金蓮花綠變植原體的分子鑒定

王蓉 陳炳蔚 李勇 劉琨 王天佑 丁萬隆

摘要 本研究對河北省大面積發(fā)生的金蓮花綠變病的病原進行檢測和鑒定。以金蓮花葉片的總DNA為模板，使用植原體16S rDNA和核糖體蛋白（ribosomal protein）基因rp的特異性引物進行PCR擴增，在感病金蓮花樣品中擴增到植原體的16S rDNA（1 432 bp）片段和rp基因（1 240 bp）片段。序列分析發(fā)現(xiàn)，獲得的16S rDNA和rp基因片段與洋蔥黃化植原體Onion yellows phytoplasma（GenBank登錄號：AP006628）的相似度最高，分別為99.9%和99.3%，確定金蓮花綠變病的病原為植原體，暫命名為金蓮花綠變植原體Trollius chinensis virescence phytoplasma。對金蓮花綠變植原體的16S rDNA進行虛擬RFLP分析，發(fā)現(xiàn)其酶切圖譜與16Sr Ⅰ-B亞組的洋蔥黃化植原體的參照圖譜完全一致，相似系數(shù)1.00。16S rDNA和rp基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，金蓮花綠變植原體與16SrⅠ-B亞組的植原體聚為一支，屬于植原體16S rⅠ-B亞組。

關(guān)鍵詞 金蓮花; 綠變病; 植原體; 16S rDNA; 核糖體蛋白; 系統(tǒng)發(fā)育進化樹

中圖分類號： S 435.672

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019460

Molecular identification of Trollius chinensis virescence phytoplasma

WANG Rong1， CHEN Bingwei1， LI Yong1， LIU Kun1， WANG Tianyou1， 2， DING Wanlong1

（1. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing

100193， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine，Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract

Trollius chinensis virescence disease widely occurred in Hebei province. In this study， the pathogen of this disease was detected and identified. To determine the pathogen of T.chinensis virescence disease， PCR was performed using total DNA extracted from symptomatic and symptomless leaves of T.chinensis， with primers specifically amplifying 16S rDNA and ribosomal protein gene （rp） of phytoplasma. A 16S rDNA fragment of 1 432 bp and a rp fragment of 1 240 bp were amplified from symptomatic samples， while no expected PCR product was obtained from symptomless samples. Sequence analysis showed that 16S rDNA fragment and rp fragment of T.chinensis virescence shared the highest nucleotide identity （99.9% and 99.3%， respectively） with those of Onion yellows phytoplasma （GenBank accession No.AP006628）. Therefore， we confirmed that the pathogen of T.chinensis virescence disease was phytoplasma， tentatively named T.chinensis virescence phytoplasma. The virtual restriction fragment length polymorphism （RFLP） pattern derived from the 16S rDNA fragment of T.chinensis virescence phytoplasma is identical （similarity coefficient 1.00） to the reference pattern of Onion yellow phytoplasma， a representative member of 16Sr group Ⅰ， subgroup B. Phylogenetic analysis showed that 16S rDNA and rp gene of T.chinensis virescence phytoplasma clustered in 16Sr group Ⅰ， subgroup B.

Key words

Trollius chinensis; virescence disease; phytoplasma; 16S rDNA; ribosomal protein; phylogenetic tree

植原體（phytoplasma）是一類不具有細胞壁、由昆蟲介體傳播的植物病原細菌，可危害1 000多種植物，僅我國報道的就有100多種[13]。植物感染植原體后可表現(xiàn)叢枝（witches-broom）、黃化（yellowing）、花變?nèi)~（phyllody）、衰退（withering）、綠變（virescence）、矮化（stunting）、韌皮部壞死（phloem necrosis）等癥狀[4]。植原體主要存在于植物韌皮部篩管和介體昆蟲體內(nèi)，很難在體外被培養(yǎng)，主要通過葉蟬、木虱等刺吸式昆蟲傳播[5]。

隨著PCR檢測、測序和系統(tǒng)進化樹分析方法的建立，已建立了根據(jù)保守性較高的16S rDNA序列信息對植原體進行分類的規(guī)則。2004年，國際比較菌原體學(xué)研究計劃（IRPCM）為植原體建立了一個暫定屬——‘Candidatus （Ca.） Phytoplasma，目前該屬已有38個成員。根據(jù)IRPCM規(guī)定，當(dāng)植原體株系與已確定種的16S rDNA序列相似度低于97.5%，即可確定為新種[68]。根據(jù)16S rDNA的序列特征和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），已將植原體劃分為28個組和若干亞組[910]。16S rDNA的高度保守性不利于親緣關(guān)系較近的亞組間劃分，研究中常依據(jù)核糖體蛋白（rp）基因、延伸因子（tuf）基因、16S～23S 間隔區(qū)等核苷酸序列變異較大的區(qū)域進行亞組的分類[9]。

金蓮花Trollius chinensis Bunge是毛茛科Ranunculaceae多年生草本植物，其花色澤艷麗，不僅具有觀賞價值，還是一味重要中藥，具有“明目、解嵐障”之功效[11]。在病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)河北省沽源縣和圍場縣種植的金蓮花出現(xiàn)大面積花綠變病害，嚴(yán)重地塊病害發(fā)生率可達20%～30%，感病植株表現(xiàn)為花變小，萼片和花瓣均為綠色，不能正常開花。葉片黃化，植株長勢變?nèi)酰▓D1），觀賞性下降，藥材產(chǎn)量降低。根據(jù)癥狀特征推測該病害由植原體侵染引起。本研究采用PCR擴增植原體16S rDNA基因和核糖體蛋白基因（rp），對其16S rDNA序列rp基因序列進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并利用植原體在線分析軟件iPhyClassifier確定其分類和進化地位，旨在為該病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

檢測樣品：樣品為2018年7月在河北省沽源縣和圍場縣金蓮花人工種植區(qū)采集的具有金蓮花綠變病的金蓮花葉片。

試劑及儀器：CTAB購自Sigma公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;pClone007 Vector Kit購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 葉片總DNA提取

采用CTAB法提取葉片總DNA。將金蓮花植株葉片置于液氮中充分研磨，取約0.1 g植物粉末至離心管，加入600 μL 2% CTAB溶液（2% CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% PVP，pH 8.0）振蕩混勻;置于65℃水浴鍋20 min;加入等體積的氯仿抽提，12 000 r/min離心5 min，取上清;加入0.6倍體積的異丙醇，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，沉淀干燥后溶于50 μL ddH2O，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測

根據(jù)Lee等報道的植原體16S rDNA基因擴增引物R16mF2（5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′）/R16mR1（5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′）和rp基因的擴增引物rpF1（5′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′）/rpR1（5′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′）[9， 12]，以表現(xiàn)金蓮花綠變癥狀的植株葉片總DNA為模板進行PCR 擴增，以健康金蓮花葉片總DNA樣品為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目標(biāo)條帶，并將目標(biāo)條帶克隆到pClone007載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 序列比對分析

使用NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn程序和DNAMAN 6.0軟件對所得序列進行比對分析。在GenBank數(shù)據(jù)庫下載獲得27個16S rDNA序列，16個rp基因序列，使用MEGA 5.2軟件以鄰接法（neighbor joining）分別構(gòu)建16S rDNA和rp基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap重復(fù)數(shù)為1 000。

1.5 植原體16S rDNA序列iPhyClassifier在線分析

通過植原體的在線分類鑒定軟件iPhyClassifier[13]（https：∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi）對植原體16S rDNA序列進行分析，確定植原體的分類地位。

2 結(jié)果和分析

2.1 金蓮花綠變病癥狀表現(xiàn)

感病金蓮花的花變小，萼片和花瓣均為綠色，不能正常開花，葉片黃化，植株長勢變?nèi)酰▓D1）。

2.2 PCR檢測

通過PCR的方法，使用植原體16S rDNA基因和rp基因的特異引物R16mF2/R16mR1和 rpF1/rpR1引物在感病金蓮花樣品中分別擴增到約1.4 kb和約1.2 kb的條帶，健康金蓮花樣品中未擴增到上述條帶（圖2）。初步確定金蓮花綠變病的病原為植原體，暫命名為金蓮花綠變植原體Trollius chinensis virescence phytoplasma。

2.3 16S rDNA和rp基因片段的克隆及其序列分析

經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，供試樣品16S rDNA片段全長1 432 bp（GenBank登錄號：MK880149），包含植原體16S rDNA序列，G+C含量為51.4%。BLASTn分析發(fā)現(xiàn)該片段與16Sr Ⅰ組成員洋蔥黃化植原體Onion yellows phytoplasma（GenBank登錄號：AP006628）的相似度最高，為99.9%，與候選種Ca.P.asteris （GenBank登錄號：KX773527）的相似度為99.8%。初步確定金蓮花綠變植原體屬于16Sr Ⅰ組，與Ca. P.asteris候選種相關(guān)。

rp基因片段的測序結(jié)果顯示，該片段長1 240 bp（GenBank登錄號：MN027280），包含核糖體蛋白基因L22（rpl22）和S3（rps3）的全部編碼區(qū)及S19（rps19）的部分編碼區(qū)。BLASTn分析發(fā)現(xiàn)該片段與洋蔥黃化植原體的相似度為99.3%。

2.4 RFLP分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用iPhyClassifier軟件對金蓮花綠變植原體16S rDNA 進行虛擬RFLP分析，結(jié)果顯示其酶切圖譜與16Sr Ⅰ-B亞組的洋蔥黃化植原體的參照圖譜完全一致（相似系數(shù)1.00）。此結(jié)果確定金蓮花綠變植原體屬于16Sr Ⅰ-B亞組。

根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，金蓮花綠變植原體與Ca.P.asteris（GenBank登錄號：KX773527）、玉米叢矮植原體Maize bushy stunt phytoplasma（GenBank登錄號：AY265208）、月見草植原體Oenothera phytoplasma（GenBank登錄號：M30790）和洋蔥黃化植原體聚為一支，親緣關(guān)系最近，屬于16SrⅠ組，B亞組（圖3）。根據(jù)rp基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，金蓮花綠變植原體與洋蔥黃化植原體和玉米叢矮植原體聚為一支，親緣關(guān)系最近（圖4）。此結(jié)果進一步確定金蓮花綠變植原體屬于16Sr Ⅰ-B亞組。

3 討論

金蓮花是常用中藥，民間常用于治療急、慢性扁桃體炎、中耳炎、上呼吸道感染等癥。近年來，金蓮花野生資源日益匱乏，多以人工種植為主，隨著金蓮花的大規(guī)模集約化種植，暴露了生產(chǎn)過程中存在的很多問題。2018年，在河北沽源和圍場的金蓮花產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)金蓮花綠變病，通過PCR擴增植原體16S rDNA和rp基因、序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹等分子生物學(xué)方法，確定金蓮花綠變病的病原為16Sr Ⅰ-B亞組的植原體，該植原體與候選種Ca. P.asteris的16S rDNA序列相似度最高（99.8%），為Ca. P.asteris的相關(guān)株系。這是世界范圍內(nèi)首次報道植原體危害金蓮花。

植原體病害主要以預(yù)防為主，一旦病害暴發(fā)無有效的防治措施，會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。只有明確金蓮花綠變植原體的傳染源和傳播途徑才能夠有的放矢地對該病害進行防治?；?6S rDNA和rp基因的序列比對分析和系統(tǒng)進化發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)金蓮花綠變植原體與洋蔥黃化植原體、玉米叢矮植原體和月見草植原體的親緣關(guān)系最近，這暗示了它們之間在生物學(xué)方面存在著親緣關(guān)系，但這是否為金蓮花綠變病的傳染源，還需進一步研究確認(rèn)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金蓮花種植區(qū)椿象等刺吸式昆蟲頻繁高發(fā)，這些昆蟲介體是否為植原體傳播的主要媒介，還有待進一步鑒定。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190903?? 修訂日期： 20191120

基金項目：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程 （2016-I2M-3-017）;中央本級重大增減支項目（2060302）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者E-mail：wlding@implad.ac.cn

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