線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在食管鱗癌中的表達(dá)及其機(jī)制

王凱莉 陳衛(wèi)剛 丁新 楊丹平 童娟娟 陳凱麗 張少聰 鄭勇

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（新疆石河子832000）；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科（新疆石河子832000）；3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心（河北張家口075000）；4新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（烏魯木齊830001）；5南京市江寧醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（南京211100）

食管癌（esophageal cancer，EC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在2018年全球新發(fā)食管癌患者達(dá)57 萬例，因其死亡人數(shù)近51 萬例[1]，而中國食管癌發(fā)病率和死亡率約占全球一半，是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家[2]，我國食管癌早期診斷率低，確診食管癌的有90%為中晚期，5年生存率不足20%[3]。近些年，很多研究通過多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)來診斷食管癌，雖然在診斷的準(zhǔn)確性上有一定提高，但尚不能作為篩查應(yīng)用[4]。靶向治療作為一種不錯(cuò)的治療途徑，但在食管癌的治療仍處于探索階段[5]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）在線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和維持其穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，近年來許多研究已表明，TFAM基因表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]，而TFAM在食管癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。本研究通過免疫組化方法檢測(cè)食管低高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、食管癌及正常食管組織中TFAM 蛋白的表達(dá)，探討TFAM與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并通過干擾食管鱗癌細(xì)胞EC109、EC9706 中TFAM的表達(dá)，觀察干擾前后細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)特性的變化并探索其作用機(jī)制，為食管鱗癌的監(jiān)測(cè)及防治提供新的契機(jī)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科和心胸外科2012年1月至2018年8月因食管鱗狀上皮病變行胃鏡或手術(shù)的患者146例，使用組織樣本前均告知患者組織將用于科學(xué)研究，并簽署相關(guān)知情同意書，包括正常食管組織、食管低、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和食管鱗癌組織，分別27、39、24、56例，其中正常食管組織取自距離腫瘤邊緣5 cm 以上的組織，入選病例有完整的病史資料，所有患者提取組織前均未接受過放、化療及生物治療；人食管鱗癌細(xì)胞株EC109、EC9706 由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料TFAM 兔單克隆抗體（ab176558）購自Abcam公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋，質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，質(zhì)粒序序列號(hào)S1：5′-TTGTTTCTTTATTGTGCGACG-3′；S2：5′-TTAGCTGTTCTTTAAATCTGC-3′；S3：5′-AAATCGAAGGTAAGAACTTAC-3′。試劑Lip-ofectaminTM2000和Trizol 購于美國Invitrogen公司，Transwell 小室購自美國Corning公司，流式試劑盒Annnexin V-APC/PI apoptosis Kit 購于聯(lián)科生物，super signal（R）west Femto Trial kit購自Thermo Fisher科技公司，caspase3（ab32351），Bax（ab32503）兔單克隆抗體購于Abcam公司。

1.3 SP免疫組化法將組織標(biāo)本從液氮罐中取出，福爾馬林浸泡后，石蠟包埋，制成4 μm 切片，脫蠟，枸櫞酸緩沖液修復(fù)，3%的H2O2溶液沖洗，4℃冰箱孵育一抗過夜，次日，孵育二抗1 h，滴加DAB 顯色液顯色胞漿，蘇木素染液染核，1%酸酒精沖刷，脫水封片。結(jié)果判定：根據(jù)細(xì)胞漿著色強(qiáng)度分為：A 不顯色或顯色不清楚為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，棕色為4分。按顯色細(xì)胞比例評(píng)分：B 顯色細(xì)胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分，每例積分：A×B≤2分為（-），≥3分為陽性，其中3～4分為（+），5～8分為（++），9～12分及以上為（+++）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染采用含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液100×），10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，24 h 換一次液。細(xì)胞匯合度至90%時(shí)，以3.5×105個(gè)/孔的濃度接種六孔板，以質(zhì)粒與Lip2000 比例為5 μg/8.5 μL 轉(zhuǎn)染。其中實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h 后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)Trizol 裂解細(xì)胞提取總RNA，用Takara Prime Script TMRT reagent Kit（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR檢測(cè)TFAM 干擾效率，篩選出下調(diào)效果最好的質(zhì)粒，GAPDH 上游引物：5′-GCTGACAGGATGCAGAAGGA-3′，下游引物：5′-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′；TFAM 上游引物為5′-CGCTCCCCCTTCAGTTTTGT -3′，下游引物為5′-TTATATACCTGCCAC TCCGCC-3′。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。利用2-△△Ct法計(jì)算TFAM 相對(duì)表達(dá)量。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以3 000個(gè)每孔接種于96 孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24、48、72 h時(shí)在每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h 后，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，低速振蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm 處測(cè)量各孔的吸光值。

1.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48 h 后，以EC109（500個(gè)/孔），EC9706（1 000個(gè)/孔）接種于六孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d 后，PBS 洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，消化、離心，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞1.5 × 105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于transwell 上層小室，下層小室加入750 μL 20%完全培養(yǎng)基，48 h 后取出小室，固定染色，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，侵襲實(shí)驗(yàn)取配好的Matrigel膠70 μL 加入上層小室孵育5 h 備用，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞，不含EDTA 胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌兩次，收集105個(gè)細(xì)胞，用1×Binding Buffer 500 μL 重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V-APC和10 μLPI，混勻后，室溫孵育5 min 后檢測(cè)。

1.10 Western blot 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用300 μL 裂解液（PMSP∶RIPA=1∶100）在冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，根據(jù)濃度配平后，煮沸15 min，取15 μL 蛋白液電泳，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，封閉1 h，加入一抗在搖床孵育過夜。室溫孵育二抗2 h，發(fā)光試劑顯色曝光。Image J 軟件測(cè)定條帶的灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以表示，計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性用Spearman 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 在不同食管組織中TFAM的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，TFAM 蛋白在細(xì)胞漿中表達(dá)（圖1），正常食管、食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變組織和食管癌中表達(dá)陽性率分別為11.1%（3/27）、90.5%（57/63）和100%（56/56），其表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=115.44，P＜0.001；ρ=0.88，P＜0.001）。見表1。

2.2 食管鱗癌組織中TFAM的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系TFAM蛋白的表達(dá)與食管癌浸潤(rùn)深度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.001）。與患者年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（P＞0.05），侵及肌層及外膜層的食管鱗癌組織中TFAM的蛋白表達(dá)明顯高于侵及黏膜層的食管鱗癌組織（P＜0.001），TFAM的陽性表達(dá)率隨著TNM 分期等級(jí)的增高而增加（P= 0.001）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織TFAM 陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織（P=0.042）。見表1、2。

圖1 TFAM 蛋白在正常食管組織，低、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和食管鱗癌組織中的表達(dá)（SP×200）Fig.1 Expression of TFAM protein in normal esophageal tissue，low-grade intraepithelial neoplasia，high-grade intraepithelial neoplasia and esophageal squamous cell carcinoma（SP×200）

2.3 瞬轉(zhuǎn)后TFAM在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低qRT-PCR 結(jié)果顯示，EC109 細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFAM 干擾質(zhì)粒后，與對(duì)照組相比TFAM的表達(dá)降低[（0.363±0.148）vs.（1.000±0.298），t=-3.304，P= 0.030]。同樣，EC9706 細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)干擾質(zhì)粒后TFAM表達(dá)量低于對(duì)照組[（0.346±0.017）vs.（1.000±0.398），t=-2.837，P=0.047]。見圖2。Western blot結(jié)果顯示，EC109 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組TFAM表達(dá)量顯著降低[（0.420±0.021）vs.（1.520±0.035），t= 59.434，P＜0.001]；EC9706細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致[（0.649±0.013）vs.（1.095±0.030），t=23.276，P＜0.001]。

2.4 降低TFAM表達(dá)能抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖能力MTT 增殖實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)TFAM 蛋白表達(dá)后能顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力，EC109 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12 h時(shí)就出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力減弱[（0.250±0.046）vs.（0.310±0.029），t=-2.72 6，P= 0.03]。同樣，EC9706 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12 h時(shí)也表現(xiàn)出增殖能力受限[（0.260±0.013）vs.（0.310±0.013）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.049，P＜0.001），見圖3A。干擾TFAM表達(dá)后細(xì)胞增殖速度明顯減慢。見圖3B。

2.5 下調(diào)TFAM表達(dá)能抑制食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)TFAM表達(dá)后，EC109和EC9706 細(xì)胞株克隆形成能力均降低，EC109 對(duì)照組克隆形成率高于實(shí)驗(yàn)組[（30.00±1.40）%vs.（25.67±1.30）%，t=3.927，P=0.017]。EC9706 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致，與對(duì)照組克隆形成率（21.27±0.83）%相比，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率減少（13.50±0.78）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 11.783，P＜0.001）。見圖4。

2.6 降低TFAM表達(dá)能抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移能力對(duì)TFAM 敲減后，EC109 細(xì)胞遷移能力顯著降低，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組穿膜個(gè)數(shù)分別為（81.33±8.39）、（34.67±4.16）個(gè)（t= 8.633，P= 0.001）；EC9706 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致，對(duì)照組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)（73.75±24.17）個(gè)，多于干擾組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)（38.5±6.65）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.812，P=0.031）。見圖5。

表1 TFAM 蛋白在不同食管鱗狀上皮組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Expression of TFAM protein in different esophageal squamous epithelial tissuesand its relationship with clinicopathological factors例

表2 TFAM蛋白在不同食管鱗狀上皮組織分組中的表達(dá)Spearman相關(guān)系數(shù)表Tab.2 Expression of TFAM protein in different esophageal squamous epithelial tissuegroups by Spearman correlation coefficient table例

圖2 qPCR（A）和Western blot（B）分析各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Fig.2 qPCR（A）and Western blot（B）analysis of transfection efficiency of each group of cells

圖3 MTT 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力結(jié)果Fig.3 MTT test results of cell proliferation abilities in the various groups

圖4 EC109 EC9706 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of the EC109 EC9706 cell clone formation experiment

2.7 降低TFAM表達(dá)能抑制食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：下調(diào)TFAM基因能夠抑制EC109 細(xì)胞侵襲能力，EC109 細(xì)胞的對(duì)照組穿膜數(shù)（62.67±7.51）個(gè)，明顯多于干擾組（18.00±2.65）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.721，P=0.001）。同樣，EC9706 細(xì)胞對(duì)照組侵襲個(gè)數(shù)多于實(shí)驗(yàn)組[（43.6±5.03）vs.（14.6±4.67）個(gè)，（t=9.449，P＜0.001）]。見圖6。

圖5 EC109、EC9706 細(xì)胞Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色×200）Fig.5 Experimental results of migration of EC109 and EC9706 cells in Transwell（crystall violette staining× 200）

圖6 EC109、EC9706 細(xì)胞Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色×200）Fig.6 Experimental results of invasion of EC109 and EC9706 cells in Transwell（crystall violette staining× 200）

2.8 降低TFAM表達(dá)可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)TFAM基因能夠促進(jìn)EC109 細(xì)胞凋亡，對(duì)照組與干擾組的凋亡率分別為：[（6.176±0.652）%vs.（33.560±2.458）%，t=-18.647，P＜0.001]。EC9706細(xì)胞對(duì)照組凋亡率（6.563±0.918）%，比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率（32.333±1.835）%低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-21.747，P＜0.001）。見圖7。

2.9 降低TFAM表達(dá)可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞bax、Cleaved caspase3蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，EC109細(xì)胞干擾組Bax表達(dá)量顯著升高[（0.450±0.023）vs.（0.690±0.021），t=-16.764，P＜0.001]；EC9706細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致[（0.320±0.021）vs.（0.870±0.041），t=-26.309，P＜0.001]。此外，EC109細(xì)胞干擾組Cleaved Caspase3表達(dá)量顯著升高[（0.750±0.023）vs.（1.080±0.014），t=-27，P＜0.001]；EC9706 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致[（0.750±0.020）vs.（0.970±0.021），t=-17.394，P＜0.001]。見圖8。

圖7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Experimental results of flow cytometry for detecting apoptosis

圖8 各組食管鱗癌細(xì)胞中Bax和Cleaved caspase3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平Fig.8 Protein expression levels of Bax and Cleaved caspase3 in esophageal squamous carcinoma cell

3 討論

我國食管癌發(fā)生在80～84歲年齡階段人群中最多[7]，老年人由于身體狀況差且常伴有多種基礎(chǔ)疾病，如高血壓、糖尿病等，使手術(shù)難度大、風(fēng)險(xiǎn)高，只能選擇放化療，盡管放化療的方案仍在不斷改進(jìn)，但放化療遠(yuǎn)期所面臨的癌癥復(fù)發(fā)及各種并發(fā)癥仍然難以避免[8-9]。我國食管癌預(yù)后差的重要原因是早期診出率低。若能早期診治，及時(shí)給予干預(yù)措施，將為公共衛(wèi)生事業(yè)減輕負(fù)擔(dān)。因此，早期診斷食管癌的技術(shù)手段及腫瘤標(biāo)志物的研究更為迫切。

本研究中，食管鱗癌組織TFAM表達(dá)陽性率顯著高于非典型增生上皮及正常食管上皮組織，提示TFAM可能參與食管鱗癌的發(fā)生。在嚴(yán)重的食管鱗癌患者中，TFAM表達(dá)量明顯更高，表明TFAM可能參與食管鱗癌的侵襲及演進(jìn)。與QIAO等[10]研究結(jié)果一致，TFAM在肝癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。此外，本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾TFAM 使其表達(dá)下調(diào)后發(fā)現(xiàn)兩株食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著下降，表明該基因可能扮演著促癌基因的角色，促進(jìn)食管癌的增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。XIE 等[11]研究認(rèn)為是下調(diào)TFAM后激活ROS 介導(dǎo)的JNK/p38MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路并且降低細(xì)胞能量所致。但TFAM在食管癌中的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。WU 等[12]發(fā)現(xiàn)下調(diào)TFAM可提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度，表明TFAM可能介導(dǎo)癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生。TFAM 有望成為治療、預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后的有效靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

本研究流式結(jié)果提示，通過下調(diào)TFAM表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率明顯增高，線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，其活性的破壞與癌癥的發(fā)展有關(guān)[13]。mtDNA是除細(xì)胞核染色體以外的基因組，具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成功能，TFAM在維持mtDNA 完整性中發(fā)揮著核心作用[14-15]，當(dāng)線粒體受到損傷后，介導(dǎo)Caspase 凋亡途徑引起“瀑布”樣酶聯(lián)反應(yīng)，首先誘發(fā)促凋亡蛋白Bax 活化，使線粒體膜兩端電壓差消失，膜通透性增加，細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cytc）得以釋放，Cytc、Apfl和DATP/ATP 結(jié)合生成凋亡小體，凋亡小體自我剪切后，活化Caspase-9，其在進(jìn)一步活化下游Caspase3、6、7，最終促使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，細(xì)胞不可逆地走向死亡。在線粒體凋亡途徑中Caspase3是凋亡信息的執(zhí)行者，是Caspase 介導(dǎo)凋亡的必經(jīng)之路[16]。Bax是Bcl-2 家族中促進(jìn)凋亡的成員，是線粒體介導(dǎo)的Caspase 凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)物[17]。為了解其機(jī)制，筆者用Western blot 方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)TFAM表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞中Cleaved caspase3、Bax表達(dá)明顯增加，預(yù)示著降低TFAM在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)可能通過促進(jìn)Cleaved caspase3、Bax 凋亡蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。

綜上所述，TFAM與食管癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，并可能通過影響B(tài)ax、caspase3的表達(dá)來調(diào)控食管癌細(xì)胞的凋亡。隨著國家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略的開展，若能靶向檢測(cè)食管癌上該基因表達(dá)量及抑制該基因，將為食管癌的早期診斷、治療和預(yù)后提供新的契機(jī)。然而由于本研究樣本量較少，且缺少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，論證結(jié)果說明有限，后期將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。