炎癥小體Nlrp3通路激活在尿毒癥心肌病模型小鼠左心室重構(gòu)的作用

文儷樺 傅強 嚴全能 李晚泉 賀不凡 Gael Akindavyi 李志樑

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科（廣州510280）；2南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院心內(nèi)科（廣東深圳518101）；3佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院（廣東佛山3528100）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者終末期的最主要死亡原因是心血管疾病，而尿毒癥心肌病是其中重要的組成部分，是晚期CKD患者較為常見的一種并發(fā)癥，有研究表明3期以上的CKD患者普遍伴發(fā)心肌疾病，尿毒癥期甚至高達75%[1-2]。尿毒癥心肌病特征是左心室肥大、舒張功能障礙和心肌張力受損，可導(dǎo)致充血性心力衰竭、心肌缺血、心律失常，甚至猝死，從而大幅增加CKD患者的心血管病死率[3]。

左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）是尿毒癥心肌病最主要的特征型病理改變，已有研究指出LVH的主要機制與慢性腎衰導(dǎo)致高血壓和容量負荷增加有關(guān)，但在臨床工作中有效的血壓和容量負荷控制仍不能完全阻止尿毒癥心肌病的持續(xù)進展[1]。近年許多研究者把目光放在尿毒癥患者的內(nèi)環(huán)境改變和心血管并發(fā)癥之間的關(guān)系上。由于腎功能減退可造成尿毒癥患者體內(nèi)大量毒素蓄積，其中許多毒素，如硫酸吲哚酚（IS）、對甲酚硫酸鹽等蛋白結(jié)合毒素，而且常規(guī)透析不能將它們有效消除。臨床研究已證實IS與尿毒癥時心血管疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系[4]。

IS 可以刺激細胞炎癥反應(yīng)，生成大量炎癥因子，存在于血循環(huán)中，對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重危害[5-6]。炎癥是宿主對體內(nèi)病原體產(chǎn)生的防御反應(yīng)，而腎臟發(fā)炎不僅對病原體反應(yīng)，還對一些無菌刺激，如缺血、高糖環(huán)境的反應(yīng)[7-8]。細胞質(zhì)核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體蛋白3（Nlrp3）與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和caspase-1的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白形成炎性小體，隨后激活caspase-1，最終激活I(lǐng)L-1β和IL-18，并誘導(dǎo)免疫細胞中的磷酸化[9-11]。Nlrp3 炎性小體與多種腎臟疾病有關(guān)，包括急性腎臟損傷（AKI）和CKD[12]。腎臟病中Nlrp3 激活加劇了炎癥和纖維化，免疫細胞或與腎非免疫細胞作用可通過Nlrp3 炎性小體的炎癥反應(yīng)來介導(dǎo)腎臟疾病的進展[13]。目前大多研究表明Nlrp3 炎性小體的激活可通過NF-κB 途徑被其他毒素和炎癥因子快速激活[4，14]。尿毒癥心肌病的作用機制較復(fù)雜，而尿毒癥毒素IS和Nlrp3 炎性小體是否參與尿毒癥心肌病的LVH 形成并起重要作用尚未明確，本實驗通過建立尿毒癥心肌病小鼠模型探討IS 誘導(dǎo)LVH的作用以及驗證其與Nlrp3 炎性小體有關(guān)的相關(guān)作用機制，以期能為尿毒癥心肌病提供新的治療思路和治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件2019年3-9月選取8周齡SPF級的C57BL/6J 小鼠20只，體質(zhì)量（20±2）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號SCXK（粵）2011-0015]。飼養(yǎng)條件為恒溫環(huán)境（20±2）℃及相對濕度控制在（50±5）%，24 h 自由攝入鼠糧及水，每日人工照明各12 h，晝夜循環(huán)。

1.1.2 實驗試劑及儀器全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技，型號Chemray 240），倒置相差顯微鏡（Leica，Germany），酶標儀（Thermo，型號Varioskan LUX），心臟超聲儀（Vevo 2100 Imaging System），微量離心機（Thermo，型號LEGEND Micro21R），冷光源動物手術(shù)燈（瑞沃德生命科技，型號76301），倒置顯微鏡（Leica，型號DMI1）。

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）購于廣州吉妮歐生物科技有限公司，戊巴比妥鈉購于Sigma公司，肌酐測定試劑盒購于Pythonbio公司，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購于Thermo公司，BNP、1β抗體購于萬類公司，Nlrp3、ANP、Pro-caspase1 購于abcam公司，P65 購于博奧森公司，Phospho-P65 購于CST公司，HE 染液購于索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組采用隨機數(shù)字表法將小鼠分成假手術(shù)組（10只）、模型組（10只）。假手術(shù)組將與模型組一同進行腹腔手術(shù)，但不對腎臟進行切除。模型組制備的是5/6 腎切尿毒癥心肌病小鼠模型。造模8周時，將對所有小鼠進行超聲心動圖檢測各組小鼠心臟收縮及舒張功能，然后處死（采用斷頸術(shù)），分別收集各小鼠的血液及心臟標本。

1.2.2 5/6腎切尿毒癥心肌病小鼠模型的制備使用腹腔注射10%戊巴比妥鈉（150 μL）對小鼠進行麻醉。將麻醉后的小鼠采用俯臥位固定于手術(shù)臺上，小鼠背部的手術(shù)區(qū)域首先使用剃毛器剃除背部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚用0.5% 洗必泰溶液消毒。采用背部左側(cè)切口剪開皮膚開腹暴露左腎，然后分離腎上腺及腎周脂肪，將左腎游離。直接用眼科剪避開腎門處剪除上下兩級（約各占腎臟體積1/3）后，同時使用明膠海綿壓迫切口處止血2～3 min，直至不出血或極少量出血時將殘腎復(fù)位至腎窩，并將原位的臟器及腹膜覆蓋其上方，使用逐層間斷縫合腹膜和皮膚，縫合結(jié)束后酒精消毒手術(shù)區(qū)域傷口皮膚。1 周后，以相同的方法暴露及游離右側(cè)腎臟，在腎門處結(jié)扎右腎動靜脈及輸尿管后，切除右腎。假手術(shù)組則只對小鼠進行開腹處理，而不做腎切。以上手術(shù)操作均嚴格遵循無菌操作原則并在無菌條件下進行[15]。

1.2.3 心臟彩超檢測在腎切后8周，小鼠吸入異氟烷氣體進行麻醉，采用超聲心動圖（Vevo 2100 Imaging System）對其進行檢查，記錄檢測的項目包括左心室內(nèi)徑（LVESD、LVEDD）、左心室前后壁厚度（LVAWD、LVAWS、LVAWD、LVAWS）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室射血分數(shù)（EF）、心輸出量（CO）、左心室等容舒張時間（IVRT）、E/A、心肌活動指數(shù)（MPI）、LVFS/MPI，其中MPI和LVFS/MPI可反映心肌受損的程度[16]。

1.2.4 生化指標檢測造模8周后，處死，收集血液標本，放入肝素化1.5 mL EP 管中充分混勻，離心（4℃，8 000 r/min，6 min），取上清液后于-80℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平。采用高效液相色譜法檢測血漿IS水平，上述操作步驟均嚴格按照儀器及試劑盒說明書具體操作步驟和注意事項進行，用酶標儀測出吸光度，再按照各說明書上對應(yīng)的計算公式將樣本吸光度換算成濃度。

1.2.5 心臟HE染色造模8周后，將小鼠處死，收集心臟及血液標本后，從兩組中各隨機挑選5個心臟標本，用4%多聚甲醛固定24 h 后，脫水、石蠟包埋、切片，然后按標準操作步驟進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察兩組小鼠心肌細胞的核排列及大小情況。

1.2.6 Western blot從兩組小鼠中各隨機挑選5個心臟標本，分別采集心肌組織50 μg，加入306 μL RIPA 裂解液（300 μL RIPA+3 μL 磷酸酶抑制劑+3 μL 蛋白酶抑制劑），超聲破碎，12 000×g，4℃離心15 min，使用BCA 試劑盒測定總蛋白濃度。根據(jù)所測的蛋白濃度，加入RIPA、lodding buffer 將蛋白稀釋至5 mg/L。每例標本取總蛋白30 μg，進行SDS-PAGE 電泳（80 V 30 min，110 V 80 min），隨后以恒壓100 V 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉液（1×TBS，5% 脫脂奶粉）室溫封閉2 h，分別孵育一抗（anti-ANP、anti-BNP、anti-Nlrp3、anti-Pro-caspase1、anti-1β、anti-P65、anti-Phospho-P65），4℃振搖過夜。第2 天洗膜（每次10 min，共3次），室溫孵育二抗（1∶8 000）2 h，洗膜（每次10 min，共3次），加ECL 發(fā)光劑曝光，并記錄結(jié)果。蛋白相對表達量經(jīng)內(nèi)參GAPDH 校正后使用Image J 軟件分析條帶。

1.2.7 細胞培養(yǎng)復(fù)蘇RAW264.7 細胞并轉(zhuǎn)移到100 mm的細胞培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿一皿后傳代接種至60 mm的培養(yǎng)皿中，分為對照組和IS組。24 h 細胞貼壁后，更換含1%胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓8～10 h，IS組給予IS（15 μmol/dL）刺激3 h，提取各組細胞蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差的形式表示，兩組間若呈正態(tài)分布，使用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿IS水平與尿毒癥心肌病小鼠心室肥厚的關(guān)系

2.1.1 尿毒癥心肌病小鼠模型建立和血漿IS水平在對小鼠進行5/6腎切8周后，檢測兩組小鼠的血漿，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比Scr、BUN 明顯升高，且均升高2倍以上（P＜0.05），故構(gòu)建尿毒癥小鼠模型成功。此外，檢測兩組血漿IS水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血漿IS 較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠生化結(jié)果比較Tab.1 Comparison of biochemical outcomes in different groups±s

表1 各組大鼠生化結(jié)果比較Tab.1 Comparison of biochemical outcomes in different groups±s

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

指標Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）IS（mg/L）假手術(shù)組11.66±2.70 20.92±2.01 3.37±1.22模型組27.82±14.68**52.16±26.09*5.80±1.99**

2.1.2 心臟彩超收縮功能的比較超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，在長軸和短軸的M型超聲上，模型組較假手術(shù)組相比心腔有不同程度的縮小。兩組比較，LVAWd和LVPWd 均增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組小鼠的EF和短軸縮短率（FS）較假手術(shù)組顯著降低（P＜0.01）。而LVESd、LVEDd、LVAWs、LVPWs、CO 指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.1.3 心臟彩超舒張功能的比較心臟超聲心動圖結(jié)果示：左心室等容舒張時間（IVRT）、E/A、心肌活力指數(shù)（MPI）均較假手術(shù)組小鼠有所升高，但只有MPI 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組小鼠LVFS/MPI 均較假手術(shù)組顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2和圖1。

2.1.4 心臟組織HE染色、ANP、BNP蛋白表達情況HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的心肌細胞心肌纖維排列較為紊亂，高倍鏡下可觀察到心肌細胞肥大，橫紋粗糙，細胞核紊亂，見圖2。與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織ANP、BNP表達均明顯上調(diào)（P＜0.05），其中以ANP表達上調(diào)最為顯著。見圖3。

2.2 Nlrp3與尿毒癥心肌病小鼠心室肥厚的關(guān)系

2.2.1 心臟組織Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β、p-P65 蛋白表達情況與假手術(shù)組相比，模型組小鼠心臟組織Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β表達均顯著升高（P＜0.05），其中以Pro-caspase1、IL-1β上調(diào)幅度最為明顯（P＜0.01），超過2倍。進一步檢測了p-P65、P65 蛋白表達情況，結(jié)果顯示，模型組p-P65蛋白表達較假手術(shù)組明顯上升（P＜0.05），見圖3。

表2 假手術(shù)組和模型組小鼠心臟超聲左心室收縮功能和舒張功能結(jié)果比較Tab.2 Comparison of echocardiography ofleft ventricular systolic functionparametersat between model with sham group±s

表2 假手術(shù)組和模型組小鼠心臟超聲左心室收縮功能和舒張功能結(jié)果比較Tab.2 Comparison of echocardiography ofleft ventricular systolic functionparametersat between model with sham group±s

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

指標LVESd（mm）LVEDd（mm）LVAWs（mm）LVAWd（mm）LVPWs（mm）LVPWd（mm）CO（mL/min）EF（%）FS（%）IVRT（ms）MPI E/A LVFS/MPI假手術(shù)組2.29±0.69 4.14±1.00 1.33±0.18 0.83±0.02 1.28±0.18 0.69±0.10 22.07±5.34 77.55±9.36 46.58±9.22 8.91±2.09 0.28±0.02 1.46±1.18 182.25±55.53模型組2.87±0.62 4.33±0.64 1.47±0.31 1.02±0.20*1.23±0.12 0.79±0.03*27.08±8.98 62.99±9.11**34.17±6.33**12.61±3.09 0.41±0.08*1.35±0.24 108.50±45.18*

2.2.2 IS刺激巨噬細胞后Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β、p-P65蛋白表達情況在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IS組的巨噬細胞蛋白合成速率顯著上升，且Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β表達亦明顯上調(diào)（P＜0.05）。由此說明IS 可促使巨噬細胞分泌炎癥因子IL-1β和誘導(dǎo)Nlrp3、Pro-caspase1 蛋白表達。進一步實驗檢測發(fā)現(xiàn)，IS組巨噬細胞的p-P65表達均較對照組升高（P＜0.05），見圖4。

3 討論

圖1 假手術(shù)組和模型組小鼠心臟超聲圖像Fig.1 Echocardiographic presentation in differentgroups

在所有尿毒癥并發(fā)癥的死亡原因中，心血管因素約占半數(shù)，而且其死亡率是正常人群的30倍[17]。尿毒癥心肌病指由富含大量心臟有害物質(zhì)的尿毒癥內(nèi)環(huán)境引起心肌細胞發(fā)生明顯的病理改變[18]。其主要的特點為心肌細胞增生肥大，心肌間質(zhì)纖維化和心室重構(gòu)，最終將導(dǎo)致心室肥厚，舒張、收縮功能受損。其中左心室肥厚是透析患者最常見的心臟改變，而且是尿毒癥心肌病的主要特點。尿毒癥性心肌病的病理生理機制尚不清楚。目前廣泛被認同可能存在的機制有因水鈉潴留、貧血、動靜脈內(nèi)瘺造成心臟負荷增加，從而導(dǎo)致心室肥厚等一系列病理改變[18]。

本研究通過5/6 腎切構(gòu)建尿毒癥心肌病的小鼠模型，并且伴隨小鼠腎功能的異常，心肌肥厚和舒張功能減退也隨之出現(xiàn)，并且發(fā)生了收縮功能和舒張功能受損，符合尿毒癥心肌病的病理生理改變。YANG 等[19]發(fā)現(xiàn)通過給小鼠腹腔注射IS后，其血漿IS水平升高，心室明顯發(fā)生肥厚，心肌組織肥大相關(guān)蛋白ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達也顯著上調(diào)。本研究中也獲得和上述研究類似的結(jié)果，模型組小鼠心肌組織ANP、BNP 蛋白表達較假手術(shù)組顯著表達上調(diào)。然而在本研究中，模型組小鼠的射血分數(shù)較假手術(shù)組明顯下降，考慮可能與大多模型組小鼠已進入了心力衰竭失代償期有關(guān)。同時模型組小鼠的舒張功能較假手術(shù)組E/A 上升，這是由于模型組有幾只小鼠E/A 比值已超過2，也提示其已進入心衰失代償期。

圖2 假術(shù)組與模型組小鼠心臟HE染色（a.×50倍，b.×200倍）Fig.2 HE staining of mouse heart between sham group and model group（a.×50，b.×200）

IS 作為CKD患者體內(nèi)主要的內(nèi)毒素，對心臟有直接毒性作用[20]。有研究者發(fā)現(xiàn)使用IS 培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞后，IS與心肌細胞相關(guān)肥大蛋白的表達呈劑量濃度依賴性相關(guān)。而且IS是CKD患者發(fā)生LVH的重要危險因素，腎功能越差的患者體內(nèi)IS水平越高[23]。本研究對尿毒癥心肌病小鼠檢測血漿IS水平，結(jié)果與上述實驗結(jié)果相似，即模型小鼠血漿IS水平較假手術(shù)組明顯升高。所以，降低CKD患者，尤其是終末期腎功能不全患者的IS水平可能成為臨床上預(yù)防及治療尿毒癥心肌病的一個重要突破口。

圖3 假手術(shù)組和模型組小鼠心臟組織蛋白表達情況Fig.3 Myocardial protein expressionst between sham group and model group

圖4 巨噬細胞蛋白表達情況Fig.4 Protein expression in control group and control＋IS group of macrophage

現(xiàn)在越來越多研究不僅證實了IS 對心臟的直接毒性作用[18-19]，還發(fā)現(xiàn)它可以刺激機體緩慢釋放各種炎癥因子，使得機體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生輕微炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種免疫性炎癥的相關(guān)并發(fā)癥[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6和IL-1β 能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族（NF-κB）活化，進而促使心肌肥厚和膠原合成，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭[21]。本研究對心臟組織進行Western blot 驗證，結(jié)果顯示尿毒癥心肌病小鼠Nlrp3 炎性小體表達較假手術(shù)組明顯上調(diào)，同時其下游的炎癥因子IL-1β表達增多。本研究還發(fā)現(xiàn)在模型組小鼠中Nlrp3 炎性小體上游的NF-κB 信號通路明顯激活，提示尿毒癥心肌病小鼠心室肥厚可能與Nlrp3 介導(dǎo)的炎癥通路相關(guān)。為進一步證實尿毒素IS在其中起到改變尿毒癥小鼠體內(nèi)微環(huán)境而促進Nlrp3 炎性小體表達的重要作用，本研究通過體外實驗用IS 誘導(dǎo)巨噬細胞后，Nlrp3 炎性小體及其下游的炎癥因子IL-1β表達上調(diào)。

本研究利用小鼠制備了尿毒癥心肌病模型，模擬其內(nèi)環(huán)境，進一步證實了尿毒癥時循環(huán)中高水平的IS可通過激活炎性小體Nlrp3誘導(dǎo)心室肥厚的發(fā)生，其機制與上調(diào)其表達和促進和激活下游信號通路相關(guān)。本研究的不足之處在于沒有進一步通過基因敲除和過表達的方法進一步證實Nlrp3炎性小體對尿毒癥心肌病的病理生理機制及相關(guān)通路的激活，有待在后續(xù)研究中進一步完善和改進。

通過本實驗研究，不僅發(fā)現(xiàn)了尿毒癥毒素IS在尿毒癥心肌病中加重心室肥厚的重要作用，并進一步深入揭示了IS 可誘導(dǎo)Nlrp3 炎性小體表達上調(diào)，加重其對尿毒癥心肌病患者相關(guān)的臟器損害。從心、腎內(nèi)在關(guān)聯(lián)的角度探討了尿毒癥心肌病潛在的病理生理機制和可能的防治措施。