溫度敏感型富血小板血漿對角膜堿燒傷組織血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的影響

彭小維 曾桂香 楊洋 于春紅

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒童眼科（南昌330006）

角膜堿燒傷是眼科常見的而且比較嚴(yán)重的外傷性眼病，燒傷后由于角膜上皮的大量破壞，引起角膜組織感染、潰瘍，最終角膜穿孔和新生血管形成導(dǎo)致視力喪失[1-2]。目前角膜堿燒傷臨床上主要以藥物和手術(shù)治療，治療方法和效果仍然是眼科的熱點和難點。近幾年興起的損傷性修復(fù)治療為角膜上皮組織的修復(fù)起到了一定的作用，減少了角膜感染。自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）作為一種損傷修復(fù)性生物制劑，近年來已被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療，包括頜面部創(chuàng)傷愈合[3]、促進周圍神經(jīng)再生[4]、整形美容[5-6]、骨科[7-8]和眼科疾病[9-10]等。在眼表疾病中仍然以局部滴用PRP為主[11-13]，由于眼部結(jié)構(gòu)的特殊性，各種血眼屏障的存在，降低了它在眼表的吸收和利用。因此本研究以泊洛沙姆407為基質(zhì)將其制成溫度敏感型富血小板血漿凝膠（temperature sensitive platelet-rich plasma，TSPRP），觀察其對兔角膜堿燒傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康日本大耳白兔（南昌龍平兔業(yè)公司）20只，雌雄不限（雌兔未孕），體質(zhì)量2.0～2.5 kg。

1.2 主要試劑和設(shè)備免疫組化用兔CD34抗體（PAB18289）：ABNOVA公司，電子恒溫水浴鍋（ZSXH-618 上海智城分析儀器制造公司），泊洛沙姆407（F127 上海協(xié)泰化工公司），1 mol/L NaOH溶液（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院），Olympus 顯微鏡（上海澤途機電設(shè)備公司），PRP（采血制備），血小板計數(shù)板（上海醫(yī)樂醫(yī)用光學(xué)儀器廠），離心機（SC-04 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司），0.9%NS，分析天秤（FA2104 上海良平儀器儀表公司），全自動血細(xì)胞分析（XE-2100 希森美康醫(yī)用電子公司）。

1.3 兔角膜堿燒傷模型制作及分組置開瞼器，0.5%丁卡因麻醉右眼，以直徑為10 mm的浸有1 mol/L NaOH溶液的濾紙片貼于角膜上1 min 取下，用NS 沖洗角膜及結(jié)膜囊2 min，制備兔角膜堿燒傷模型。采用隨機數(shù)字表法將兔分為NS組、PRP組、TSPRP組、GBM組4個組，每組5只大耳白兔。分別采用NS、PRP、TSPRP和GBM 點眼，每日4次，連續(xù)2 周。

1.4 PRP 制備（1）抽取靜脈血放置抗凝管中；（2）用215 g（350 rpm）速度將靜脈血離心10 min（常溫）；（3）吸取全部貧血小板血漿、血小板濃縮物及交界面下少量紅細(xì)胞放置空白管中，用863 g（1 420 rpm）速度進行第2次離心（常溫）10 min；（4）保留少量上清液，將余下液體混合，得到PRP。制備好的PRP 低溫保存，3 d 后重新制備。

1.5 TSPRP制備用泊洛沙姆和滅菌注射用水以50%的濃度混合，冰箱（4℃）放置24 h，完全溶解混合均勻制得GBM。再將GBM與PRP 按濃度為23%的比例混均，控制pH 值為7.1，膠凝溫度在34℃，即得TSPRP。制備好的TSPRP 低溫保存，3 d 后重新制備。

1.6 角膜潰瘍和炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)角膜炎癥評分：角膜透明無混濁（0分）；角膜輕度混濁可見虹膜紋理（1分）；角膜中度混濁看不見虹膜紋理（2分）；角膜中度混濁隱約可見瞳孔（3分）；角膜重度混濁看不清瞳孔（4分）。角膜潰瘍（熒光素鈉染色）評分：無著色（0分）；染色面積≤1/4 象限（1分）；1/4象限＜染色面積≤1/2 象限（2分）；1/2 象限＜染色面積≤3/4 象限（3分）；染色面積＞3/4 象限（4分）。

1.7 標(biāo)本采集和免疫組織化學(xué)染色2 周后，過量麻醉處死，角膜常規(guī)甲醛固定，脫水、浸蠟、包埋、切片。免疫組織化學(xué)染色采用SP 法，DAB 顯色，CD34抗體濃度為1∶200。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：以CD34表達來標(biāo)記血管內(nèi)皮，管腔＞8個紅細(xì)胞、血管有較厚肌層的均不計數(shù)，內(nèi)皮細(xì)胞成簇或單個內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色均作為一個血管計數(shù)。每張切片任意取5個視野，測定微血管面密度和微血管數(shù)，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法以（）表示實驗數(shù)據(jù)，方差齊性用Bartlett 法檢驗，用LSD-t檢驗及方差分析進行組間和組內(nèi)的多重比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSPRP配制的TSPRP濃度為23%，pH 值為7.0，刺激試驗無充血、流淚、畏光等，血小板平均值為1 016.54×109/L，膠凝溫度為34℃。

2.2 角膜潰瘍和炎癥治療14 d，裂隙燈下見NS組和GBM組角膜混濁、水腫，上皮缺損，潰瘍明顯，角膜炎癥和潰瘍評分經(jīng)LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PRP組和TSPRP組角膜上皮完整，基質(zhì)周邊清亮、中央混濁和水腫，透過周邊可見部分虹膜，角膜炎癥和潰瘍評分與NS組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TSPRP組與PRP組相比，角膜透明性較好，新生血管少，角膜炎癥和潰瘍評分經(jīng)LSD-t 檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。角膜炎癥和潰瘍評分見表1和表2。

表1 角膜炎癥評分Tab.1 Corneal inflammation scores（n=5）±s

表1 角膜炎癥評分Tab.1 Corneal inflammation scores（n=5）±s

注：P＜0.05（F = 238.29）；GBM與NS組P＞0.05（t = 1.20）、PRP和TSPRP與NS組比較P＜0.05（t=14.35、22.73）、TSPRP與PRP組P＜0.05（t=8.37）

組別NS GBM PRP TSPR即刻4.0±0 4.0±0 4.0±0 4.0±0 3 d 4.0±0 3.9±0.4 3.8±0.5 3.7±0.8 5 d 3.8±0.4 3.7±0.8 3.0±0.5 2.8±0.6 7 d 3.5±0.5 3.5±0.4 2.7±0.6 2.2±0.8 10 d 3.0±0.4 2.9±0.6 2.0±0.5 1.3±0.3 14 d 2.6±0.5 2.5±0.8 1.4±0.4 0.7±0.5

表2 角膜潰瘍評分Tab.2 Corneal ulcer scores（n=5） ±s

表2 角膜潰瘍評分Tab.2 Corneal ulcer scores（n=5） ±s

注：P＜0.05（F = 137.60）；GBM與NS組無P＞0.05（t = 1.00）、PRP和TSPRP與NS組比較P＜0.05（t = 13.00、18.00）、TSPRP與PRP組P＜0.05（t=5.00）

組別NS GBM PRP TSPRP即刻4.0±0 4.0±0 4.0±0 4.0±0 3 d 4.0±0 4.0±0 3.5±0.8 3.5±0.2 5 d 3.8±0.3 3.7±0.8 2.7±0.5 2.4±0.4 7 d 3.1±0.5 3.0±0.6 2.0±0.6 1.7±0.4 10 d 2.8±0.6 2.7±0.8 1.7±0.4 1.2±0.6 14 d 2.5±0.3 2.4±0.6 1.2±0.5 0.7±0.4

表3 微血管數(shù)和微血管面密度Tab.3 Microvascular number and surface density（n=5）±s

表3 微血管數(shù)和微血管面密度Tab.3 Microvascular number and surface density（n=5）±s

注：NS與GBM組P＞0.05（ta = 1.20，tb = 0.38）、PRP和TSPRP與NS組 比 較P＜0.05（ta = 6.32和7.85，tb = 3.92和6.01）、PRP與TSPRP組P＜0.05（ta=2.31，tb=3.10）

組別NS GBM PRP TSPRP微血管數(shù)（個/mm2）a 21.00±2.64 21.12±1.86 15.50±0.85 13.21±0.25微血管面密度b 0.081 2±0.000 4 0.077 4±0.000 3 0.042 0±0.000 1 0.011 0±0.000 2

圖1 免疫組織化學(xué)染色（×400）Fig.1 Immunohistochemical staining（×400）

3 討論

正常角膜在多種因素共同作用下處于穩(wěn)定的“血管赦免”狀態(tài)而保持角膜的透明性，這也是角膜發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)。然而各種疾病的損傷破壞，會造成這種平衡狀態(tài)被打破，從而促進新生血管的形成。角膜中含有多種血管生成因子，能夠促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，增加血管的通透性，促使新生血管的生成，而且大多數(shù)抗血管生成因子，例如血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮抑素、凝血細(xì)胞反應(yīng)素和血管抑素等在角膜上皮高表達[14]。因此，眼表的損傷性修復(fù)被認(rèn)為是損傷愈合的關(guān)鍵，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子[15-17]和小牛血清去蛋白眼用凝膠[18]等是目前臨床上常用的眼表損傷修復(fù)藥物，這些外源性的生物制劑存在免疫排斥反應(yīng)從而使角膜損傷性修復(fù)效果不是很滿意，造成角膜新生血管，所以尋找一種新的可行的角膜損傷修復(fù)藥物就成為研究的重點。

PRP 因富含有各種組織細(xì)胞修復(fù)所需的大量生長因子和細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子等[19-20]，對組織的再生和修復(fù)有很好的促進作用，可減少角膜新生血管的生成。RONCL 等[21]和PANDA 等[22]通過研究，發(fā)現(xiàn)PRP 能夠促進角膜上皮缺損的再愈合，縮短修復(fù)時間，降低感染率和角膜新生血管發(fā)生率，促進視力的恢復(fù)。本研究將PRP 滴于角膜堿燒傷動物模型眼表，治療14 d 后，角膜上皮修復(fù)完整，周邊角膜清亮，透過角膜可見部分虹膜，治療效果與SHABAN 等[13]報道相似。但是本實驗中發(fā)現(xiàn)PRP 滴于眼表難以通過角膜和血房水屏障，再加上淚液對藥物的稀釋和沖洗、淚道的引流等，從而降低了它在眼部的生物利用度。

為了解決這個問題，筆者利用溫敏劑泊洛沙姆和PRP 制成TSPRP。通過對照實驗，觀察角膜炎癥和潰瘍的變化，采用免疫組織化學(xué)染色對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞進行計數(shù)和測定微血管面密度。治療14 d 后發(fā)現(xiàn)TSPRP組在角膜炎癥控制、角膜上皮修復(fù)，以及微血管數(shù)和微血管密度上都明顯好于PRP組，兩者比較存在差異。分析原因可能是由于這種凝膠在常溫下成液態(tài)，滴于眼表后形成凝膠狀態(tài)，能將其攜帶的藥物束縛于分子間隙中，使其具有很好的親水性，控制藥物的釋放，延長藥物與給藥部位的接觸時間，提高藥物的眼部生物利用度。本研究結(jié)果提示在未來的眼科藥物中可以采用溫敏型制劑等新型給藥系統(tǒng)，以提高藥物的眼部生物利用度，減少局部給藥次數(shù)和給藥劑量，方便患者給藥，降低藥物的不良反應(yīng)。

本實驗在觀察微血管數(shù)和微血管密度時采用抗CD34染色，主要是由于目前除了較為常用的抗體CD31、CD34、Ⅷ因子等，顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗體種類繁多[23]。CD34 不僅能顯示微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在正常血管特別是大血管中也能表達，所以抗CD34染色能夠理想地顯示新生的、微小的、不成熟的血管，以及原先存在的大血管[24]；另外CD34也是內(nèi)皮細(xì)胞分化的高度敏感性標(biāo)志物，因此抗CD34 對新生內(nèi)皮細(xì)胞染色具有背景染色清晰、對比度高、輪廓明顯、染色較正常內(nèi)皮細(xì)胞更深等優(yōu)點，所以它是重復(fù)性最理想的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物[25]。因此本研究選用CD34抗體進行免疫組織化學(xué)染色。

綜上，溫度敏感型給藥系統(tǒng)由于生物利用度高，相對毒副作用少，已成為藥劑學(xué)和臨床研究中的熱點，在眼科用藥中也體現(xiàn)了它的優(yōu)勢。但是溫度敏感型給藥系統(tǒng)在眼科中的應(yīng)用還面臨很多實質(zhì)性的問題，影響藥物分布和釋藥的因素很多，包括藥物本身的理化參數(shù)、載體的種類、制備的工藝等，諸多因素尚在探索中。