菲律賓蛤仔蛋白酶解物的抗氧化活性研究

穆姣姣 趙前程 崔相勇 李建偉 李智博

摘 要：本文研究了5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液的抗氧化活性，結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶兩種酶組合的酶解方式抗氧化活性最高，其羥自由基和[DPPH·]自由基清除率分別為（73.08±1.17）%和（35.18±1.10）%;進(jìn)一步對該雙酶酶解方式進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到最優(yōu)酶解工藝條件為：底物濃度1∶3、加酶量1%、酶解時間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液DPPH自由基清除率為42.68±2.90%。

關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔;抗氧化活性;酶解;風(fēng)味;工藝優(yōu)化

Abstract：Reseaching the enzymatic method of Ruditapes philippinarum protein showed that the DPPH radicals and hydroxyl radicals scavenging rate of Ruditapes philippinarum protein hydrolysates （by Flavourzyme and Protamex） were 73.08±1.17% and 35.18±1.10%. the hydrolysis conditions of the double-enzyme methods were optimized， and the optimal conditions were as follow： substrate concentration was 1：3， enzyme amount was 1%， time was 4 h. Under this condition， the DPPH radicals scavenging rate was 42.68±2.90%.

Key words：Ruditapes philippinarum; Antioxidant activity; Enzymolysis; Flavor; Process optimization

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）俗稱蜆子，其生長迅速，養(yǎng)殖方法簡單，生產(chǎn)周期短、投資少、收益大是灘涂貝類養(yǎng)殖的重要品種之一，且其營養(yǎng)豐富、肉味鮮美，與縊蟶、泥蚶和牡蠣有四大養(yǎng)殖貝類之稱[1-3]。我國對菲律賓蛤仔除直接食用外，多是通過簡單加工進(jìn)入食品市場，產(chǎn)品附加值低，其產(chǎn)品內(nèi)在價值沒有被充分有效地利用。如果能從高產(chǎn)量的菲律賓蛤仔及其加工下腳料中，通過酶解等生物手段，從中分離出一些具有抗氧化性質(zhì)的活性物質(zhì)，將這種活性物質(zhì)添加到食品中作為一種天然抗氧化劑或具有抗氧化功能的調(diào)味料產(chǎn)品，這將是充分利用菲律賓蛤仔蛋白的一條捷徑，將更充分有效地利用蛤類產(chǎn)品本身價值，提高菲律賓蛤仔的附加值，進(jìn)而促進(jìn)我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

菲律賓蛤仔、復(fù)合蛋白酶、堿性內(nèi)切酶、風(fēng)味蛋白酶、硫代巴比妥酸、DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基）、抗壞血酸、脫氧核糖。

1.2 菲律賓蛤仔酶解液的制備[4-6]

將菲律賓蛤仔攪碎后加入去離子水（1∶2，w/v），對菲律賓蛤仔以5種方式進(jìn)行酶解，見表1：復(fù)合蛋白酶（P）;堿性內(nèi)切酶（A）;風(fēng)味蛋白酶（F）;復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合（PF）：先用復(fù)合蛋白酶（P）酶解4 h，然后采用風(fēng)味蛋白酶（F）對酶解液繼續(xù)進(jìn)行酶解;堿性內(nèi)切酶與風(fēng)味蛋白酶組合（AF）：先用堿性內(nèi)切酶（A）酶解2 h，然后采用風(fēng)味蛋白酶（F）對酶解液繼續(xù)進(jìn)行酶解。五種方式酶解后，沸水浴100 ℃滅活10 min，8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，過濾。以未酶解的蛤蛋白溶液作為空白對照。

1.3 清除[DPPH·]自由基活性測定[7]

配制不同濃度的菲律賓蛤仔蛋白酶解液，取0.1 mL待測樣品，加入DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液3.9 mL，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，在515 nm下測定各溶液的吸光度值。用0.025 mg·mL-1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由曲線計算出[DPPH·]清除率為50%時菲律賓蛤仔酶解液的濃度，即為[DPPH·]自由基半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽性對照。

1.4 清除羥自由基活性測定[4]

于試管中加入脫氧核糖溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、磷酸鈉緩沖液1 mL（pH 7.4，0.2 mol·L-1）、硫酸亞鐵-EDTA溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、樣品溶液0.4 mL和蒸餾水2 mL，然后繼續(xù)加入過氧化氫0.2 mL（10 mmol·L-1）啟動反應(yīng)。將試管置于37 ℃水浴中1 h，然后加入三氯乙酸1 mL（2.8%）和硫代巴比妥酸1 mL（1%），于沸水浴中放置10 min，取出后立即放入冰浴中5 min。然后在532 nm下測定吸光度。計算出半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽性對照。

1.5 酶解條件單因素試驗

其他酶解條件不變，分別改變酶解時間（1、2、3、4 h和5 h）、底物濃度（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）和加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%）測定菲律賓蛤仔酶解液的抗氧化活性。

1.6 正交試驗

以DPPH自由基清除率作為抗氧化活性評價指標(biāo)，根據(jù)酶解條件單因素實驗結(jié)果，對酶解時間、加酶量和底物濃度進(jìn)行正交試驗，三因素三水平設(shè)計如表2所示。

2.1 菲律賓蛤仔5種酶解液的抗氧化活性比較分析

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液及空白對照的抗氧化活性如表3所示，酶解液的抗氧化活性顯著（p<0.05）高于空白對照;復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合方式制備的酶解液羥自由基和[DPPH·]自由基清除率顯著高于其他方式的酶解液（p<0.05），分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;通過對復(fù)合蛋白酶制備的蛋白酶解物再進(jìn)一步采用風(fēng)味蛋白酶處理，不僅提高了風(fēng)味，而且[DPPH·]自由基清除活性顯著增強(qiáng)。

2.2 菲律賓蛤仔酶解工藝優(yōu)化

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液經(jīng)過自由基清除率比較，復(fù)合蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶的自由基清除率及風(fēng)味最好，因此，對此種酶解方式制備的蛤蛋白酶解物進(jìn)行工藝優(yōu)化?？紤]到雙酶組合的酶解過程中，酶解液的自由基清除率是由復(fù)合蛋白酶起主要作用，因此，對雙酶組合中的復(fù)合蛋白酶酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 酶解時間對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖1知，酶解時間為3 h，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，酶解時間選擇3 h。

2.2.2 底物濃度對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖2知，底物濃度為1∶3時，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，最佳底物濃度選擇1∶3。

2.2.3 加酶量對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖3知，當(dāng)加酶量為0.8%時，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，加酶量選擇0.8%。

2.2.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗，確立了最佳復(fù)合蛋白酶酶解條件，在此基礎(chǔ)上，以[DPPH·]自由基清除率為指標(biāo)，對酶解時間、底物濃度和加酶量進(jìn)行三因素三水平正交試驗，結(jié)果見表4。由表4知，[DPPH·]自由基清除率的影響因素為酶解由大到小依次為酶解時間、底物濃度和加酶量。由k值得最佳組合為A2B3C3，即酶解時間4 h，底物濃度1∶3，加酶量1%，在此條件下，[DPPH·]自由基清除率是（42.68±2.90）%。

3 結(jié)論

酶解方式對菲律賓蛤仔蛋白酶解物抗氧化活性有明顯的影響。復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合雙酶酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解物的[DPPH·]自由基和羥自由基清除率分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;最優(yōu)酶解工藝條件為：底物濃度1∶3，加酶量1%，酶解時間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液[DPPH·]自由基清除率為（42.68±2.90）%。

參考文獻(xiàn)：

[1]張榭令，姜仕臣，叢裕泉，等.山東蓬萊菲律賓蛤仔資源調(diào)查研究[J].海洋湖沼通報，2007（4）：151-156.

[2]杜尚昆，邊永德，柳中鋒.菲律賓蛤仔工廠化育苗技術(shù)[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2005（3）：24-25.

[3]陶 平，許慶陵，譚淑榮.大連沿海幾種腹足類和雙殼類的營養(yǎng)成分分析[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000（2）：182-186.

[4]Dong S Y，Zeng M Y，Wang D F，et al.Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from Silver carp （Hypophthalmichthys molitrix）[J].Food Chemistry，2007，107（4）：1485-1493.

[5]Tsai J S，Chen J L，Pan B S.ACE-inhibitory peptides identified from the muscle protein hydrolysate of hard clam （Meretrix lusoria）[J].Process Biochemistry，2008，43（7）：743-747.

[6]Tsai J S，Lin T C，Chen J L，et al.The inhibitory effects of freshwater clam （Corbicula fluminea， Muller） muscle protein hydrolysates on angiotensin I converting enzyme[J].Process Biochemistry，2006，41：2276-2281.

[7]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.