加味丹參飲對(duì)心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素-2的影響1)

李鑫輝,黃政德,葛金文

心肌缺血最有效的治療措施是恢復(fù)血液供應(yīng),缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)的過(guò)程稱為再灌注,再灌注可使缺血心肌損傷加重,即產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷(ischermic reperfusion injury,IRI)。心肌IRI的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)多因素協(xié)同作用的過(guò)程。研究證明,炎癥在心肌IRI的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1],隨著再灌注的進(jìn)行,大量活化的中性粒細(xì)胞聚集在心肌微血管內(nèi)并浸潤(rùn)到心肌組織中,通過(guò)釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)引起心肌損傷。本實(shí)驗(yàn)采用血瘀證兔心肌IRI模型,觀察加味丹參飲對(duì)心肌IRI時(shí)炎癥因子及心肌酶的影響,以進(jìn)一步探討其對(duì)心肌IRI保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 家兔60只,體重1.5 kg～2.5 kg,雌雄兼用。購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào):SYXK(湘)2003-0001。

1.1.2 藥物 加味丹參飲(丹參20 g,檀香6 g,赤芍10 g,川芎6 g,當(dāng)歸6 g,紅花6 g,生地12 g,黃芪20 g等),藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供,浸泡、煎煮、去渣,濃縮至藥液濃度為1 g/mL,保存?zhèn)溆?。丹參注射?正大青春寶藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020177)每支 10 mL。

1.1.3 儀器與試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī),DW-2000型,上海嘉鵬;放射免疫計(jì)數(shù)器,ac1500r型,中國(guó)科技大學(xué);全自動(dòng)生化分析儀,CL-7200型,日本島津;血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-2(IL-2)試劑,購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑,北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。

1.2.1 動(dòng)物分組 家兔 60只,隨機(jī)分為 A組(空白組)、B組(血瘀證組)、C組(IRI組)、D組(預(yù)處理組)、E組(丹參組)、F組(加味丹參飲組),每組10只?？瞻捉M:于造模同期注射等量生理鹽水,同期開(kāi)胸,冠脈穿線不結(jié)扎。血瘀證組:血瘀證造模結(jié)束后第2天,開(kāi)胸穿線不結(jié)扎。IRI組:血瘀證造模結(jié)束后第2天,開(kāi)胸結(jié)扎冠脈30 min,恢復(fù)冠脈血流90 min。預(yù)處理組:血瘀證造模結(jié)束后第2天,開(kāi)胸結(jié)扎冠脈5 min,再灌注5 min,共反復(fù)3次,余同C組。丹參組和加味丹參飲組處理同C組。

1.2.2 造模方法 建立血瘀證動(dòng)物模型:于兔耳緣靜脈緩慢注射去甲腎上腺素 0.1 mg/(kg?d)連續(xù)20 d,于造模 1 d靜脈注射牛血清白蛋白 250 mg/kg,間隔10 d,再注射1次,共2次,以血液流變學(xué)指標(biāo)較空白組升高有差異,說(shuō)明血瘀證動(dòng)物模型成功。建立心肌缺血再灌注模型:血瘀證家兔用25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉后固定,記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管切開(kāi),連接動(dòng)物呼吸機(jī)。開(kāi)胸暴露心臟,于左心耳下左冠狀動(dòng)脈前降支上1/3處穿線,在線兩段各穿1結(jié)扎環(huán)以阻斷冠脈血流。以心電圖ST段出現(xiàn)弓背抬高為結(jié)扎成功,以ST段下降1/2為血流再灌注成功。

1.2.3 給藥劑量與方法 給藥劑量根據(jù)成人臨床劑量,按動(dòng)物體表面積換算。E組于兔耳緣靜脈給藥,在開(kāi)胸前3 d開(kāi)始靜注丹參注射液0.6 mL/(kg?d);F組灌胃給藥,在開(kāi)胸前3 d開(kāi)始灌胃加味丹參飲10mL/(kg?d)[相當(dāng)于生藥含量5.16 g/(kg?d)];A、B、C、D組在開(kāi)胸前3 d灌胃等量生理鹽水。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定 各組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)頸動(dòng)脈取血,血清TNF-α和IL-2測(cè)定采用放射免疫法,測(cè)定LDH和CK-MB,用島津全自動(dòng)生化分析儀,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔TNF-α和IL-2水平的影響 C組TNF-α和IL-2水平均升高,與A組和B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),E組和F組 TNF-α和IL-2水平均降低,與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),D組和F組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心肌IRI后血瘀證兔炎癥因子水平明顯升高,而加味丹參飲可明顯降低炎癥因子水平。詳見(jiàn)表1。

表1 各組兔 TNF-α和IL-2水平比較(±s)ng/mL

表1 各組兔 TNF-α和IL-2水平比較(±s)ng/mL

組別 n TNF-α IL-2 A組 10 1.21±0.67 2.56±0.51 B組 10 1.32±0.37 2.66±0.67 C組 10 2.92±0.361)2) 4.35±0.991)2)D組 10 1.96±0.381)2)3) 3.27±0.641)3)E組 10 2.44±0.371)2)3)4) 3.35±0.661)2)3)F組 10 2.30±0.251)2)3) 3.64±0.421)2)3)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與C組比較,3)P＜0.05;與D組比較,4)P＜0.05

2.2 對(duì)心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔心肌酶的影響 C組LDH和CK-MB均高于A組和B組(P＜0.05);E組和F組LDH和CK-MB均較C組明顯降低(P＜0.05)。說(shuō)明心肌IRI后血瘀證家兔心肌酶水平明顯升高,而加味丹參飲可明顯降低LDH和CK-MB的水平。詳見(jiàn)表2。

表2 各組兔心肌酶水平比較(±s)U/L

表2 各組兔心肌酶水平比較(±s)U/L

組別 n LDH CK-M B A組 10 145.38±55.11 466.75±283.95 B組 10 168.75±84.44 502.88±262.84 C組 10 418.63±123.151)2) 1 088.00±155.471)2)D組 10 262.63±76.911)2)3) 539.13±171.282)3)E組 10 289.88±188.851)2)3) 744.88±243.311)2)3)4)F組 10 244.00±103.113) 752.00±119.111)2)3)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與C組比較,3)P＜0.05;與D組比較,4)P＜0.05

3 討 論

隨著溶栓療法、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)、冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)等廣泛應(yīng)用于臨床,心肌缺血的治療進(jìn)入了再灌注時(shí)期,但在心肌得到血液再灌注后,不僅功能未得到恢復(fù),反而使心肌損傷加重。炎癥在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用,再灌注心肌是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的主要來(lái)源[2],炎癥損傷貫穿于心肌細(xì)胞損傷的全過(guò)程,隨著再灌注的進(jìn)行,大量活化的中性粒細(xì)胞聚集在心肌微血管并浸潤(rùn)到心肌組織中,通過(guò)釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)引起心肌損傷。TNF-α和IL-2是重要的炎性細(xì)胞因子,在正常的心肌組織中它們含量很低,心肌IRI后數(shù)分鐘由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等大量釋放,過(guò)量的炎性細(xì)胞因子可通過(guò)第二信使通路蛋白激酶C(PKC)和絲裂原蛋白激酶(MAPKs)使核轉(zhuǎn)錄因子κ B(NF-κ B)得以活化而轉(zhuǎn)核發(fā)揮其調(diào)控作用。NF-κ B活化能調(diào)控多種靶基因的表達(dá),如黏附分子家族的細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等[3],在這些黏附分子作用下,白細(xì)胞在缺血區(qū)黏附、聚集,造成內(nèi)皮損傷,血栓形成。同時(shí),這些黏附分子又促使白細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移、浸潤(rùn)并損傷心肌[4]。沈波等[5]探討趨化因子受體5(CCR5)抗體對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,結(jié)果顯示CCR5抗體可以通過(guò)抑制細(xì)胞因子 TNF-α從而阻止NF-κ B的早期活化而抑制ICAM-1表達(dá)、減少白細(xì)胞的黏附聚集從而對(duì)缺血再灌注心肌起到保護(hù)作用。陳玉東[6]探討血清 TNF-α在兔心肌缺血再灌注中的動(dòng)態(tài)變化及卡托普利的干預(yù)作用,結(jié)果顯示TNF-α參與了心肌缺血再灌注的發(fā)生,卡普利在體內(nèi)可能通過(guò)抑制 TNF-α的生成或釋放,發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。劉愛(ài)華等[7]探討銀杏酮酯(GBE50)預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)炎癥細(xì)胞因子和抗炎因子的影響,結(jié)論提示GBE50可能通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子、促進(jìn)抗炎因子的表達(dá),對(duì)心肌缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用。盧向航等[8]探討延遲相嗎啡預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制,結(jié)果顯示嗎啡預(yù)處理延遲相可通過(guò)調(diào)控炎性細(xì)胞因子平衡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)建立血瘀證 IRI模型,觀察到IRI后 TNF-α和IL-2水平均升高,這與以往研究一致,加味丹參飲組能明顯降低TNF-α和IL-2水平,與IRI模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與預(yù)處理組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加味丹參飲可以抑制心肌缺血再灌注時(shí)炎性遞質(zhì)激活,從而可以保護(hù)心肌 IRI。

心肌酶在正常生理狀況下廣泛存在于心肌細(xì)胞中,在心肌缺血后由于無(wú)氧代謝導(dǎo)致大量有害的物質(zhì)如乳酸和氧自由基等在心肌中堆積,導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷,細(xì)胞膜通透性增加,使細(xì)胞內(nèi)酶大量釋放入血液,因此,臨床常以血清心肌酶作為心肌損傷的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,IRI組LDH和CK-MB水平明顯升高,而加味丹參飲能使LDH和CK-MB水平明顯下降,與IRI組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),加味丹參飲能有效減少心肌酶外漏,從而對(duì)心肌損傷起著保護(hù)作用。

中醫(yī)學(xué)雖然沒(méi)有心肌 IRI這一病名,但根據(jù)其病變部位(心)和臨床表現(xiàn),應(yīng)屬于胸痹心痛、真心痛等范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為,心肌IRI病位在心,中醫(yī)辨證多屬氣虛血瘀,本虛標(biāo)實(shí)之證。石高舉等[9]探索活血化瘀類中藥在防治冠心病心絞痛中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),其研究結(jié)果為臨床上研究活血化瘀類中藥在冠心病發(fā)病機(jī)制中的抗炎作用提供了有力的證據(jù)。孫曉莉等[10]應(yīng)用生脈注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷家兔進(jìn)行干預(yù)治療,結(jié)果顯示生脈注射液可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子,拮抗全身炎癥反應(yīng)而保護(hù)心肌細(xì)胞,減輕心肌IRI。本課題在血瘀證基礎(chǔ)上,建立 IRI模型,應(yīng)用加味丹參飲預(yù)處理,陳修圓謂:“丹參飲治療心痛、胃痛諸痛多效”。加味丹參飲主要用治于缺血性心臟病,病位在心不在胃,故去原方砂仁,加川芎、赤芍、當(dāng)歸、黃芪等藥。黃芪補(bǔ)氣培元,扶助心氣。方中重用丹參,專入血分,內(nèi)達(dá)臟腑而化瘀滯,檀香善入氣分,行氣化滯,生地、當(dāng)歸扶正濡養(yǎng)治本。全方益氣活血,通絡(luò)止痛。其可以通過(guò)降低炎癥因子水平,防止心肌細(xì)胞損傷,至于其保護(hù)心肌IRI作用的深入機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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