復方銀思維對散發(fā)性老年癡呆模型鼠學習記憶能力及其海馬神經元超微結構的影響

第五永長,田金洲,時 晶

阿爾茨海默病(AD)可分為家族性和散發(fā)性兩大類,約占全部癡呆病例的65%,目前已成為老年人群中繼心血管病、惡性腫瘤、中風之后的第四大“殺手”。其中,散發(fā)性老年性癡呆(SAD)約占AD的95%。與家族性AD的基因突變病因不同,SAD主要由一些遺傳性危險因素、老齡以及環(huán)境性的危險因素所導致,是老年性癡呆中最可望通過藥物干預的類型。

復方銀思維是在清代名醫(yī)陳士鐸治療呆病經驗方的基礎上經組方及劑量優(yōu)化形成的有效成分提取物。本課題較系統(tǒng)的研究了該方防治SAD認知損害的作用及其可能機制。本文是課題研究的一部分,重點觀察和探討了該方對于SAD模型大鼠學習記憶能力的影響及其超微形態(tài)學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠84只,體重(270±20)g,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(實驗動物合格證號:0034642)。將大鼠隨機分為假手術組(Sham-operated,S)、模型組(Model,M)、多奈哌齊對照組(Donepezil,D)、銀思維小劑量組(YSW Small Dose,YS)、銀思維中劑量組(YSW Middle Dose,YM)、銀思維大劑量組(YSW Large Dose,YL)。每組動物14只。

1.2 SAD模型制備 參考Sharma等方法[1-4],除假手術組外,其余動物注射鏈脲佐菌素(STZ)約 18 μ L。坐標參考George Paxinos Charles Waston《大鼠腦立體定向圖譜》[5]。假手術組以等量人工腦脊液替代STZ。術后常規(guī)飼養(yǎng)21 d后予以藥物治療。造模及飼養(yǎng)過程中動物死亡率為19.2%。

1.3 干預藥物及給藥方法 銀思維由人參、半夏、茯神、附子、菖蒲等組成。由999企業(yè)集團醫(yī)藥股份有限公司提供中藥提取物顆粒(產品批號:0908032)。實驗過程中以60℃雙蒸水溶解稀釋,配成大、中、小劑量濃度,按生藥計算的大鼠給藥劑量為:大劑量30.42 g/(kg?d);中劑量 15.21 g/(kg?d);小劑量7.61 g/(kg?d),按0.75 mL/100(g?d)灌胃。多奈哌齊(中美合資西安海欣制藥有限公司生產,藥物購自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥房)以0.92 mg/kg劑量,按0.75 mL/100(g?d)灌胃。模型組及假手術組給予等體積的雙蒸水。各組均每日1次,共灌胃2個月。

1.4 行為學測試 采用Morris水迷宮試驗法。定位航行實驗,空間搜索實驗。

1.5 電鏡觀察 電鏡樣品處理:取出新鮮大鼠海馬切割成1 mm3的組織塊,投入2.5%的戊二醛固定液,固定2 h,待組織塊下沉,0.01 mol/L PBS液沖洗3次,常溫保存在0.01 mol/L PBS中,送電鏡室。

2 結 果

2.1 行為學測試結果

2.1.1 定位航行試驗 在5 d的定位航行試驗中,各組大鼠的平均逃避潛伏期及總游泳距離都呈逐漸下降趨勢,表明動物在歷次學習訓練過程中,學習尋找平臺的能力均得到提高。在第1天的訓練中,模型組與假手術組平均逃避潛伏期及總游泳距離無統(tǒng)計學意義,在隨后的4 d中兩組平均逃避潛伏期及總游泳距離表現出統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。從第3天開始,多奈哌齊組,銀思維小、中、大劑量組與模型組相比,平均逃避潛伏期及總游泳距離有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01),其中以銀思維中劑量、大劑量差異最為顯著(P＜0.01)。第5天各治療組與模型組相比,平均逃避潛伏期及總游泳距離均呈有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。除第2天結果顯示銀思維大劑量組與多奈哌齊組相比平均逃避潛伏期及總游泳距離有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)外,其余時間多奈哌齊組與銀思維小、中、大劑量組組間比較均無統(tǒng)計學意義。詳見表 1、表2。

表1 大鼠在定位航行試驗中的平均逃避潛伏期比較(±s)s

表1 大鼠在定位航行試驗中的平均逃避潛伏期比較(±s)s

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術組 11 76.74±25.03 1.37±10.76 20.46±10.14 12.91±3.10 10.67±6.59模型組 11 294.69±7.01 88.98±26.022) 50.96±31.852) 47.43±30.502) 40.23±34.122)多奈哌齊對照組 12 78.92±24.19 66.95±26.47 27.99±17.48 28.26±25.97 15.62±13.583)銀思維小劑量組 11 69.09±41.59 60.99±28.913) 25.89±20.463) 23.62±11.163) 16.75±13.304)銀思維中劑量組 11 56.54±19.813) 40.69±19.144) 26.62±21.433) 30.68±27.753) 19.95±23.074)銀思維大劑量組 11 66.29±20.853) 27.07±10.174)5) 19.84±11.894) 16.84±12.384) 11.19±7.984)與假手術組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與多奈哌齊對照組比較,5)P＜0.05

表2 大鼠在定位航行試驗中的游泳距離比較(±s)cm

表2 大鼠在定位航行試驗中的游泳距離比較(±s)cm

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術組 11 968.74±368.03 676.65±408.62 334.22±175.44 231.23±22.87 179.15±105.79模型組 12 1 210.51±303.78 1 093.50±498.431) 764.34±375.982) 748.82±376.272) 601.59±409.032)多奈哌齊對照組 12 1 063.38±407.53 755.59±348.043) 451.88±272.123) 408.39±244.893) 247.31±224.994)銀思維小劑量組 11 822.28±544.56 665.53±493.533) 328.29±173.624) 316.62±146.444) 260.75±215.794)銀思維中劑量組 11 742.90±313.50 529.96±329.794) 361.29±206.504) 461.85±387.993) 307.56±310.554)銀思維大劑量組 11 968.91±400.43 422.41±204.954)5) 341.9136±171.924) 252.18±123.284) 157.18±105.474)與假手術組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與多奈哌齊對照組比較,5)P＜0.05

2.1.2 空間探索試驗 在第6天撤除平臺后的試驗中,與假手術組相比,模型組表現出在外環(huán)區(qū)域滯留較長,原平臺附近活動很少,第1象限活動時間明顯較短,兩組第1象限活動時間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組相比,各治療組第1象限活動時間明顯延長,其中銀思維中、大劑量組在第1象限活動時間較之差異性最為顯著(P＜0.01)。多奈哌齊組與銀思維小、中、大劑量組組間比較均無統(tǒng)計學意義。詳見表3。

表3 大鼠空間探索試驗第1象限活動時間(±s)s

表3 大鼠空間探索試驗第1象限活動時間(±s)s

組別 n 第1象限活動時間假手術組 11 59.49±8.56模型組 12 15.92±6.151)多奈哌齊對照組 12 41.01±10.762)銀思維小劑量組 11 39.91±13.962)銀思維中劑量組 11 52.81±4.293)銀思維大劑量組 11 56.45±5.313)與假手術組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 大鼠海馬神經元超微結構改變 假手術組大鼠海馬神經元細胞形態(tài)規(guī)則,核膜光滑,核仁清楚,染色質均勻分布,以常染色質為主。其中細胞器豐富,粗面內質網分布規(guī)則,線粒體發(fā)達,排列密集,未見腫脹,高爾基體極性明顯。神經元軸突內微管排列整齊成束狀,未見微管斷裂、溶解等現象。組織間毛細血管結構完整,毛細血管內皮細胞間連接緊密,血管與腦組織間無間隙。

模型組大鼠海馬神經元呈缺血樣改變,核膜、核仁尚清晰。染色質濃縮,異染色質增多,靠近核膜邊緣排列。細胞器結構有不同程度損壞,線粒體腫脹并有空泡變性,可見線粒體嵴泡狀擴張。核糖體部分解聚,部分脫顆粒,高爾基體結構紊亂,呈部分擴張,粗面內質網擴張,有腫脹。神經元胞質偶見脂褐素顆粒、溶酶體增多。神經元軸突內微管結構有明顯的斷裂或溶解現象,多數區(qū)域微管消失,排列紊亂。毛細血管周圍有水腫,組織間隙增大,水分增多,血管通透性增大。可見星型膠質細胞明顯水腫。

中藥各治療組大鼠海馬神經元微管無明顯斷裂和溶解,排列較整齊,軸突結構清楚,與假手術組接近。與模型組相比,各治療組細胞病理程度均有很大改善,其中以中藥大、中劑量組效果最為顯著。電鏡下可見神經元胞體形態(tài)規(guī)則,無固縮,神經元核膜、核仁清楚,核染色質分布均勻,以常染色質為主,毛細血管周圍無水腫現象,組織間隙無增大。軸突軸漿豐富,線粒體結構正常,無腫脹。胞質細胞內器較正常,未見水腫。中藥小劑量組微管排列尚可,部分結構不甚清楚。

3 討 論

AD的病理特征主要為大腦局部尤其是海馬和皮層神經元退行性病變,細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFT)和細胞外老年斑(senile plaque,SP)沉積。其中NFT的數量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關,被認為是AD患者神經原退化的病理基礎[6]。NFT的主要成分是由異常過度磷酸化tau蛋白聚集而形成的雙螺旋絲(paired helical filaments,PHFs)。近年研究顯示,微管相關蛋白 tau的異常過度磷酸化不僅使其喪失催化微管裝配和穩(wěn)定微管結構的正常生物活性,還使其變成具有細胞毒性的分子,并促使其自身沉積為NFT[7],還可獵獲正常的微管相關蛋白,使得微管崩解,軸突變性,細胞退化及丟失,最終導致AD患者的認知功能受到嚴重的損害。因此,從保護微管結構,防止軸突變性損傷著眼,抑制tau蛋白異常過度磷酸化及NFT形成,是防治SAD的重要策略。

AD屬于祖國醫(yī)學呆病、文癡、善忘、郁證等范疇。隨著人口老齡化加劇以及中醫(yī)藥對復雜性疾病研究的不斷深入,SAD已成為中醫(yī)藥防治老年性癡呆最有希望突破的疾病類型。中醫(yī)學在本病的防治方面積累了較為豐富的臨床經驗,該領域的古籍文獻得到越來越多的挖掘。部分名方的療效已得到長期臨床實踐的檢驗,極有必要對其進行深入細致的實驗研究,揭示其療效機制,為中醫(yī)藥防治復雜性疾病提供范例。

本實驗所用中藥復方源自清代名醫(yī)陳士鐸治療呆病之名方,原方由人參、半夏、茯神、棗仁、附子、菖蒲等中藥組成。復方銀思維是原方精煉優(yōu)化后的有效組分提取物。全方依據中醫(yī)益氣溫陽、開郁化痰治則擬定而成,寓消于補,標本兼治,具有升發(fā)陽氣,祛逐陰邪,開郁化痰、平衡陰陽之功效。

實驗采用國際認可的側腦室注射STZ擬SAD模型。自從Blokland等[8]發(fā)現腦室注射STZ可通過降低海馬神經元ChAt活性而引起大鼠的空間學習記憶能力下降之后,側腦室注射STZ制備SAD模型方面的基礎研究引起了許多學者的興趣。美國de laMonte教授課題組[9]通過側腦室注射STZ的方法阻斷胰島素受體自身磷酸化和內在的酪氨酸激酶活性,損傷胰島素及胰島素樣生長因子(IGF)信號轉導通路,結果發(fā)現,微量的STZ未引起外周血糖升高及胰腺結構和胰島素的免疫活性改變,卻導致腦體積縮小,細胞丟失、神經膠質增生、Aβ沉積增多、tau蛋白過度磷酸化、泛素化等驚人變化,學術界一致認為該模型成功地模擬了SAD的病理特征。STZ擬SAD模型動物在造模后21 d即可出現明顯的學習記憶障礙[10]。近年來,這一模型被廣泛采用作為SAD及“3型糖尿病”模型,用于AD的腦能量代謝及tau磷酸化等方面的研究。

實驗采用的Morris水迷宮系統(tǒng)是由英國心理學家 Morris于20世紀80年代初設計并應用于與海馬功能直接相關的學習記憶腦機制研究的空間學習記憶模型,它能夠較準確地反映動物的空間學習和記憶能力,是目前進行動物行為學測試最為可靠的工具之一。

本實驗結果表明,大鼠側腦室注射鏈脲佐菌素可引起明顯的AD樣空間學習記憶障礙,模型組與假手術組相比有統(tǒng)計學意義;在學習能力測試的定位航行試驗中,復方銀思維提取物小、中、大劑量組均能顯著縮短SAD模型大鼠在Morris水迷宮中找到平臺的游泳時間及總游泳距離;在大鼠記憶保持能力測試的空間探索試驗中,復方銀思維提取物小、中、大劑量組均能顯著延長大鼠在原平臺所在象限的游泳時間,增加其在原平臺附近的活動,提高大鼠搜索目標的策略。復方銀思維提取物小、中、大劑量及西藥多奈哌齊均可提高SAD模型大鼠的空間學習記憶能力,且銀思維大劑量略優(yōu)于西藥多奈哌齊。從腦組織海馬神經元超微結構來看,假手術組大鼠海馬神經元軸突內微管結構完好,排列整齊成束狀。模型組大鼠海馬神經元軸突內微管結構有明顯的斷裂或溶解現象,多數區(qū)域微管消失,排列紊亂。銀思維各治療組大鼠海馬神經元軸突內微管排列整齊,無明顯斷裂溶解,效果最好。側腦室注射STZ很好地模擬了SAD空間學習記憶障礙,銀思維提取物能顯著改善SAD大鼠的學習記憶能力,其作用的超微形態(tài)學基礎與保護微觀結構,防止軸突損害有關。

復方銀思維是中藥有效成分提取物的組合物,其中含大量的人參皂苷。人參皂苷可以上調腦內乙酰膽堿水平和M-膽堿受體數量,提高突觸效能和結構可塑性,抑制細胞的凋亡和壞死,促進海馬的神經發(fā)生,具有良好的促智、抗衰老作用[11]。方中半夏、菖蒲、茯苓等辛開、甘緩類中藥均是中醫(yī)藥治療AD的高頻藥物。推測全方明顯的改善學習記憶作用是上述藥物及其有效成分的協同功效。對其改善SAD學習記憶障礙的深層機制與作用靶點值得進一步深入研究。

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