ROCK抑制劑對腦出血大鼠腦白質(zhì)損傷的影響

劉正姣,李東芳,賈曉濤,羅 崗

腦出血后神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的損傷是影響腦出血患者病情程度及預(yù)后的主要因素。成年動物CNS軸突受損后不能再生的主要原因是CNS髓鞘中含有髓鞘抑制因子,髓鞘抑制因子是通過活化Rho蛋白家族成員之一 RhoA這一共同分子開關(guān)信號通路,引起一系列的反應(yīng),最終導(dǎo)致生長錐的潰變,從而抑制軸突再生。在己辨明的6個RhoA下級分子中,只有ROCK與軸突再生有關(guān),因此,ROCK可能是CNS髓磷脂中各種軸突生長抑制性蛋白發(fā)揮作用的集中點[1]。鹽酸法舒地爾(Fasudil hydrochloride)是目前臨床唯一應(yīng)用的 ROCK選擇性抑制劑[2,3],能通過抑制 ROCK蛋白的表達,抑制Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,從而減輕髓鞘抑制因子和膠質(zhì)疤痕對神經(jīng)再生的抑制。Satoh等[4]研究表明,ROCK抑制劑在缺血性腦卒中能夠抑制腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡,但以往對出血性腦血管病腦損傷的保護作用研究較少。本實驗通過大鼠腦出血模型,應(yīng)用鹽酸法舒地爾進行干預(yù),觀察比較其對腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分、血腫周圍腦組織含水量及腦組織病理變化情況,探討ROCK抑制劑對腦出血后神經(jīng)損傷可能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物和主要試劑 雄性 Wistar大鼠96只,體重250 g±15 g,購于山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室。將其分為3組:假手術(shù)組(n=36)、腦出血組(n=36)、鹽酸法舒地爾治療組(n=24)。假手術(shù)組和腦出血組選6個觀察時點分別為手術(shù)前及手術(shù)后6 h、24 h、48 h、3 d、7 d。鹽酸法舒地爾治療組選4個時點分別為手術(shù)前及手術(shù)后48 h、3 d、7 d。每個時點均為6只動物。鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司;立體定位儀(江灣型)由山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室提供。固綠FCF購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;變色素2R購自上海源葉生物科技有限公司;磷鎢酸購自江西東太科技有限公司。蘇木精、無水乙醇、冰醋酸等常規(guī)試劑由山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲實驗室提供。

1.2 動物模型制作方法及模型成功標準 采用立體定向大鼠自體血注入內(nèi)囊建立模型。模型成功標準,參照Zea Longa 5分制評分標準,大鼠清醒后評分。

1.3 神經(jīng)功能障礙評分 造模成功后運用Bederson[5]大鼠神經(jīng)功能缺損評分方法進行評分?？偡譃?分。

1.4 藥物干預(yù) 按60 kg體重的人鹽酸法舒地爾注射液治療用量90 mg/d與大鼠換算,則大鼠用量為9.45 mg/(kg?d),人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比值為6.3,再將靜脈注射轉(zhuǎn)變?yōu)楦骨蛔⑸錇?11.15～11.81)mg/(kg?d)。治療組于出血后24 h開始給藥,1次/天,直到相應(yīng)時點。ICH組腹腔注射等體積生理鹽水,1次/天,直到相應(yīng)時點。假手術(shù)組手術(shù)過程除不注入自體血外,其余條件同ICH組完全一致。

1.5 血腫周圍腦組織水分含量測定 采用干濕法測定含水量。達相應(yīng)時點處死動物,迅速開顱取血腫周圍組織 2塊(約1 mm3),用萬分之一克精度電子天平(德國Sartorius公司生產(chǎn)BP221s)稱重,然后置于電熱恒溫烤箱,恒溫105℃24 h烤至恒重,后置于干燥密閉容器內(nèi)使其降至室溫。按Elliott公式計算腦組織含水量:含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 標本采集 達相應(yīng)時點處死動物,開顱取出腦組織,甲醛固定,石蠟包埋,切片。行改良三色染色法染色[6]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 3組神經(jīng)功能障礙評分 3組大鼠在入選時神經(jīng)行為評分均小于 1分(P＞0.05)。按Bederson分級評定,術(shù)后各時間點治療組神經(jīng)功能評分均較ICH對照組低(P＜0.05),而較假手術(shù)組明顯高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組在不同時間點的神經(jīng)功能障礙評分(±s)分

表1 各組在不同時間點的神經(jīng)功能障礙評分(±s)分

組別 n 術(shù)前 術(shù)后6 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d假手術(shù)組 36 0.87±0.69 0.89±0.68 0.76±0.57 0.89±0.40 1.06±0.32 0.46±0.39 ICH 對照組 36 0.69±0.53 3.63±1.06 4.44±1.12 4.75±1.31 5.50±1.44 3.88±1.25治療組 24 0.75±0.60 2.11±0.251)2) 2.69±0.371)2) 1.56±0.421)2)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與ICH對照組比較,2)P＜0.05

2.2 3組血腫周圍腦組織含水量變化 治療組血腫周圍含水量較ICH對照組降低(P＜0.05),而較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組不同時間點腦組織含水量(±s)%

表2 各組不同時間點腦組織含水量(±s)%

組別 n 術(shù)前 術(shù)后6 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d假手術(shù)組 36 79.12±0.81 78.07±0.61 78.13±0.82 78.45±0.75 79.06±0.76 77.16±0.21 ICH 對照組 36 78.42±0.53 79.46±0.35 83.47±0.34 83.21±0.56 87.62±0.31 81.32±0.62治療組 24 79.62±0.95 79.86±0.541)2) 82.39±0.601)2) 79.47±0.911)2)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與ICH對照組比較,2)P＜0.05

2.3 病理改變 神經(jīng)軸突呈綠色或藍綠色;神經(jīng)髓鞘呈棗紅色或紫紅色;神經(jīng)元的細胞漿呈藍綠色;細胞核呈紫藍色;紅細胞呈鮮紅色;血管的內(nèi)彈力膜呈綠色;膠原纖維呈綠色。改良三色法顯示腦出血組6 h軸突有不規(guī)則增粗、斷端膨大呈球形、部分髓鞘與軸突之間的間隙增寬,腦出血3 d軸突不規(guī)則增粗、出現(xiàn)收縮球、髓鞘明顯彎曲、不完全地附著在軸突表面,甚至剝脫。腦出血7 d時病理變化不及3 d時明顯。而治療組48 h、3 d、7 d軸突增粗及髓鞘脫失均有明顯改善。

3 討 論

腦出血后血腫周圍也存在一個“半暗帶”,即組織損傷和水腫形成進行性加重的區(qū)域。首先血腫及其腦水腫的壓迫對腦組織造成機械性損害,隨后由于血腫本身演變,釋放凝血酶,膽紅素,Fe2+等毒性物質(zhì)對周圍組織產(chǎn)生毒害作用,以及血腦屏障破壞進一步加重腦水腫,均可對缺血高度敏感和形態(tài)結(jié)構(gòu)特殊的髓鞘和神經(jīng)纖維造成損害,從而引起和加重神經(jīng)功能障礙[7,8],因此腦水腫的產(chǎn)生和發(fā)展是導(dǎo)致患者神經(jīng)功能惡化甚至死亡的主要原因。本研究結(jié)果顯示,術(shù)后各時間點治療組神經(jīng)功能評分及腦組織周圍含水量均較ICH對照組低,而較假手術(shù)組明顯高。病理結(jié)果顯示治療組軸突增粗及髓鞘脫失均較腦出血組有明顯改善,提示法舒地爾的應(yīng)用能夠減輕腦出血后神經(jīng)纖維的損傷,改善神經(jīng)功能,可能有一定的腦保護作用。

改良三色染色法目前是膠原纖維的主要染色方法之一[9],在神經(jīng)纖維的染色中應(yīng)用很少。本實驗采用此方法對腦出血后血腫周圍腦組織進行染色,觀察其結(jié)果能夠同時明確地顯示出軸突和髓鞘的病理變化情況,并且可見到嗜銀染色所顯示的神經(jīng)軸突的病理改變,如軸突不規(guī)則增粗、斷端膨大、出現(xiàn)收縮球等。而且此方法染色時間短,結(jié)果顯示清晰、不易脫片。這表明改良三色法優(yōu)于嗜銀染色[10]。說明此染色方法在神經(jīng)纖維中值得應(yīng)用及進一步研究。

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