斑石鯛TGF-β1基因克隆和表達(dá)分析*

王 杉 徐文騰 李 明 王 潔 王 磊 翟介明 陳松林

斑石鯛基因克隆和表達(dá)分析*

王 杉1,2徐文騰1李 明1,2王 潔1,2王 磊1翟介明3陳松林1①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 3. 萊州市明波水產(chǎn)有限公司 煙臺(tái) 261400)

虹彩病毒是造成斑石鯛()工廠化養(yǎng)殖中大規(guī)模死亡的主要病原，其感染力極強(qiáng)，感染后的斑石鯛死亡率高，嚴(yán)重影響了斑石鯛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長因子是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為研究在斑石鯛被虹彩病毒感染過程中發(fā)揮的作用，運(yùn)用RACE和實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR技術(shù)對(duì)進(jìn)行了基因克隆，并對(duì)其進(jìn)行在不同組織、不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量的差異分析。結(jié)果顯示，斑石鯛基因cDNA序列全長為3157 bp，5￠非編碼區(qū)長712 bp，3￠非編碼區(qū)長1278 bp，開放性閱讀框長1167 bp，編碼388個(gè)氨基酸，基因組包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。同源分析發(fā)現(xiàn)，和魚類相似度較高，與半滑舌鰨()的同源性最高，為76.67%。在斑石鯛健康組織(肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、心臟、鰓、胃、腸和皮膚)中均有表達(dá)，在頭腎、腸、肝臟和皮膚組織中表達(dá)量較高，而在脾臟和腎臟組織表達(dá)量較低。為進(jìn)一步研究在病毒感染過程中相對(duì)表達(dá)量的變化，對(duì)健康斑石鯛注射虹彩病毒進(jìn)行刺激，隨后比較了在脾臟、肝臟、腎臟、頭腎4個(gè)不同組織、不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量的差異，在頭腎、脾臟和肝臟中，病毒刺激后的表達(dá)量均出現(xiàn)升高，但在脾臟和肝臟中，峰值出現(xiàn)在刺激后第4天，而在頭腎中峰值出現(xiàn)在感染后的第10天。在腎臟中，病毒刺激后的的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，0 d表達(dá)量最高，4、7 d依次降低，7 d降至最低，10 d有所恢復(fù)。以上研究表明，可能響應(yīng)了虹彩病毒對(duì)機(jī)體的刺激，可能在對(duì)病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。而病毒感染后不同組織中相對(duì)表達(dá)量的差異，則值得進(jìn)一步研究。

斑石鯛；虹彩病毒；

斑石鯛()屬于鱸形目、石鯛科、石鯛屬，主要分布在太平洋東北部，朝鮮、日本、中國等地沿海地區(qū)。因其營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，成為一種新興的工廠化養(yǎng)殖魚類。但在斑石鯛大規(guī)模養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，嚴(yán)重影響斑石鯛的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，研究病毒感染與免疫的分子機(jī)制，對(duì)于斑石鯛病害防控具有重要意義。

通過對(duì)某養(yǎng)殖場患病或死亡斑石鯛的PCR檢測，可以擴(kuò)增出明亮的虹彩病毒特有的條帶。因此，認(rèn)為這些斑石鯛攜帶虹彩病毒，并推測虹彩病毒可能與斑石鯛的死亡有關(guān)。虹彩病毒科包括5個(gè)屬：細(xì)胞腫大病毒屬、蛙病毒屬、淋巴腫大病毒屬、虹彩病毒屬和綠虹彩病毒屬等。其中，感染魚類的主要是細(xì)胞腫大病毒屬中的真鯛虹彩病毒(RSIV)和脾腎壞死病毒(ISKNV)，它們可以感染多種海洋魚類，感染后死亡率極高(Nakajima, 1998; He, 2001)。虹彩病毒是一種大型二十面體病毒，具有線性雙鏈DNA基因組(Goorha, 1984)。在一些亞洲國家，細(xì)胞腫大病毒導(dǎo)致多種海洋物種在高水溫下死亡(Inoue, 1992; Nakajima, 1994; Chua, 1994; Matsuoke, 1996; Miyata, 2010; Chou, 1998)。在韓國，1998年首次在南部沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)條石鯛虹彩病毒感染(Jung, 2000)。疾病的最初癥狀是進(jìn)食量減少，嗜睡，身體顏色異常，鰓有淤點(diǎn)，以及脾臟、鰓和消化道的病變。在疾病的末期，患病魚在籠子邊緣無規(guī)律游動(dòng)(Inoue, 1992; Jung, 2000; Gibson-Kueh, 2003; He, 2000; Miyata, 1997)。受虹彩病毒感染的魚的特征是脾臟增大，脾臟、鰓、腎、心臟和肝臟中存在嗜堿性細(xì)胞增大的現(xiàn)象，并導(dǎo)致腎和脾造血組織壞死(Nakajima, 1998; Oshima, 1998; Qin, 2002; Jung, 2000)。虹彩病毒對(duì)斑石鯛養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，因此，亟需從分子機(jī)制角度對(duì)斑石鯛虹彩病毒病進(jìn)行防治。

TGF-β是調(diào)節(jié)復(fù)雜免疫反應(yīng)的主要分子開關(guān)，在免疫過程中起促進(jìn)和抑制的雙重調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(TGF-βS)屬于多功能生長因子的超家族，主要包括5個(gè)成員(TGF-β 1~5) (Roberts, 1990; Kehrl, 1986)。體內(nèi)絕大部分組織和細(xì)胞都能產(chǎn)生TGF-β及其受體(Le, 2005)，在成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板中表達(dá)量較高(Takehara, 2000; Thompson, 1989)，其廣泛參與體內(nèi)各種生理生化功能的調(diào)節(jié)，包括哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育，兩棲動(dòng)物、昆蟲的骨骼發(fā)育，傷口愈合、免疫以及成人的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和生長(Senturk, 2010)，并能調(diào)節(jié)包括干擾素γ和腫瘤壞死因子α在內(nèi)的其他生長因子的表達(dá)和激活，其中，含量最高且功能最為廣泛。

目前，在魚類中的研究主要集中在基因克隆和對(duì)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)方面，先后在虹鱒() (Daniels, 1999)、斑馬魚() (Kohli, 2003)、海鯛() (Tafalla, 2003)、草魚() (Yang, 2008)中克隆得到；在魚類免疫細(xì)胞中的研究表明，通過用LPS刺激草魚體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制了炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tnfa)、白細(xì)胞介素(il1b)、肌苷(inos)和白細(xì)胞介素(il8) mRNA水平的表達(dá)(Wei, 2015)。金魚(L)抑制TNF-α激活的巨噬細(xì)胞中的一氧化氮的生成(Haddad, 2008)，從而抑制巨噬細(xì)胞的活化。草魚顯著降低草魚頭部腎白細(xì)胞(hkls)的活性(Yang, 2012)。這些研究表明，主要通過抑制促炎性因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎癥作用，因?yàn)檫^度炎癥可能導(dǎo)致組織損傷和廣泛的慢性疾病，在哺乳動(dòng)物中造成如關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘等(Foster, 2009)。已被證明能夠抑制toll樣受體下游的炎癥信號(hào)，在炎癥的消退中起關(guān)鍵作用(Han, 2005; Serhan, 2005; Yoshimura, 2010)。然而，在某些研究中呈現(xiàn)出截然相反的作用，如草魚體內(nèi)下調(diào)LPS/PHA刺激造成的外周血淋巴細(xì)胞增殖，而在同一細(xì)胞中的刺激作用則出現(xiàn)與之相反的情況(Yang, 2010)。在哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮雙重作用。如在癌細(xì)胞發(fā)展初期起到抑制作用，而在癌細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散過程中起促進(jìn)作用。這些研究不僅可以將看作是硬骨魚類的免疫調(diào)節(jié)因子，還表明在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中保持基本相近的免疫功能。然而，有關(guān)魚類參與炎癥調(diào)節(jié)的機(jī)制仍然缺乏研究。實(shí)際上，到底是什么機(jī)制介導(dǎo)其對(duì)免疫應(yīng)答的抑制作用，仍然沒有詳細(xì)的闡釋。

本文主要研究了基因在斑石鯛健康組織中的相對(duì)表達(dá)量以及斑石鯛感染虹彩病毒后該基因在4種不同免疫組織中相對(duì)表達(dá)量的差異，希望能為進(jìn)一步深入了解基因在斑石鯛免疫調(diào)節(jié)中起的作用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正常組織：健康、體重為(300±10) g的斑石鯛由萊州明波水產(chǎn)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前，在水箱中暫養(yǎng)3 d (24℃~26℃)。麻醉后，取3條魚進(jìn)行解剖，取肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、心臟、鰓、胃、腸和皮膚組織，立即放入液氮保存，隨后將樣品轉(zhuǎn)移到-80℃保存，用于后續(xù)的RNA提取。

斑石鯛虹彩病毒感染及樣品采集：健康、體重為(150±10) g的斑石鯛，由萊州明波水產(chǎn)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)3 d (24℃~26℃)。麻醉后，腹腔注射斑石鯛虹彩病毒液(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)秦啟偉教授提供)，每尾100 μl (109拷貝數(shù))。虹彩病毒感染后，在0、4、7、10 d時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3條魚，每條魚取肝臟、脾臟、腎臟和頭腎4個(gè)組織。取完的組織立即放入液氮中，隨后放入-80℃冰箱中冷凍保存，以待后續(xù)的DNA和RNA提取。

1.2 RNA提取和cDNA的合成

本實(shí)驗(yàn)使用Trizol法對(duì)樣品的RNA進(jìn)行提取，包括所有健康組織和所有感染后的樣品。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行檢測，使用Gene Quant Pro RNA/DNA分光光度計(jì)測定提取的RNA的濃度。將鑒定合格的RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的質(zhì)量。使用RACE試劑盒(TaKaRa)，按照說明合成RACE-Ready-cDNA，作為擴(kuò)增5￠和3￠非翻譯區(qū)(Untranslated Region, UTR)的模板。

1.3 TGF-β1基因全長cDNA與基因組序列的克隆

1.3.1 中間片段的驗(yàn)證 根據(jù)斑石鯛轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，獲得基因的部分cDNA序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(TGF-β1-F/TGF-β1-R) (表1)，分別將

9個(gè)不同組織(肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、心臟、鰓、胃、腸和皮膚)的cDNA模板進(jìn)行混合，使用混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？傮w系為15 μl: Mix (TaKaRa) 7.5 μl，TGF-β1-F 1 μl，TGF-β1-R 1 μl，ddH2O 4.5 μl，模板cDNA 1 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物與目的片段大小一致，將目的片段切下，使用膠回收試劑盒(諾唯贊, 南京)對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體(全式金, 北京)，轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金, 北京)中，加入無抗LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1 h，涂板，37℃過夜培養(yǎng)(12~16 h)，挑取6個(gè)克隆送到北京睿博興科生物技術(shù)有限公司(青島區(qū))測序。

1.3.2 5￠和3￠RACE克隆 根據(jù)已經(jīng)驗(yàn)證正確的部分cDNA序列，分別在序列兩端設(shè)計(jì)5￠(TGF-β1-5￠- GSP/TGF-β1-5￠-NGSP)和3￠(TGF-β1-3￠-GSP/ TGF-β1-3￠-NGSP) RACE引物(表1)。使用巢氏PCR擴(kuò)增5￠/3￠UTR。第一輪反應(yīng)體系為10 μl，使用TaKaRa LATMHot Start Version試劑盒，按照使用說明的比例加樣混合，進(jìn)行Touchdown PCR程序反應(yīng)。將第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋20倍作為模板，隨后進(jìn)行第二輪普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為50 μl，同上按照比例加樣混合后進(jìn)行第二輪普通PCR反應(yīng)。將得到的PCR產(chǎn)物根據(jù)1.3.1中間片段驗(yàn)證的方法進(jìn)行測序(Wang, 2019)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物

Tab.1 Primers used in this study

1.3.3 基因組序列的克隆 提取3條斑石鯛的脾臟組織的DNA，以此為模板，驗(yàn)證的基因組。方法與1.3.1中間片段的驗(yàn)證類似，引物(TGF-β1-GM- F1/TGF-β1-GM-R1, TGF-β1-GM-F2/TGF-β1-GM-R2, TGF-β1-GM-F3/TGF-β1-GM-R3, TGF-β1-GM-F4/TGF- β1-GM-R4和TGF-β1-GM-F5/TGF-β1-GM-R5)退火溫度改設(shè)為55℃，延伸時(shí)間設(shè)為5 min。

1.4 生物學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用NCBI對(duì)克隆得到的基因的全長cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測其開放閱讀框(ORF)和氨基酸序列，并推導(dǎo)出其蛋白的分子量和等電點(diǎn)(圖1)。使用網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)翻譯的氨基酸序列進(jìn)行分析，包括信號(hào)肽，氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域。

在NCBI中搜索基因放入同源氨基酸序列并預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域。使用DNAMAN軟件對(duì)TGF-β1進(jìn)行氨基酸多重比對(duì)，通過MEGA 7.0軟件完成其生物系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.5 TGF-β1基因的相對(duì)表達(dá)量檢測

通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測健康的斑石鯛不同組織中基因的相對(duì)表達(dá)量；經(jīng)虹彩病毒感染刺激后4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)、4個(gè)不同組織(肝、腎、脾和頭腎)的相對(duì)表達(dá)量的變化。根據(jù)得到的ORF序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(TGF-β1- qRT-F/TGF-β1-qRT-R, 表1)，再以基因(-F/-R, 表1)作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，按照TaKaRa SYBR?Premix ExTM說明書介紹的方法進(jìn)行基因的定量分析。根據(jù)測得的值(取3個(gè)平行樣品的平均值)，利用2-ΔΔC法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，設(shè)定<0.05為差異顯著。使用Origin Pro 8軟件將定量結(jié)果作圖(Wang, 2018)。

推導(dǎo)的氨基酸序列顯示在核苷酸序列下方，用大寫字母表示。方框所示為起始密碼子(ATG)、星號(hào)(*)所示為終止密碼子(TGA)；下劃線(—)所示為TGF-β家族結(jié)構(gòu)域；藍(lán)色下劃線(—)所示為終止信號(hào)；黃色下劃線(—)所示為polyA結(jié)構(gòu)

The deduced amino acid sequence is shown below the nucleotide sequence and expressed in capital letters. The starting codon (ATG), asterisk (*) and termination codon (TGA) are shown in the box, the underline (—) is shown in the TGF-beta family domain, the blue underline (—) is shown in the termination signal, and the Yellow underline (—) is shown in the polyA structure

2 結(jié)果與分析

2.1 斑石鯛TGF-β1基因序列特征

斑石鯛基因的cDNA全長為3157 bp，開放閱讀框長1167 bp，編碼388個(gè)氨基酸，5￠非編碼區(qū)長712 bp，3￠非編碼區(qū)長1278 bp，相對(duì)分子質(zhì)量為 44.32 kDa，預(yù)測等電點(diǎn)為8.178。對(duì)基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因沒有信號(hào)肽，也沒有跨膜區(qū)，含有1個(gè)TGF-β前導(dǎo)肽，為第19~260個(gè)氨基酸；含有1個(gè)TGF-β結(jié)構(gòu)域，為第291~388個(gè)氨基酸，長98個(gè)氨基酸。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和氨基酸多序列比對(duì)

將斑石鯛的基因?qū)?yīng)的氨基酸序列通過NCBI的Protein Blast比對(duì)，從NCBI上下載其他物種基因的氨基酸序列，鳥綱2種：雞() (XP_025000221.1)、大山雀() (XP_015471764.1)；哺乳綱2種：人() (NP_000651.3)、小鼠() (NP_035707.1)；爬行綱2種：多疣壁虎() (XP_ 015282748.1)、原矛頭蝮() (XP_015680068.1)；兩棲綱1種：熱帶爪蟾() (XP_002939433.1)；魚綱9種：青鳉() (XP_004075270.1)、墨西哥麗脂鯉() (XP_022531678.1)、斑點(diǎn)雀鱔() (XP_015196176.1)、虹鱒() (XP_021447007.1)、白斑狗魚() (XP_010868815.1)、半滑舌鰨() (XP_008307032.1)、歐洲鯉魚() (XP_018927916.1)、斑馬擬麗魚() (XP_004569626.1)，共計(jì)16種。多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，斑石鯛和其他魚類物種TGF-β1氨基酸序列相對(duì)保守，其中，特有的TGF-β結(jié)構(gòu)域更為保守(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，魚綱聚為一大支，青鳉(鳉形目青鳉科)、斑石鯛(鱸形目石鯛科)、半滑舌鰨(鰈形目舌鰨科)、斑馬擬麗魚(鱸形目慈鯛科)聚為一支；歐洲鯉(鯉形目鯉科)、虹鱒(鮭形目鮭科)、白斑狗魚(狗魚目狗魚科)、墨西哥麗脂鯉(脂鯉目脂鯉科)聚為一支。鳥綱的雞(雞形目雉科)和大山雀(雀形目山雀科)聚為一支；哺乳綱的小鼠(鼠目嚙齒科)和人(靈長目人科)聚為一支；爬行綱的多疣壁虎(有鱗目壁虎科)、原矛頭蝮(有鱗目蝰科)聚為一支；兩棲綱的熱帶爪蟾(無尾目負(fù)子蟾科)單獨(dú)聚為一支(圖3)。經(jīng)基因組分析發(fā)現(xiàn)，斑石鯛與半滑舌鰨的基因組都包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，白斑狗魚和人則含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子(圖4)。

圖2 斑石鯛與其他物種TGF-β1氨基酸序列多重比對(duì)

圖3 斑石鯛TGF-β1與其他物種TGF-β1系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 斑石鯛TGF-β1基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3.1基因在正常斑石鯛各組織中的相對(duì)表達(dá)量 qRT-PCR健康組織的表達(dá)結(jié)果顯示，基因在斑石鯛各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，在肝臟、頭腎、腸、皮膚、鰓中表達(dá)量較高，頭腎最高；在脾臟、腎臟、胃、腦中表達(dá)量較低，脾臟最低(圖5)。

2.3.2 斑石鯛虹彩病毒感染后基因的相對(duì)表達(dá)量的變化 在肝臟中呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在4 d時(shí)表達(dá)量最高，約是0 d的2.7倍；在頭腎中呈現(xiàn)波動(dòng)的趨勢，0~4 d升高，第4天是0 d的1.94倍，4~7 d降低，7~10 d再度升高，10 d時(shí)表達(dá)量最高，是0 d的2.5倍；脾臟與頭腎的趨勢類似，不過在4 d時(shí)表達(dá)量最高，是0 d的3.1倍；在腎臟中呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，0~7 d下降，7~10 d升高，其中，7 d時(shí)表達(dá)量最低，是0 d的0.38倍 (圖6)。

圖5 TGF-β1基因在健康斑石鯛組織中的相對(duì)表達(dá)量

a、 b和c表示在SPSS 19.0軟件中的Duncan分組。同一字母表示無顯著差異(>0.05)，不同字母表示顯著差異(<0.05)。下同 The letters of ‘a(chǎn), b and c’ indicated the Duncan grouping in SPSS 19.0 software. The same letters indicate no significant difference (>0.05), the different letters indicate significant difference (<0.05). The same applies below

3 討論

本研究通過PCR和RACE技術(shù)克隆得到了斑石鯛基因的cDNA全長序列，研究了斑石鯛在健康組織和響應(yīng)虹彩病毒刺激后相對(duì)表達(dá)量的變化。對(duì)基因的多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)參與比對(duì)的不同物種TGF-β1蛋白結(jié)構(gòu)比較相似，都包含1個(gè)前導(dǎo)肽(第19~260氨基酸)和 1個(gè)TGF-β結(jié)構(gòu)域(第291~388氨基酸)。但相對(duì)而言，不同魚類之間TGF-β序列更為相似，而在不同綱之間差異較大，例如，斑石鯛與人類TGF-β1氨基酸序列相似度為47.34%，與半滑舌鰨相似度為76.67%。TGF-β蛋白起初是以未激活的形式從細(xì)胞中分泌出來的，稱為休眠TGF-β或小休眠復(fù)合體。對(duì)克隆得到的基因的氨基酸序列分析證明其包含1個(gè)前導(dǎo)肽。TGF-β家族有9個(gè)半胱氨酸，這9個(gè)半胱胺酸中的8個(gè)會(huì)每2個(gè)為1組形成半胱氨酸結(jié)(Cysteine knot)，這個(gè)結(jié)構(gòu)是整個(gè)TGF-β超家族所共有的特征，第9個(gè)半胱氨酸會(huì)通過共價(jià)的二硫鍵與另外一個(gè)次單元的半胱氨酸形成二聚體。其他的TGF-β結(jié)構(gòu)主要以非共價(jià)的疏水性相互作用力(Hydrophobic interactions)形成其二級(jí)結(jié)構(gòu)。第5個(gè)與第6個(gè)半胱氨酸之間含有最多的氨基酸變異區(qū)域，而這段區(qū)域是使TGF-β分子暴露在外，使不同的TGF-β與不同受體分子相互識(shí)別并相互結(jié)合的區(qū)域(Daopin, 1992)。

魚類免疫主要以先天性免疫為主。大馬哈魚()抗體的產(chǎn)生需要4~6周時(shí)間，并且依賴溫度，然而病原體的侵襲在短短幾天內(nèi)就可以造成魚體死亡，因此，魚類抗病原體的免疫應(yīng)答中，先天性免疫在感染初期發(fā)揮主要作用，由腎臟、脾臟及粘膜相關(guān)淋巴組織(存在于鰓、消化道等富含粘膜層的組織中)執(zhí)行(Ellis, 2001)；另外，在許多物種的肝臟移植研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟也具有免疫調(diào)節(jié)功能(Qian, 1997)。對(duì)斑石鯛健康組織相對(duì)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，基因在斑石鯛各個(gè)組織中均有表達(dá)，并且具有組織特異性，其中，頭腎表達(dá)量最高，這與羅非魚()健康組織中的情況一致(Zhan, 2015)，在肝臟、腸、皮膚和鰓中表達(dá)量較高，可能是由于主要分布在細(xì)胞分化旺盛或與外界有直接接觸并且含有大量淋巴組織的外周免疫器官之中，這些組織含有大量的未被激活的，作為免疫應(yīng)答的啟動(dòng)因子儲(chǔ)存。在斑石鯛頭腎、脾臟和肝臟中相對(duì)表達(dá)量的變化則有可能與在免疫過程中發(fā)揮的雙重調(diào)節(jié)作用有關(guān)。其中，病毒感染后的第4天斑石鯛開始發(fā)病，頭腎、脾臟、肝臟中的上調(diào)可能代表是促進(jìn)免疫應(yīng)答的，一些研究表明，TGF-β可以在感染部位招募單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，觸發(fā)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)(如TNF-α、IL-γ等)，激活白細(xì)胞促進(jìn)其對(duì)感染細(xì)胞的吞噬和抗原的呈遞，放大炎癥反應(yīng)(Li, 2006; McGeachy, 2007; Wan, 2007)，這可以幫助機(jī)體對(duì)抗病毒的侵襲；隨后表達(dá)下降(第7天)，但在第10天，脾臟和頭腎再度上調(diào)可能是與其抑制或終止免疫應(yīng)答有關(guān)，有研究證明，TGF-β可以直接下調(diào)其他促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，參與炎癥的消退(Roberts, 1993)，可以避免機(jī)體過度炎癥反應(yīng)引起的損傷，TGF-β的雙重調(diào)節(jié)機(jī)制可能依賴于作用部位的體液環(huán)境，受調(diào)控細(xì)胞類型和自身濃度梯度影響。無乳鏈球菌()感染羅非魚的實(shí)驗(yàn)中，頭腎也表現(xiàn)出在0~4 d升高，隨后下降的趨勢，但其在10 d時(shí)并未再度升高，與本研究肝臟情況一致，VHSV (Viral haemorrhagic septicemia virus)感染虹鱒的實(shí)驗(yàn)中，在頭腎組織中也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，非致病性病毒株感染組在第3天達(dá)到峰值，致病性病毒株感染組在第5天達(dá)到峰值(Maehr, 2013)。至于病毒感染后腎臟中表達(dá)一直呈下調(diào)趨勢，這種變化則十分有趣。由于虹彩病毒主要感染部位是脾臟和腎臟，這可能是由于在感染后主要是頭腎而非整個(gè)腎臟發(fā)揮主要免疫作用而造成的。哈維氏弧菌()感染半滑舌鰨的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，感染后的72 h內(nèi)，半滑舌鰨肝臟、脾臟和腎臟中呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢，不同組織達(dá)到峰值的時(shí)間并不相同，肝臟48 h、脾臟24 h、腎臟12 h (李雪等, 2016)，而本研究中表達(dá)量在第4天時(shí)出現(xiàn)顯著升高(肝臟、脾臟和腎臟)，隨后回落，這可能是由于感染初期病毒處于潛伏期，機(jī)體免疫應(yīng)答處于持續(xù)增強(qiáng)階段，到第4天時(shí)達(dá)到較高水平，隨后，隨著機(jī)體免疫功能的自我調(diào)節(jié)，的表達(dá)水平逐漸回落。本研究發(fā)現(xiàn)，可能參與了斑石鯛對(duì)虹彩病毒的免疫應(yīng)答，并在其中發(fā)揮一定作用，希望能為深入研究基因在斑石鯛免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用提供借鑒。

4 結(jié)論

斑石鯛基因cDNA序列與半滑舌鰨基因序列最相似。健康斑石鯛中，基因主要在頭腎、肝和腸中表達(dá)；虹彩病毒感染后，基因表達(dá)量顯著上調(diào)，揭示了可能與斑石鯛抗虹彩病毒免疫應(yīng)答有關(guān)。

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Molecular Cloning and Expression Pattern Analysis ofin Spotted Knifejaw ()

WANG Shan1,2, XU Wenteng1, LI Ming1,2, WANG Jie1,2, WANG Lei1, ZHAI Jieming3, CHEN Songlin1①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 2. International Research Center for Marine Biosciences, Shanghai Ocean University, Ministry of Science and Technology, Shanghai 201306; 3. Laizhou Mingbo Aquatic Co., Ltd., Yantai 261400)

Iridovirus has a wide infection spectrum in aquatic animals, which is harmful to aquaculture. In spotted knifejaw (), iridovirus is the major factor causing large-scale mortality. Iridovirus infection results in high mortality rate and thus limits the development of the spotted knifejaw industry. As an important immunoregulatory factor,plays a vital role in viral immune response. In order to study its role in the process of iridovirus infection, we have cloned this gene and studied its spatiotemporal expression patterns. The total length ofgene is 3157 bp, including 5′-untranslated region (UTR) of 712 bp, 3′-UTR of 1278 bp. The open reading frame length is 1167 bp that encodes 388 amino acids, including 6 exons and 5 introns. Homologous alignment showed that the amino acid sequence ofin spotted knifejaw had a close identity to, of about 76.67%.is widely distributed in tissues, and high expressed in the head kidney, intestine, liver, skin, but shows a relatively low expression in the spleen and kidney. To further illustrate the expression patterns ofduring viral infection, we have analyzed the expression patterns ofin the spleen, liver, kidney, and head kidney at different time points after iridovirus infection. In head kidney, spleen and liver, the expression ofwas increased post infection. The peak level in the spleen and liver appeared 4 days post infection (dpi), and in the head kidney the peak appeared at 10 dpi. In the kidney, viral infection seemed to downregulateexpression. The highest expression was observed at day 0, then decreased at 4 dpi and reach the lowest level at 7 dpi. At 10 dpi, the expression had recovered but still lower than level of day 0. These results suggest thatcould respond to iridovirus infection and may play an important role in the process of viral immunity. However, the different expression pattern ofin different tissues after viral infection requires further study.

; Iridovirus;

S942.1

A

2095-9869(2020)03-0078-10

10.19663/j.issn2095-9869.20190309001

陳松林，E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

2019-03-09,

2019-04-16

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目藍(lán)色糧倉科技創(chuàng)新專項(xiàng)(2018YFD0900301-2)和山東省泰山學(xué)者攀登計(jì)劃項(xiàng)目共同資助[This work was supported by National Key R&D Program of China (2018YFD0900301-2), and Taishan Scholar Climbing Project Fund of Shandong, China.] 王 杉，E-mail: 787832529@qq.com

http://www.yykxjz.cn/

王杉, 徐文騰, 李明, 王潔, 王磊, 翟介明,陳松林. 斑石鯛基因克隆和表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 78–87

Wang S, Xu WT, Li M, Wang J, Wang L, Zhai JM, Chen SL. Molecular cloning and expression pattern analysis ofin spotted knifejaw (). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 78–87

CHEN Songlin, E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)