LASP1在膠質母細胞瘤組織中的表達及其對腫瘤耐藥和患者預后的影響

郭張超 陶蓓 夏祥國 陳禮剛 鐘傳洪

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川省神經(jīng)外科臨床醫(yī)學研究中心，四川省院士（專家）工作站（四川瀘州646000）；2西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科（四川瀘州646000）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，約占膠質瘤的50%，具有致死率高、易復發(fā)、預后差等特點[1]，即使經(jīng)標準化治療，中位生存時間仍僅14個月左右[2]。腫瘤細胞的快速增殖及對目前治療的高抗藥性是其預后不良的主要原因[3]。因此，尋找影響細胞增殖和耐藥關鍵分子，對開發(fā)新的治療靶點及預后評估具有重要意義。LASP1蛋白（LIM and SH3 protein1）是一種肌動蛋白結合蛋白，近年來發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中上調[4-7]，與腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移和化學抵抗等密切相關[8-10]。筆者前期基礎研究發(fā)現(xiàn)LASP1 可能作為GBM的促癌因子，通過PI3K/AKT 依賴性機制參與調節(jié)腫瘤的增殖及替莫唑胺耐藥[11]。然而，LASP1 對GBM 臨床治療及預后的影響國內外還少有報道。本研究通過免疫組化檢測LASP1在140例GBM患者組織中的表達，探討LASP1在GBM 中的表達及其與患者臨床治療和預后的關系，為GBM 尋找新的治療靶點提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究標本來源于2012年1月10日至2018年6月30日，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行手術切除并經(jīng)病理證實的GBM 腫瘤組織。所有患者術前均未經(jīng)放療、化療以及任何其他免疫性治療，手術均由相同兩位高年資外科醫(yī)生合作完成，且排除患有嚴重基礎疾病、腫瘤無法切除和發(fā)生嚴重并發(fā)癥者。此外，患者的臨床及隨訪資料相對完整。共收集病例140例，其中男83例，女57例，年齡21～80歲，平均（54.74±12.56）歲，中位年齡54歲；P53 突變檢測結果明確者135例。對照組15例標本均取自顱腦外傷需行顱內減壓術手術過程中。所有留取組織離體后，立即由病理科高年資醫(yī)師統(tǒng)一固定、石蠟包埋，于4℃恒溫、干燥、避光保存[12-13]。本研究通過西南醫(yī)科大學倫理委員會批準（倫理編號：K2018010），研究對象術前均簽署知情同意。全部140例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和門診隨訪，末次隨訪時間為2019年5月6日，隨訪時間3～50個月，中位隨訪時間11個月。至隨訪截止日，存活病例19例，死亡119例，失訪2例。

1.2 主要試劑及方法兔抗人LASP1多克隆抗體（美國Abcam公司）；EnVision 免疫組化檢測試劑盒（DAKO公司），使用免疫組化Envision 二步法檢測LASP1的表達水平。取石蠟標本切片，厚度約4 μm，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0）高壓修復3 min，自然冷卻至室溫。3.0%甲醇雙氧水孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS 緩沖液沖洗3次，每次3 min。加入一抗兔抗人LASP1多克隆抗體（稀釋比例1∶500），27℃孵育60 min，PBS 沖洗3次，每次3 min。加入二抗，27℃孵育30 min，PBS 沖洗3次，每次3 min。室溫下DAB 顯色，鏡下控制顯色，蘇木精復染，稀鹽酸分化，飽和碳酸鋰反蘭，脫水、透明、固定后，顯微鏡觀察，以PBS 代替一抗作為陰性對照組。

1.3 結果判斷結果由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行雙盲閱片，在高倍視野下，每例隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞。根據(jù)染色陽性細胞所占百分比和染色強度累積積分乘積判斷結果：（1）按著色強度評分：0分為無染色，1分為弱染色淺黃色，2分為中度染色黃褐色，3分為重度染色棕黃色。（2）按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分：陽性細胞數(shù)0%～5%為陰性0分，陽性細胞數(shù)＞5%～25%為1分，陽性細胞數(shù)＞25%～50%為2分，陽性細胞數(shù)＞50%～75%為3分，陽性細胞數(shù)＞75%為4 分。染色指數(shù)的計算方法如下：染色指數(shù)評分=染色強度評分×染色陽性腫瘤細胞比例評分。染色指數(shù)評分≤2分為陰性，＞2分為陽性[14]，統(tǒng)計分析時0～7分為低表達，8～12分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)采用（）表示，LASP1與各臨床病理參數(shù)之間的關系使用χ2檢驗，Kaplan-Meier 法分析LASP1的表達與生存時間及無復發(fā)生存時間關系，應用單因素及Cox 比例風險模型分析影響膠質瘤預后的因素。所有統(tǒng)計結果均以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LASP1在膠質母細胞組織及對照組織中的表達LASP1在膠質母細胞瘤組織中的蛋白陽性表達率為88.6%（124/140），正常腦組織中的陽性表達率為13.3%（2/15），GBM 中LASP1的表達高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 54.370，P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 LASP1在膠質母細胞瘤組織及正常腦組織中的表達Tab.1 Expression of LASP1 in glioblastomas and normal brain tissues例（%）

圖1 LASP1在膠質母細胞組織及正常腦組織中的表達Fig.1 Expression of LASP1 in glioblastomas and normal brain tissues

2.2 膠質母細胞瘤中LASP1的表達與臨床病理特征的關系χ2檢驗分析LASP1的表達與患者各臨床病理特征的關系，結果顯示：性別、年齡、術前KPS評分、腫瘤部位、P53 突變與LASP1的表達無相關性（均P＞0.05），而Ki67的表達、腫瘤大小、囊性改變與LASP1的表達具有相關性（均P＜0.05，表2）。

表2 膠質母細胞瘤中LASP1的表達與臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between the expression of LASP1 and clinicopathological features in glioblastoma

2.3 膠質母細胞瘤中LASP1的表達與患者復發(fā)、生存時間和替莫唑胺療效的關系采用Kaplan-Meier 法分析LASP1的表達與患者無復發(fā)生存時間、總體生存時間及替莫唑胺療效的關系。結果顯示LASP1 高表達患者的無復中位生存時間為（7.00±0.43）個月，較低表達者（13.00±0.90）個月明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=44.90，P＜0.01），高表達患者的中位生存時間為（11.00±0.55）個月，較低表達患者（18.00±1.69）個月明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=48.65，P＜0.01），見圖2。同時結果顯示替莫唑胺化療可顯著延長低表達患者的中位生存時間[（23.00±2.48）vs.（14.00±1.74）個月，χ2=11.844，P＜0.01]、無復發(fā)中位生存時間[（17.00±1.39）vs.（11.00±0.80）個月，χ2=10.372，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計學意義；而對高表達患者的中位生存時間[（11.00±0.82）vs.（9.00±1.10）個月，χ2=1.942，P=0.163]、無復發(fā)中位生存時間[（8.00±0.79）vs.（6.00±0.36）個月，χ2=2.821，P= 0.093]均無明顯改善，差異無統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖2 膠質母細胞瘤中LASP1表達與患者無復發(fā)生存時間和總體生存時間的關系Fig.2 The relationship between the expression of LASP1 and recurrence free survival time and overall survival time in glioblastoma

圖3 膠質母細胞瘤中LASP1的表達與替莫唑胺療效的關系Fig.3 Relationship between LASP1 expression and efficacy of temozolomide in glioblastoma

2.4 單因素及多因素分析影響膠質母細胞瘤預后的因素采用單因素分析及多因素Cox 回歸分析結果顯示，LASP1的表達及替莫唑胺化療，是影響膠質母細胞瘤預后的獨立因素（均P＜0.01），見表3。

表3 單因素及COX多因素分析影響膠質母細胞瘤預后的獨立因素Tab.3 Univariate and multivariate analysis were used to analyze independent prognosis factors of glioblastoma

3 討論

LASP1 作為一種廣泛表達的肌動蛋白結合蛋白，隨著其結構、調控、功能和表達模式等方面的研究進展，近二十年來LASP1 已經(jīng)從一種簡單的肌動蛋白結合結構蛋白，發(fā)展為腫瘤生物標志物[15-16]。越來越多研究表明，LASP1的表達與腫瘤的臨床及預后密切相關，是一種有價值的潛在治療靶點[17-18]。

本研究在前期研究的基礎上，采用免疫組化檢測了LASP1在GBM 瘤標本中的表達情況，發(fā)現(xiàn)LASP1在GBM組織中的表達明顯高于正常腦組織，提示LASP1與GBM的發(fā)生、發(fā)展相關。Ki67是細胞增殖核抗原，在增殖細胞中表達上升[19]，腫瘤大和發(fā)生囊性改變多見于腫瘤的快速增殖；在對患者的病例特征分析中發(fā)現(xiàn)LASP1表達與Ki67的表達、腫瘤大和發(fā)生囊性改變正相關，提示在臨床上LASP1 過表達可能促進了GBM 細胞的增殖，與筆者前期研究[11]及LIU 等[20]在膠質瘤中的發(fā)現(xiàn)一致。在進一步分析LASP1與患者預后的關系，發(fā)現(xiàn)LASP1 高表達患者的復發(fā)和總體生存時間較低表達患者顯著下降，單因素及多因素分析提示LASP1的表達及替莫唑胺化療是膠質母細胞瘤預后的獨立危險因素，結果表明LASP1的表達與GBM預后相關。目前，GAO等[21]在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)LASP1過表達與腫瘤的轉移及不良預后相關，通過LASP1/PTEN/AKT 軸可促進腫瘤增殖及遷移，是其潛在治療靶點；LI 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)LASP1 過表達促進肝癌的進展，通過miR-133b/LASP1 軸可抑制腫瘤的生長和轉移。這與本研究結果相似，說明LASP1在GBM 有可能是潛在治療靶點及預后標志物。

本研究還發(fā)現(xiàn)LASP1的表達升高降低了患者替莫唑胺的療效，LASP1與患者替莫唑胺敏感性相關。陳祺等[23]在口腔鱗癌中也發(fā)現(xiàn)LASP1表達升高可促進多西他賽耐藥，其推測與FAK-AKT 途徑的磷酸化、PI3K/AKT 等信號通路相關。在LIU等[20]及筆者前期研究中[11]均發(fā)現(xiàn)LASP1 可激活PI3K/AKT 信號通路，而PI3K/AKT 信號通路，已被研究證實參與了GBM的細胞生長、血管形成、DNA修復[24]及耐藥[25]；且目前在針對PI3K/AKT 信號通路的靶向抑制劑BKM120的研究中，也證實其可增強替莫唑胺的細胞毒性[26]。替莫唑胺主要通過誘導腫瘤DNA 烷基化損傷，從而誘導細胞凋亡；GBM 中這一作用可能被LASP1 異常激活PI3K/AKT信號通路所阻礙，從而增加了腫瘤細胞的抗藥性。進一步研究LASP1 及其相關信號通路，或可為膠質母細胞瘤的治療提供新的思路。

本研究仍具有局限性。首先，本研究為回顧性研究，納入病例數(shù)相對較少且部分病例相對久遠，有待于后期納入更多研究對象及進行前瞻性研究；其次，關于LASP1與膠質母細胞瘤增殖及耐藥的具體機制，尚需進一步分子實驗室研究。

綜上所述，LASP1在膠質母細胞瘤中高表達，與患者預后及替莫唑胺化療敏感性相關，其可能是膠質母細胞瘤潛在的治療靶點和預后評估標志物。