腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)周細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白的影響

萬(wàn)鳴宏 羅富里 晏子友

1江西中醫(yī)藥大學(xué)（南昌330006）；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（南昌330006）

許多慢性腎臟病進(jìn)入腎衰竭階段都伴有腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）的病理改變，嚴(yán)重危害患者健康。目前治療方法多為抑制RIF的發(fā)展，達(dá)到延緩慢性腎臟病進(jìn)展的治療初衷。周細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（pericyte-myofibroblast transition，PMT）是RIF 形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[1-2]。周細(xì)胞是一種血管壁細(xì)胞，研究表明，腎臟中存在大量周細(xì)胞，而周細(xì)胞與腎臟病關(guān)系密切，例如間質(zhì)纖維化和糖尿病腎病[3]。周細(xì)胞可調(diào)節(jié)微血管的穩(wěn)定性與滲透性、調(diào)節(jié)血管的新生與成熟，并且還是一種具有多種分化潛能的干細(xì)胞，可以分化成成纖維細(xì)胞等[4]。研究表明腎損傷后周細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MF）的形成密切相關(guān)[5]。周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞分離使腎小管周圍毛細(xì)血管穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致腎小管血流量減少、供血不足以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，促進(jìn)RIF 形成[6]。研究表明，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）可作為MF的標(biāo)記物，且α-SMA的表達(dá)量與ECM的表達(dá)量呈正相關(guān)[7]。血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）主要表達(dá)于周細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等[8]，且血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）信號(hào)通路對(duì)周細(xì)胞的募集及轉(zhuǎn)分化非常重要[9]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)PDGF 信號(hào)通路可使腎臟中周細(xì)胞數(shù)量下降，α-SMA表達(dá)水平降低[10]。PDGF 通路的激活使神經(jīng)/膠質(zhì)細(xì)胞2型硫酸軟骨素糖蛋白（NG-2）膠質(zhì)細(xì)胞增多，NG-2的表達(dá)增加[11]。腎衰泄?jié)釡鶕?jù)RIF的中醫(yī)病機(jī)“虛、濕、瘀、毒”進(jìn)行研制，本課題組之前的研究結(jié)果表明腎衰泄?jié)釡哂醒泳徛阅I衰竭的作用[12-13]。但機(jī)制尚不明確。本研究建立單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型，觀察腎衰泄?jié)釡捌洳鸱礁深A(yù)PMT 過(guò)程中相關(guān)蛋白PDGFR-β、NG-2、α-SMA表達(dá)的程度，討論腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)PMT的影響，為臨床上防治RIF 提供治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取1個(gè)月齡健康雌性SD 大鼠（SPF級(jí)）96只，體質(zhì)量180～190 g[浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心培養(yǎng)，合格證號(hào)SCSK（浙）20170001]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑將實(shí)驗(yàn)所需中藥（由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供）常規(guī)水煎、濃縮，制成腎衰泄?jié)釡珴饪s劑，濃縮劑每1 mL 含生藥量1.2 g（劑量均相當(dāng)于每1 kg 成人劑量10倍，依據(jù)沈映君《中藥藥理學(xué)》中藥實(shí)驗(yàn)用藥換算大鼠用藥劑量換算）。中藥組及貝那普利組均按《中藥藥理學(xué)》給藥。各中藥組組成：補(bǔ)虛方組（生黃芪30 g、巴戟天10 g）、袪邪方組（生牡蠣30 g、蒲公英15 g、丹參15 g、生大黃（后下）10 g、槐花10 g）、腎衰泄?jié)釡M（生黃芪30 g、生牡蠣30 g、丹參15 g、蒲公英15 g、巴戟天10 g、生大黃10 g（后下）、槐花10 g）。水煎濃縮后真空密封包裝，每袋150 mL，5℃冰箱保存?zhèn)溆?。北京諾華制藥有限公司提供貝那普利（商品名：洛丁新）。福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供DAB 顯色試劑盒、免疫組化超敏SP 試劑盒、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模大鼠正常喂養(yǎng)7 d，取尿蛋白陰性大鼠用于實(shí)驗(yàn)。按體質(zhì)量隨機(jī)分為腎衰泄?jié)釡M、補(bǔ)虛方組、袪邪方組、貝那普利組、模型組、假手術(shù)組，每組16只。腎衰泄?jié)釡M、祛邪方組、補(bǔ)虛方組、貝那普利組、模型組建立UUO 動(dòng)物模型，制作參照文獻(xiàn)制作[14]，假手術(shù)組不作處理。

1.3.2 動(dòng)物給藥腎衰泄?jié)釡M按照1.2 g/mL 比例配制腎衰泄?jié)釡珴饪s劑給藥，即劑量為12 g/（kg·d）體質(zhì)量灌胃；祛邪方組按照0.6 g/mL、補(bǔ)虛方組按照0.6 g/mL 比例配制腎衰泄?jié)釡珴饪s劑給藥，即劑量為6 g/（kg·d）體質(zhì)量灌胃；貝那普利組大鼠予以貝那普利1.5 mg/（kg·d）體質(zhì)量灌胃；模型組及假手術(shù)組大鼠予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后7、14 d 隨機(jī)選取大鼠8只，給藥2 h 后腹主動(dòng)脈取血并處死，立即將血液滴入含0.4 mL 4%EDTA-Na2的抗凝管中，250 g 離心10 min 并分離血清，存于-20℃冰箱內(nèi)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)腎組織學(xué)檢查：取標(biāo)本后予4%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋后切片，厚度大約為4 μm。行HE 及Masson染色后置于光鏡下觀察，進(jìn)行UUO 腎小管損傷評(píng)估。

1.4.2 Western blot分析取150 mg 腎組織標(biāo)本置于預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液中冰浴超聲裂解，在4℃下按12 000 r/min 離心10 min，取上清液用Bradford 法測(cè)蛋白濃度。測(cè)完后分裝蛋白并在95℃下煮沸10 min 使其變性，-20℃下保存，供Western blot 測(cè)定使用。使用抗體如下：α-SMA（1∶2 000）、NG-2（1∶1 000）、PDGFR-β（1∶500）、β-actin（1∶1 000），抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。以βactin為內(nèi)參照進(jìn)行帶灰度分析。將目標(biāo)帶與參考帶的灰度比值作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)，采用Image J 1.8 軟件進(jìn)行圖片處理。北京普利萊生物科技有限公司提供RIPA 裂解液、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

1.5 腎小管損傷程度評(píng)分及纖維化指數(shù)測(cè)定

1.5.1 HE染色分析光學(xué)顯微鏡單盲觀察視野內(nèi)腎小管病變（腎小管擴(kuò)張、萎縮，紅細(xì)胞管型、蛋白管型、腎間質(zhì)水腫等）數(shù)目。腎小管損傷指數(shù)按Banff 分級(jí)（0～3級(jí)）計(jì)分評(píng)定。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)明顯病理變化（腎小管病變數(shù)目0個(gè)）計(jì)0分；輕度病理改變（累及小管數(shù)目＜3個(gè)）計(jì)1分；中度病理改變（累及小管數(shù)目3～5個(gè)）計(jì)2分；重度病理改變（累及小管數(shù)目＞5個(gè)）計(jì)3 分。

1.5.2 Masson染色分析200倍視野下選取每只大鼠5 張組織切片，每張切片選取5個(gè)互不重疊的腎小管間質(zhì)視野，觀察視野中染色面積占總視野面積的百分比，并取平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性面積＜2%時(shí)計(jì)0分；陽(yáng)性面積在2%～10%時(shí)計(jì)1分；陽(yáng)性面積在11%～20%時(shí)計(jì)2分；陽(yáng)性面積在21%～30%時(shí)計(jì)3分；陽(yáng)性面積＞30%時(shí)計(jì)4 分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件包處理、分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用（）表示，組間比較用方差分析與獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟病理變化光鏡下HE和Masson染色（圖1-2）。術(shù)后第7、14 d時(shí)，除假手術(shù)組外，各組術(shù)后均有炎癥表現(xiàn)；隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，除假手術(shù)組外，各組可見(jiàn)纖維化，模型組更為明顯，腎小管可見(jiàn)水腫、炎癥細(xì)胞，部分鈣化、壞死；假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。各治療組較模型組有所改善。腎衰泄?jié)釡M改善明顯，病變損傷較輕。治療組較模型組效果好，腎衰泄?jié)釡M較其他中藥組及貝那普利組效果相對(duì)較好。

圖1 各組藥物對(duì)大鼠腎組織HE染色結(jié)果影響（HE，×200）Fig.1 Effects of each group of drugs on HE staining results in rat kidney tissue（HE，×200）

圖2 各組藥物對(duì)大鼠腎組織Masson染色結(jié)果影響（Masson，×200）Fig.2 Effect of each group of drugs on Masson staining results in rat kidney（Masson，×200）

2.2 各組大鼠術(shù)側(cè)腎臟HE評(píng)分及Masson評(píng)分比較術(shù)后第7、14天時(shí)，假手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)腎臟HE評(píng)分及Masson評(píng)分無(wú)明顯變化；模型組大鼠術(shù)側(cè)腎臟HE評(píng)分及Masson評(píng)分顯著升高，較假手術(shù)組高（P＜0.05）；各治療組腎臟HE評(píng)分及Masson評(píng)分均明顯低于模型組（P＜0.05，表1）。

2.3 Western Blot 法檢測(cè)UUO 大鼠腎組織中PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白的表達(dá)術(shù)后第7天時(shí)，模型組大鼠PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組增多（P＜0.05），術(shù)后第14天時(shí)，模型組大鼠蛋白增多更明顯（P＜0.05）。第7、14天時(shí)，各治療組PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白的表達(dá)有所下降，但較假手術(shù)組高。治療組中腎衰泄?jié)釡MPDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白減少較其他組明顯（P＜0.05，圖3）。

3 討論

許多因子[15]和信號(hào)通路[16-18]可加速RIF 進(jìn)展，其中PMT是加速腎纖維化形成的關(guān)鍵[19]?，F(xiàn)在公認(rèn)腎纖維化時(shí)PMT 使腎臟ECM 積累增多，且α-SMA 蛋白表達(dá)增多，與本實(shí)驗(yàn)中α-SMA 蛋白表達(dá)隨大鼠腎臟纖維化程度加重逐漸增多基本一致。信號(hào)通路與腎纖維化的研究近年來(lái)趨于成熟[20]，但中藥復(fù)方對(duì)信號(hào)通路的影響研究結(jié)果較少，本實(shí)驗(yàn)從該角度，運(yùn)用中藥復(fù)方對(duì)PMT 進(jìn)行干預(yù)，觀察到PDGFR-β蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明腎衰泄?jié)釡蓪?duì)PDGF 通路產(chǎn)生影響，進(jìn)而抑制PMT；另有研究指出，PDGF 通路還能調(diào)控NG-2 膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，使NG-2蛋白表達(dá)增多[21]，本實(shí)驗(yàn)觀察到腎衰泄?jié)釡MNG-2蛋白表達(dá)較其他組少，與其結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)以PMT為研究RIF的切入點(diǎn)，通過(guò)觀察腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)PMT 過(guò)程中α-SMA、PDGFRβ、NG-2蛋白表達(dá)的影響，提出抑制PMT 可能為腎衰泄?jié)釡捌洳鸱窖泳廟IF 發(fā)展的機(jī)制，為日后治療提供新思路。

表1 各組大鼠HE評(píng)分及Masson評(píng)分Tab.1 HE scores and Masson scores of rats in each group±s

表1 各組大鼠HE評(píng)分及Masson評(píng)分Tab.1 HE scores and Masson scores of rats in each group±s

注：與同時(shí)期模型組及各治療組比較，△P＜0.05；與同時(shí)期模型組及各治療組比較，#P＜0.05；與同時(shí)期不同治療組比較，*P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組腎衰泄?jié)釡M祛邪組補(bǔ)虛組貝那普利組天數(shù)（d）7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 7 14只數(shù)8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 HE評(píng)分0.21±0.12△0.23±0.11△1.69±0.56 2.42±0.53 1.11±0.23*1.52±0.33*1.32±0.29 1.59±0.34 1.33±0.32 1.61±0.37 1.34±0.33 1.67±0.32 Masson評(píng)分0.34±0.11△0.34±0.12△1.61±0.42 2.20±0.47＃0.74±0.22*1.02±0.32*0.83±0.18 1.22±0.39 0.88±0.18 1.25±0.49 0.87±0.19 1.23±0.42

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA、NG-2、PDGFR-β蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of α-SMA，NG-2，PDGFR-β protein in kidney tissue of rats in each group

長(zhǎng)期臨床實(shí)踐證明腎衰泄?jié)釡_實(shí)能延緩腎纖維化進(jìn)程，保護(hù)腎功能[12-13]，但作用機(jī)制尚不明確。RIF 病機(jī)為“虛、濕、瘀、毒”，關(guān)鍵病機(jī)為“脾腎虧虛、濕毒內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻滯”，為本虛標(biāo)實(shí)之證[22]，治療上需標(biāo)本兼顧，腎衰泄?jié)釡且来酥畏ㄑ兄?。在疾病前期，多以邪?shí)（濕、瘀、毒）致病為主，活血化瘀、祛濕泄?jié)釣樵撈诨局畏?，方中生牡蠣軟?jiān)除濕，下泄?jié)穸荆压⑶鍩峤舛?，丹參活血化瘀，生大黃瀉濁毒、破積滯、化瘀血，槐花清瘀熱；到疾病晚期，正氣消耗過(guò)多，則以本虛為主，治以扶正、補(bǔ)腎，方中黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)利尿，巴戟天補(bǔ)腎助陽(yáng)化氣；祛邪與補(bǔ)虛的聯(lián)合運(yùn)用，標(biāo)本兼顧，體現(xiàn)了中醫(yī)治病的整體觀念。近年來(lái)，PMT 已成為RIF的研究熱點(diǎn)[23]，但國(guó)外對(duì)中藥復(fù)方抑制PMT的研究相對(duì)較少。目前本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)PMT 相關(guān)蛋白的影響，尋找可能的作用機(jī)制。貝那普利可減輕RIF的程度，以其為對(duì)照組可以更好地觀察腎衰泄?jié)釡寞熜А１緦?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第7、14天時(shí)，各治療組及貝那普利組治療后PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白的表達(dá)較模型組降低，較假手術(shù)組升高；各治療組及貝那普利組治療后Masson、HE評(píng)分較模型組降低，較假手術(shù)組升高；說(shuō)明各治療組及貝那普利組均可抑制PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白的表達(dá)，改善RIF的進(jìn)展。腎衰泄?jié)釡M各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于其余治療組，說(shuō)明整體治療效果優(yōu)于單獨(dú)治療，標(biāo)本兼顧可以起到更好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)局限在慢性腎臟病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腎衰泄?jié)釡锌赡芨深A(yù)多條信號(hào)通路達(dá)到延緩RIF 作用，目前尚未詳細(xì)探討，缺乏整體性對(duì)比；且由于研究樣本數(shù)量較少，具體作用機(jī)制尚不明確，本課題組將繼續(xù)完善相關(guān)研究。

綜上所述，腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綔p輕RIF的機(jī)制可能是通過(guò)減少PDGFR-β、α-SMA、NG-2蛋白的表達(dá)來(lái)抑制PMT的過(guò)程，達(dá)到延緩RIF 發(fā)展的作用。