瞬時(shí)感受器電位-香草素受體4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在牙齦瘤中的表達(dá)及意義

米會(huì)會(huì) 沈亞峰 孫斌 陶林 徐江

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（新疆石河子832000）

牙齦瘤是牙齦局限性慢性炎性增生[1]，具體發(fā)生機(jī)制不明。根據(jù)病理結(jié)構(gòu)牙齦瘤常分為纖維性、肉芽腫性及血管性3型[2]。這種增生與牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）、上皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)增多有關(guān)。隨著我國(guó)高血壓患病率的增高，服用以鈣離子阻滯劑（calcium channel bockers，CCB）為降壓藥的患者逐漸增多，臨床中CCB 誘導(dǎo)的牙齦增生已居藥物性牙齦增生（drug-induced gingival overgrowth，DGO）首位[3]。

瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，參與許多細(xì)胞病理生理學(xué)變化，與牙齦增生有密切聯(lián)系[4]。其中，瞬時(shí)感受器電位-香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是非選擇性能透過(guò)Ca2+、Na+等陽(yáng)離子的發(fā)卡狀通道[5]。已有研究表明[4，6-7]TRPV4 廣泛表達(dá)于神經(jīng)、血管、心臟和腎臟等組織。功能上可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活，參與多種生理及病理過(guò)程[8-9]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種與炎癥和纖維化相關(guān)的因子，廣泛表達(dá)于心臟、肝臟、腎臟和牙齦等組織中，能夠促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維（Ⅰ型、Ⅲ型）的合成[10-11]。當(dāng)前，TRPV4在牙齦瘤中的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法探究TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為牙齦瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選取石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2010年10月至2018年10月手術(shù)切除的牙齦瘤存檔石蠟標(biāo)本共148例（牙齦瘤組C組）；智齒冠周炎患者阻生齒拔除術(shù)后炎癥牙齦組織47例（炎癥牙齦組B組）；另選取29例于我院因美觀或修復(fù)等原因，行冠延長(zhǎng)術(shù)患者牙齦組織（正常牙齦組A組）。牙齦瘤全部經(jīng)病理確診并分型。其中纖維性、肉芽腫性各50例，血管性48例。牙齦瘤組中，男67例，女81例，平均（46.34±14.23）歲；炎癥牙齦組中，男22例，女25例，平均（39.25±12.42）歲；正常組男14例，女15例，平均（28.43±14.03）歲。入選者均知研究目的，及參加研究的潛在危險(xiǎn)和利益，且簽署知情同意書(shū)。

服用硝苯地平的藥物性牙齦增生組納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：（1）有高血壓病史且服用硝苯地平時(shí)間≥6個(gè)月；（2）伴有牙齦增生，上下頜前牙區(qū)嚴(yán)重；（3）需排除糖尿病等其他全身性疾病；（4）未同時(shí)服用苯妥英鈉、環(huán)孢素A 等其他引起牙齦增生的藥物；（5）近6個(gè)月未接受過(guò)牙周基礎(chǔ)治療；（6）手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素服用史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療期間換用非鈣離子阻滯劑類(lèi)降壓藥物者；（2）口服避孕藥者；（3）由非鈣詰抗類(lèi)藥物（如苯妥英鈉、環(huán)孢素A）引起的牙齦增生者。

1.2 主要試劑TRPV4抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司（ab94868），稀釋濃度1∶100；TGF-β1抗體購(gòu)自Affinity公司（af1027），稀釋濃度1∶150；免疫組化試劑盒（封閉液、二抗、SAB 復(fù)合物以及DAB 顯色試劑）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測(cè)。步驟：將牙齦組織標(biāo)本固定包埋后切片，脫蠟后EDTA 修復(fù)抗原，3% H2O2孵育。BSA 處理后分別加入一抗覆蓋組織，以PBS為陰性對(duì)照4℃過(guò)夜后加入相應(yīng)種屬的二抗，孵育漂洗后加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色（陽(yáng)性染色為棕黃色）。顯色完全后沖洗切片，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水反藍(lán)。將干燥透明后的切片封固待觀察。

1.4 結(jié)果判定由2名病理科副主任醫(yī)師分別單盲法閱片。采用判定標(biāo)準(zhǔn)[13]：對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例及著色深淺進(jìn)行計(jì)分，以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕黃色為陽(yáng)性，根據(jù)著色的強(qiáng)弱程度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)定和分析。積分?jǐn)?shù)＝陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比判定標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)標(biāo)本都隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野（× 200），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比（陽(yáng)性細(xì)胞百分率）：＜5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4 分。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)著色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分；棕褐色為4 分。陽(yáng)等級(jí)：1～4為陰性（-）；5～8分為弱陽(yáng)性（+）；9～12分為陽(yáng)性（++）。以（+～++）為陽(yáng)性，（-）為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，行Spearman 相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達(dá)TRPV4和TGF-β1的在鱗狀上皮層中表達(dá)由深至淺依次為上皮基底層、棘層、顆粒層及固有層淺層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在間質(zhì)中主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，呈淺黃色或棕色顆粒，少量表達(dá)于胞核中（圖1）。TRPV4在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤組織中的陽(yáng)性率分別為41.38%（12/29）、48.94%（23/47）和83.11%（123/148），結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1）。TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤組織中的陽(yáng)性率分別為31.03%（9/29）、53.19%（25/47）和85.81%（127/148），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

2.2 TRPV4和TGF-β1表達(dá)與牙齦瘤臨床參數(shù)關(guān)系TRPV4表達(dá)與牙齦瘤患者年齡呈顯著相關(guān)（P＜0.05），且年齡越大，TRPV4表達(dá)越低。TGF-β1的表達(dá)在牙齦瘤患者年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TRPV4和TGF-β1在非藥物性牙齦增生的陽(yáng)性率顯著高于藥物性牙齦增生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。TRPV4和TGF-β1表達(dá)在性別、族別方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 TRPV4和TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織和牙齦瘤組織中的表達(dá)（×200）Fig.1 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in normal gingival tissue，inflammatory gingival tissue and epulis tissues（×200）

2.3 TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤病理分型中表達(dá)TRPV4和TGF-β1表達(dá)均與牙齦瘤病理分型相關(guān)（P＜0.05），且均以血管性牙齦瘤陽(yáng)性率最高，分別為93.75%（45/48）和97.91%（47/48）。而TRPV4中陽(yáng)性率最低的是肉芽腫性牙齦瘤，其陽(yáng)性率為70%（35/50），纖維性陽(yáng)性率為86%（43/50）；TGF-β1中陽(yáng)性率最低則為纖維性，其陽(yáng)性率為70%（35/50），肉芽腫性陽(yáng)性率為90%（45/50）。見(jiàn)表3。

圖2 TRPV4與TGF-β1在不同牙齦組織中的表達(dá)Fig2 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in different gingival tissues

2.4 TRPV4和TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1的相關(guān)性。牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r= 0.391，P＜0.001）。見(jiàn)表4。

3 討論

TRP 通道于1969年首次于果蠅的視覺(jué)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[14]，為非選擇性陽(yáng)離子通道，廣泛分布于多種生物中。其能被多種刺激激活，如機(jī)械牽張、溫度變化、氧化應(yīng)激和炎性因子等[15]，進(jìn)而激活下游相關(guān)陽(yáng)離子通路，并參與細(xì)胞舒縮、增殖及分化等多種病理生理過(guò)程。而不同TRP通道對(duì)鈣離子、鎂離子、鈉離子、氫離子等的通透選擇性不同[16]。TRPV4 廣泛表達(dá)在神經(jīng)、消化、呼吸、心血管等系統(tǒng)，可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活[7-9]，可引起鈣離子、鈉離子的流動(dòng)，并主要通過(guò)對(duì)鈣離子的調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生異構(gòu)體等不同連接方式，影響細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[17]。與正常組織細(xì)胞比，TRPV4在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如肝癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等[17]；極少數(shù)情況下呈低表達(dá)，如前列腺癌和食管癌[7]。TGF-β1是組織纖維化中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能通過(guò)激活下游的Smad 信號(hào)，從而促進(jìn)血管形成、成纖維細(xì)胞增生、肌成纖維細(xì)胞分化、基質(zhì)沉積、膠原合成等[18]，尤其在炎癥反應(yīng)、纖維化、組織修復(fù)及胚胎發(fā)育以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等病理、生理過(guò)程發(fā)揮重要作用。WRANA 等[19]研究TGF-β1 對(duì)HGFs的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)TGF-β1 能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。此外，TGF-β1 能促進(jìn)牙齦細(xì)胞增殖及組織修復(fù)。這些均提示TGF-β1能調(diào)節(jié)HGFs的增殖，影響牙齦組織的損傷與修復(fù)。

表2 分析TRPV4與TGF-β1在牙齦瘤中的表達(dá)與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 Analysis of the relationship between the expression of TRPV4 and TGF-β1 in epulis and various clinical parameters

表3 TRPV4和TGF-β1表達(dá)與牙齦瘤病理分型關(guān)系Tab.3 Relationship between expression of TRPV4 and TGF-β1 and pathological typing of epulis

表4 牙齦瘤組織中TRPV4與TGF-β1的相關(guān)性Tab.4 Correlation between TRPV4 and TGF-β1 in epulis

TRPV4 已被證明在多種組織器官中有表達(dá)，但其在口腔中的表達(dá)及作用還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。如YAMADA 等[20]研究表明，TRPV4 高表達(dá)后刺激肝星狀細(xì)胞增殖，間接誘發(fā)肝癌。李孝瓊等[21]通過(guò)抑制TRPV4表達(dá)，能夠抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)用增殖表皮癌細(xì)胞）增殖，并推測(cè)TRPV4在宮頸癌HeLa 細(xì)胞異常增殖中可能具有負(fù)向調(diào)控作用。本研究中TRPV4 主要表達(dá)在牙齦上皮基底層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。TRPV4在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤中表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，在牙齦瘤中表達(dá)最高。因牙齦瘤是炎癥引起的瘤樣增生物，筆者推測(cè)TRPV4在牙齦瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用。

TGF-β1是由炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌的、與纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子[22]，有研究表明，炎癥及細(xì)胞因子（如TGF-β1）在牙齦瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，這與本研究結(jié)果一致。本研究中TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織和牙齦瘤三者中陽(yáng)性表達(dá)率呈逐級(jí)上升趨勢(shì)，且TGF-β1 陽(yáng)性率在牙齦瘤中較高為86.00%，表明TGF-β1 促進(jìn)牙齦瘤的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)TRPV4和TGF-β1表達(dá)均與牙齦瘤患者是否為藥物性牙齦增生顯著相關(guān)。TRPV4表達(dá)與牙齦瘤患者年齡相關(guān)，TGF-β1與之無(wú)關(guān)。本研究入選的藥物性牙齦增生患者以服用鈣離子阻滯劑的高血壓患者為主，國(guó)外資料顯示鈣通道阻滯劑引起藥物性牙齦增生患病率為15%～85%，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道為20%。鈣通道阻滯劑的藥理學(xué)機(jī)制是：作用于冠狀血管和周?chē)交〖?xì)胞，且能夠選擇性阻滯細(xì)胞膜鈣通道，阻止鈣離子內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)可利用鈣離子。TRPV4是以鈣離子為主要透過(guò)性陽(yáng)離子通道，推測(cè)鈣離子阻滯劑類(lèi)藥物對(duì)該通道有抑制作用，從而導(dǎo)致TRPV4在在非藥物性牙齦增生中表達(dá)顯著高于藥物性牙齦增生，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而藥物性牙齦增生以纖維性居多，本研究結(jié)果可為探索藥物性牙齦增生的發(fā)生機(jī)制提供新思路。而隨著老齡化社會(huì)的進(jìn)入，高血壓患者逐漸增多，服用鈣離子阻滯劑的患者也逐漸增加，因此，當(dāng)年齡越大，藥物性牙齦增生患者相對(duì)越多，則TRPV4表達(dá)就相對(duì)越低，恰與藥物性牙齦增生與非藥物性牙齦增生相比，表達(dá)較低結(jié)果一致。因此推論TRPV4對(duì)藥物性牙齦增生有部分抑制作用，對(duì)研究藥物性牙齦增生中纖維性增生較多有一定意義。

TRPV4主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞中，少量表達(dá)于巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎細(xì)胞。研究表明，TGF-β1在口腔鱗癌中高表達(dá)，對(duì)鱗癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用明顯，能夠促進(jìn)腫瘤的形成和增長(zhǎng)。而肉芽腫性牙齦瘤中以大量炎細(xì)胞及部分新生血管為主，血管性牙齦瘤則以大量成熟血管為主，伴少量炎細(xì)胞，纖維性牙齦瘤中以膠原纖維為主，伴少量血管及炎細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中表達(dá)呈正相關(guān)，且二者均高表達(dá)。因此，推測(cè)TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

本研究通過(guò)免疫組化法分別檢測(cè)正常牙齦、炎癥牙齦、牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1的表達(dá)，結(jié)果表明牙齦瘤組TRPV4和TGF-β1 明顯高于另外兩組，推測(cè)TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的發(fā)生中起到一定調(diào)控作用。TRPV4和TGF-β1在藥物所致的牙齦增生中有一定作用，但TRPV4和TGFβ1 調(diào)控藥物性牙齦增生的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中均呈高表達(dá)，起協(xié)同作用。未來(lái)仍需要對(duì)TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的多層次不同方向進(jìn)行研究。