3 脂肪酶的t1/250和動力學(xué)常數(shù) 將野生型和2種突變體脂肪酶在50 ℃下保溫不同時間，檢測半衰期，結(jié)果顯示：與野生型相比，突變體Asn86Glu的半衰期與野生型幾乎一致，而Asn132Lys 的半衰期則降低了51%（表2），說明前者突變并未造成熱穩(wěn)定性的劇烈變化，后者則正好相反，這一結(jié)果與最適溫度測定中的結(jié)果一致。以0.5 ～2 mmol/L不同濃度的p-NPP 為底物測定脂肪酶及其突變體的動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見表2。相對于野生型脂肪酶，2個突變體的Km 值、Kcat 值都明顯降低，說明底物與酶的親和力變大了，但是最優(yōu)條件下的催化效率卻下降了。Asn86Glu 突變體的Kcat/Km 顯著增加，Asn132Lys 的Kcat/Km 則顯著減少，表明前者催化效率提高了，而后者則降低了，這是因2個突變對為Km 和Kcat 值有不同影響導(dǎo)致的。

表2 野生型脂肪酶及其突變體在50 ℃下的半衰期及動力學(xué)參數(shù)Table 2 Half-lives (50 ℃) and kinetic parameters of the wild type lipase and its mutants

2.3.4 突變脂肪酶的結(jié)構(gòu)模擬與突變位點分析 為了探討脂肪酶點突變對酶活性和熱穩(wěn)定性變化的影響，首先將野生型脂肪酶進行同源建模，根據(jù)突變點所在位置和氫鍵成鍵情況來分析突變之后酶活力或熱穩(wěn)定性改變的原因。如圖6 所示，同源建模后發(fā)現(xiàn)野生型與突變體的三維結(jié)構(gòu)沒有明顯的變化，而突變點處氨基酸殘基改變后的成鍵情況則與突變前有所不同。如圖6A 中的三級結(jié)構(gòu)所示，位點Asn86 處在α 螺旋的末端，圖7A、7B 表示Asn86 突變?yōu)镚lu 后在該氨基酸殘基及其周圍氨基酸殘基所在同一平面中的位置變化和氫鍵變化，可知突變后的氫鍵數(shù)量沒變，但是所占空間結(jié)構(gòu)變小，這一特點可能導(dǎo)致酶在與底物結(jié)合時更加有利，進而有利于突變后酶活提高，同時結(jié)構(gòu)的變化也可能導(dǎo)致了酶的熱穩(wěn)定性變差。從圖6B中的三級結(jié)構(gòu)可知，位點Asn132 處在連接2 個β 疊片的拐角處，圖7C 和7D 中所展示了Asn132 突變前后在空間結(jié)構(gòu)中的二維截面上該氨基酸殘基與周圍氨基酸之間的位置變化和氫鍵變化，發(fā)現(xiàn)突變后氫鍵個數(shù)由原先的3 個變?yōu)? 個，這可能導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使酶的活性和熱穩(wěn)定性均降低。

圖 6 突變氨基酸在野生型脂肪酶3D 模型中的位置Fig.6 Location of the mutant residues in the 3D model of wild-type lipase

圖7 氨基酸殘基Asn86 和Asn132 突變前后在二維平面中的位置Fig.7 The location of residues Asn86 and Asn132 before and after the mutation on the 2D map

3 結(jié)論與討論

利用在線預(yù)測軟件 PoPMuSiC 計算酶蛋白序列中氨基酸替換點的去折疊自由能變化（ΔΔG）來輔助設(shè)計酶蛋白的定點突變，以預(yù)測氨基酸點突變后對酶的穩(wěn)定性的變化，是點突變理性設(shè)計的一種常用方法。童理明等利用PoPMuSiC-2.1 在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶上預(yù)測了2 個突變點P132I 和P132G，比酶活亦分別較野生酶提高了24%和12.4%［21］。由本試驗對野生型和突變體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析可知，突變前后脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)及其酶活性中心基本沒有發(fā)生改變。通過Asn 替換成Glu 以及Asn 替換成Lys 的方法得到2 個突變體，Asn86Glu 的酶活性較野生型提高了8%，而Asn132Lys 較野生型卻下降了19%。lipA 及其突變體酶學(xué)特征的結(jié)果證明，突變體最適溫度和最適pH 都和野生型一樣，沒有明顯的變化。動力學(xué)分析結(jié)果表明，突變酶的Km 值比野生型的要小，說明突變酶對底物的親和力有所提高。最后利用SWISS-MODEL 在線服務(wù)器將S. marcescens L1 脂肪酶野生型和突變后的蛋白序列輸入并對其進行同源模擬，發(fā)現(xiàn)突變點Asn86Glu 和Asn132Lys 分別通過構(gòu)象改變和氫鍵減少導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性降低，但是Asn86 的酶活力高于野生型，熱穩(wěn)定性在低溫下相差不大。這一結(jié)果暗示了，試圖通過理性設(shè)計提高酶的熱穩(wěn)定性時，可選擇突變后建模模擬氫鍵增加的氨基酸位點。

通過在線預(yù)測軟件PoPMuSiC 預(yù)測并成功構(gòu)建了脂肪酶lipA 的2 個突變體，對野生型和突變體表達體系構(gòu)建、重組脂肪酶lipA 的表達、純化和酶學(xué)特性的表征，證明突變體lipA-Asn86Glu 可以提高酶活力和催化效率，高溫下穩(wěn)定性略有降低，說明理性設(shè)計的定點突變對酶的活力和熱穩(wěn)定性有一定的影響，為脂肪酶的分子改造提供了實驗依據(jù)和途徑。