MicroRNA-155/FOXO3a在心臟手術(shù)后心房顫動(dòng)患者心房組織中的表達(dá)及與心房纖維化的關(guān)系

冶敦清，祁國(guó)榮，路霖，王黎明

（青海省心腦血管病專科醫(yī)院 心外科，青海 西寧 810000）

心房顫動(dòng)（以下簡(jiǎn)稱房顫）是最常見(jiàn)的持續(xù)性心律失常之一，可引起栓塞和卒中，且致殘和致死率高[1]。隨著我國(guó)人口老齡化加劇，房顫發(fā)病率不斷增加，＞75 歲人群高達(dá)10%[2-3]。房顫常繼發(fā)于風(fēng)濕性心臟瓣膜病，有研究報(bào)道，風(fēng)濕性心臟瓣膜病房顫患者存在明顯心房重塑，其典型表現(xiàn)為心房組織纖維化[4-5]。叉頭框蛋白（FOX）家族是一類廣泛參與細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXO3a 是FOX 家族的重要一員，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡及抗氧化應(yīng)激中起重要作用，其調(diào)控方式眾多，涉及信號(hào)通路亦非常復(fù)雜[6]。有研究報(bào)道，硫化氫鈉后處理可通過(guò)激活PI3K/AKT/FOXO3a/Bim 信號(hào)通路，減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[7]。FOXO3a活性還受到miRNA調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)miR-155 可靶向抑制FOXO3a 表達(dá)，與多種腫瘤及癌癥發(fā)生有關(guān)[8-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在慢性房顫患者右心房中表達(dá)上調(diào)，參與房顫的發(fā)生與維持[11]。然而關(guān)于miR-155/FOXO3a 在心臟手術(shù)后房顫患者心房組織中的表達(dá)及作用鮮有研究。因此本研究擬觀察心臟手術(shù)后房顫患者心房組織中miR-155、FOXO3a表達(dá)水平，并探究其與心房纖維化的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2019年4月青海省心腦血管病?？漆t(yī)院收治的風(fēng)濕性心臟瓣膜病并行心臟手術(shù)治療的患者92 例。根據(jù)患者病史、心電圖及24 h 動(dòng)態(tài)心電圖檢查結(jié)果分為房顫組和竇性心律組，分別為43和49 例。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①心臟瓣膜病并且行心臟瓣膜置換術(shù)；②無(wú)伴發(fā)竇性心律；③有完整心電圖及術(shù)前疾病相關(guān)指標(biāo)檢查資料；④房顫持續(xù)時(shí)間超過(guò)半年；⑤自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①合并高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)性疾??；②嚴(yán)重肝、腎功能不全或心力衰竭；③伴發(fā)惡性腫瘤；④急性感染或不耐受手術(shù)治療。房顫組患者男性26 例，女性17 例；年齡33 ～79 歲，平均（57.64±9.83）歲。竇性心律組患者男性21 例，女性28 例；年齡26 ～78 歲，平均（54.27±10.95）歲。兩組患者年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)審批通過(guò)，樣品采集及資料調(diào)查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)。

1.2 試劑及儀器

Trizol 試劑（貨號(hào)： R0016）、蛋白抽提試劑盒（批號(hào)： P0028）及BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)： P0010S）購(gòu)自上海碧云天有限公司，PrimeScript ?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號(hào)： RR037A）、PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨 號(hào)： 6210A）購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司，引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成，兔源p-FOXO3a 抗體（貨號(hào)： MA5-32164）、FOXO3a 抗體（貨號(hào)： PA1-805）、GAPDH 抗體（貨號(hào)： AM4300）及二抗羊抗兔IgG（貨號(hào)： 15135）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，7500 型qRT-PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，1550P 型心電圖機(jī)購(gòu)自日本光電工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集在心臟外科手術(shù)時(shí)、心臟停跳前分別采集所有患者0.3 ～0.5 cm3右心房組織，除去雜質(zhì)，分3 等份保存，2 份置于液氮中保存?zhèn)溆茫? 份用4%甲醛固定，石蠟切片保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 心房組織miR-155 及FOXO3a mRNA 水平檢測(cè)Trizol法提取心房組織樣品總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用qRT-PCR 檢測(cè)miR-155和FOXO3a mRNA 表達(dá)水平。采用20μl 反應(yīng)體系： TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）10μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4μl，cDNA（50 ng/μl）2μl，正反向引物（10μmol）各0.8μl，ddH2O 6.0μl。反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-??Ct法對(duì)心房組織中miR-155 及FOXO3a mRNA 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 FOXO3a 蛋白水平檢測(cè)采用蛋白抽提試劑盒提取心房組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80℃冰霜冷凍保存?zhèn)溆?。?0 mg 蛋白樣品，80 mV 電壓下6% SDS-PAGE 電泳2 h，250 mA 下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋，加一抗（FOXO3a、p-FOXO3a 抗體1 ∶500；GAPDH 抗體1 ∶500）4℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，20 min/次，用適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1 ∶5 000），室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑顯色，數(shù)字化多功能圖像增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.3.4 心房組織纖維化程度檢測(cè)心房組織切片經(jīng)Masson 染色后于顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍(lán)紫色，肌肉組織呈棕紅色。每張切片隨機(jī)選取8 個(gè)400 倍視野，采用德國(guó)Leica 公司的多功能顯微鏡拍照，自動(dòng)圖像分析處理系統(tǒng)測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)，膠原容積分?jǐn)?shù)=膠原面積/視野面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

兩組年齡、性別、收縮壓、舒張壓及左室射血分?jǐn)?shù)比較，采用χ2/t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組左心房?jī)?nèi)徑、右心房?jī)?nèi)徑比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），房顫組高于竇性心律組。見(jiàn)表2。

表2 兩組基線資料比較

2.2 兩組心房組織纖維化程度比較

經(jīng)Masson 染色后，房顫組心肌組織可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維呈條索狀分割包繞紅棕色心肌細(xì)胞，膠原容積分?jǐn)?shù)為（40.35±5.24）%，竇性心律組心房組織以紅棕色心肌細(xì)胞為主，藍(lán)色膠原纖維較少，膠原容積分?jǐn)?shù)為（14.83±1.72）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.524，P=0.000），房顫組較竇性心律組高。見(jiàn)圖1。

圖1 心房組織病理切片 （Masson 染色×400）

2.3 兩組心房組織miR-155、FOXO3a mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

兩組心房組織miR-155、FOXO3a mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），竇性心律組miR-155 低于房顫組，F(xiàn)OXO3a mRNA 高于房顫組。見(jiàn)表3。

表3 兩組心房組織miR-155、FOXO3a mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 兩組心房組織miR-155、FOXO3a mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 n miR-155 FOXO3a mRNA竇性心律組 49 1.13±0.12 1.06±0.18房顫組 43 3.58±0.54 0.49±0.10 t 值 30.923 30.346 P 值 0.000 0.000

2.4 兩組心房組織FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

兩組心房組織p-FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），房顫組低于竇性心律組。兩組心房組織FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

表4 兩組心房組織FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 兩組心房組織FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 n FOXO3a 蛋白 p-FOXO3a 蛋白竇性心律組 49 0.92±0.06 1.12±0.08房顫組 43 0.91±0.07 0.47±0.05 t 值 0.738 45.964 P 值 0.463 0.000

圖2 心房組織FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白的表達(dá)

2.5 心房組織miR-155、p-FOXO3a 蛋白水平與心房纖維化程度的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，房顫組心房組織miR-155 與p-FOXO3a 蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.485，P=0.000），與膠原容積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（r=0.490，P=0.000），心房組織p-FOXO3a 蛋白水平與膠原容積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.471，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

圖3 房顫患者心房組織miR-155、FOXO3a 蛋白與心房纖維化程度的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

FOXO3a 是FOXO 家族中的亞族，廣泛參與機(jī)體多種病理生理過(guò)程。FOXO3a 發(fā)生磷酸化可抑制FOXO3a 活性及其對(duì)靶基因的調(diào)控。周波等[7]研究報(bào)道，F(xiàn)OXO3a 可參與缺血再灌注損傷心肌損傷過(guò)程，激活PI3K/Akt 信號(hào)通路可使FOXO3a 發(fā)生磷酸化，并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，減輕心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)可降低其下游蛋白表達(dá)。miR-155 是一個(gè)重要的心肌功能調(diào)控miRNA，徐黎青等[12]研究報(bào)道，烏司他丁可通過(guò)抑制體外循環(huán)心臟手術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-155 表達(dá)水平，抑制TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎和心肌保護(hù)作用。WANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，接受消融術(shù)后房顫患者血清miR-155水平較術(shù)前較低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與竇性心律組比較，房顫組患者心房組織中miR-155 相對(duì)表達(dá)量較竇性心律組高，F(xiàn)OXO3a mRNA 及p-FOXO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量較竇性心律組低，且miR-155 與p-FOXO3a蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155 可能通過(guò)抑制FOXO3a mRNA 及p-FOXO3a 蛋白表達(dá)，影響房顫發(fā)生。

房顫發(fā)生與維持的關(guān)鍵是心房重塑，包括結(jié)構(gòu)重塑和電重塑。其中心房結(jié)構(gòu)重塑包括心房直徑擴(kuò)大、肌間質(zhì)改變和肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變[14-16]。HAN 等[17]研究報(bào)道，左心房直徑每增加5 mm，房顫發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加1.4 倍。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與竇性心律患者比較，房顫患者左右心房?jī)?nèi)徑均增大，提示心房直徑擴(kuò)大可能與房顫發(fā)生密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。房顫患者心房結(jié)構(gòu)重塑最突出特點(diǎn)為心房纖維化。心房纖維化即異常膠原纖維在正常心房肌間質(zhì)中沉積，使正常心房肌間質(zhì)中膠原纖維含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致心肌間質(zhì)中不同類型的膠原蛋白比例失調(diào)、膠原纖維排列紊亂[19]。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及半定量檢測(cè)膠原蛋白結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與竇性心律患者比較，房顫患者心房組織膠原容積分?jǐn)?shù)升高，提示房顫患者心房存在不同程度纖維化病變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，心房組織miR-155 水平與膠原容積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，p-FOXO3a 蛋白水平與膠原容積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155 可能通過(guò)抑制p-FOXO3a 蛋白水平表達(dá)與房顫患者心房纖維化，共同影響房顫的發(fā)生與維持。

綜上所述，心臟手術(shù)后房顫患者心房組織中miR-155 高表達(dá)，p-FOXO3a 蛋白低表達(dá)，均與心房纖維化程度有關(guān)，共同影響房顫的發(fā)生與維持。但由于本研究樣本量少，后期應(yīng)加大樣本量深入探究。