利川市藤茶黃酮成分研究

李宇　劉翠君　艾倫強　張宇　盧新鵬　何美軍　冉亞蘭

摘要：從湖北省利川市齊岳山（海拔1 500～1 600 m）采集藤茶（Ampelopsis grossedentata）樣品，采用60%乙醇超聲提取總黃酮，利用紫外可見光分光光度計雙波長（λ=208.4 nm，λ=293.2 nm）檢測藤茶幼嫩莖尖總黃酮，平均含量高達453.67±11.26 mg/g;利用硅膠柱色譜及半制備高效液相分離到3個化合物，利用LC-HR-ESIMS、1D和2D NMR波譜數(shù)據(jù)進行分析，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為二氫楊梅素（1）、楊梅素（2）和花旗松素（3）;通過高效液相（HPLC）檢測分析發(fā)現(xiàn)，利川市藤茶樣品中二氫楊梅素、楊梅素和花旗松素的含量為別186.31±10.43、13.83±1.32、14.76±2.26 mg/g。

關(guān)鍵詞：藤茶（Ampelopsis grossedentata）;總黃酮;二氫楊梅素;楊梅素;花旗松素;利川市

中圖分類號：S571.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）04-0098-04

Abstract： The total flavonoids were extracted by 60% ethanol-ultrasound from the samples of Ampelopsis grossedentata collected from Qiyueshan mountain （1 500～1 600 m），Lichuan city， Hubei province. The total flavonoids in the young tips of Ampelopsis grossedentata was up to 453.67±11.26 mg/g detected by ultraviolet-visible spectrophotometer at the double-wavelength （λ=208.4 nm，λ=293.2 nm）. Three compounds were purified from the organic extract using LC-HR-ESIMS，1D and 2D NMR spectral data analysis. Their structures were identified to be dihydromyricetin（1）， myricetin（2），and taxifolin（3）. The contents of dihydromyricetin， myricetin and taxifolin were 186.31±10.43， 13.83±1.32 and 14.76±2.26 mg/g respectively detected by HPLC.

Key words： Ampelopsis grossedentata; total flavonoids; dihydromyricetin; myricetin;taxifolin; Lichuan city

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物，其母核結(jié)構(gòu)是由2個苯環(huán)（A環(huán)和B 環(huán)）與3個碳原子橋連所形成的C6-C3-C6化合物[1]。由于多數(shù)黃酮類化合物分子中存在A環(huán)和B 環(huán)與C3碳原子橋上的雙鍵組成的交叉共軛體系，在紫外吸收區(qū)域內(nèi)存在2個主要的峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ，其峰形可初步判斷黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)特征。累計已超過9 000個黃酮類化合物在植物中被發(fā)現(xiàn)，成為天然產(chǎn)物中最大家族之一[2]。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗炎、保護心臟、抗糖尿病、抗癌、抗衰老等多種生理活性[3-5]。

湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所天然產(chǎn)物科室從湖北省利川市齊岳山（海拔1 500～1 600 m）采集藤茶（Ampelopsis grossedentata）樣品，藤茶為葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬（Ampelopsis Michx.）植物。藤茶粗提取物（VTE）具有抗氧化、抗炎、保護肝臟、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗糖尿病、降血脂等多種生理功能[6-8]。本試驗采用乙醇溶液超聲提取藤茶總黃酮，利用紫外可見分光光度計雙波長檢測藤茶幼嫩莖尖總黃酮含量;利用硅膠柱色譜及半制備高效液相色譜分離化合物，利用LC-HR-ESIMS、1D和2D NMR波譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu);通過高效液相（HPLC）檢測分析其含量，以期為藤茶多糖的開發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

藤茶樣品是從湖北省利川市齊岳山（海拔? ? ?1 500～1 600 m）采集，由湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所鑒定。

Bruker AV700超導核磁共振波譜儀（700/175 MHz，TMS為內(nèi)標），Agilent 1260型高效液相色譜儀（配DAD檢測器），UV-1800型島津紫外可見光分光光度計，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，Phenomenex色譜柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）;Agilent Poroshell反相色譜柱120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）;HS-GF254硅膠薄層板;J & K色譜純乙腈;黃酮化合物化合物標準品二氫楊梅素[（2R，3R）-Dihydromyricetin]、楊梅素和花旗松素均購自于阿拉丁試劑公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 藤茶乙醇提取物的獲得? 將恩施藤茶和西安藤茶打成粉末，共重710.31 g，用35.5 L的60%乙醇萃取，60%乙醇溶液浸泡18 h，500 W超聲提取30 min，取上清液過濾，取濾液旋蒸，得到浸膏200.27 g。

1.2.2? 藤茶乙醇提取物總黃酮檢測? 選用雙波長檢測藤茶總黃酮含量[9]，取乙醇提取浸膏，用乙醇稀釋1×104倍備用，選用島津紫外可見分光光度計（UV-1800），檢測器設(shè)置波長掃描范圍為190～700 nm，獲得待測藤茶稀釋樣品的吸收波峰。對比分析確認藤茶樣品提取液中的物質(zhì)主要為黃酮類化合物。選擇檢測波長分別為208.4、293.2 nm，繪制二氫楊梅素的標準曲線，測定各樣品黃酮化合物的含量。將標準品二氫楊梅素分別設(shè)置5個濃度梯度，并編號為standard 1、standard 2、standard 3、standard 4、standard 5，如表1所示。利用UVProbe 2.42 軟件繪制校正曲線，計算樣品濃度，再設(shè)置標準品加樣回收試驗，計算回收率，以保證試驗方法的可靠性。

1.2.3? 藤茶乙醇提取物化合物的分離鑒定? 藤茶乙醇提取物浸膏用硅膠柱進行分離，以石油醚/乙酸乙酯體系（100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100，V/V）和乙酸乙酯/甲醇體系（80∶20、50∶50、0∶100，V/V）洗脫，得到8個組分Fr.A1～Fr.A40。根據(jù)HPLC和TLC分析結(jié)果，將Fr.A25～Fr.A28合并正向硅膠分離，以氯仿/甲醇體系（100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、80∶20，V/V）洗脫，得到10個組分Fr.B1～Fr.B10。根據(jù)HPLC分析，經(jīng)半制備HPLC、ODS色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）分離Fr.B5，以CH3CN/H2O（15∶85至100∶0，V/V）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物3（tR=21.7 min，10 mg）。將組分Fr.A6、Fr.A7合并，經(jīng)半制備HPLC、ODS色譜柱分離，以CH3CN/H2O（15∶85至45∶55，V/V）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物1（tR=11.5 min，30 mg）和化合物2（tR=15.3 min，12 mg）。

1.2.4? 藤茶乙醇提取物黃酮類化合物含量的測定? 利用高效液相外標法測定藤茶各黃酮化合物的含量。將標準品二氫楊梅素、楊梅素和花旗松素分別設(shè)置6個濃度梯度，配制成6組混標樣品，高效液相數(shù)據(jù)處理軟件外標法繪制校正曲線，計算樣品濃度，再設(shè)置加樣回收試驗，計算回收率，以保證試驗方法的可靠性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 藤茶乙醇提取物紫外吸收光譜

用島津紫外可見分光光度計檢測藤茶樣品，藤茶樣品在波長510.4 nm處有最大吸收峰。選擇檢測波長為208.4、293.2 nm雙波長檢測藤茶樣品，利用UVProbe 2.42軟件繪制繪制二氫楊梅素標準品的校正曲線，方程為（x為Abs，y為濃度）：y=0.051 64x-0.009 13（r2=0.999 58）。

2.2? 藤茶乙醇提取物的總黃酮含量

采集于利川市齊岳山的3個藤茶樣品MDB1、MDB2、MDB3總黃酮類化合物含量分別為441.0±4.5、480.0±15.5和440.0±14.0 mg/g，檢測到利川藤茶幼嫩部位干重總黃酮含量≥40%（表2），是已知報道的植物中總黃酮含量最高的物種之一。

2.3? 藤茶乙醇提取物黃酮類化合物的鑒定及含量測定

藤茶乙醇提取物黃酮類化合物鑒定結(jié)果表明，化合物1為白色無定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 321.1出現(xiàn)[M+H]+峰?；衔?的UV吸收光譜在218.7、292.5 nm處顯示2個最大吸收波長，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)。1H NMR譜表明，該化合物含4個芳香質(zhì)子（2個δH 6.51、1個δH 5.84、1個δH 5.87），苯環(huán)上的2個芳香質(zhì)子δH 5.84、δH 5.87耦合，耦合常數(shù)為J=13.2 Hz，說明2個鄰位或者間位。2個連氧次甲基質(zhì)子（δH 4.44，δH 4.84），耦合常數(shù)為J=11.2 Hz，說明2個鄰位C上。13C NMR譜給出12個芳碳信號（C 96.4～C 168.7），其中除2個C 108.2（C-11、C-15）是苯環(huán)對稱位置的非連氧芳碳，其余全是連氧碳。另有2個連氧次甲基碳（C 73.7、C 85.2）、1個羧基碳（δC 198.3）。結(jié)合化合物1的DEPT135譜信息推測，有6個季碳原子（C 73.7、C 85.2、C 96.4、C 97.5、C 108.2、C 108.2），其余全為叔碳。化合物1的1H和13C NMR化學位移值與文獻[10]報道的二氫楊梅素的核磁譜相近，推斷該化合物為二氫楊梅素。

鑒定結(jié)果中，化合物2為綠色無定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 319.0出現(xiàn)[M+H]+峰。化合物1的UV吸收光譜在210.2、260.6、379.0 nm處顯示3個最大吸收波長，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)。化合物2的1H及13C NMR數(shù)據(jù)與化合物1數(shù)據(jù)相似（表1），說明化合物2是黃酮類化合物。與化合物1相比，C-8=73.7，C-9=85.2化學位移值移動到低場C-8=136.9、C-9=146.9。結(jié)合化合物2的DEPT135譜信息推測，2個季碳原子（C 73.7、C 85.2）的氫被取代，C8、C9形成雙鍵?；衔?的1H和13C NMR化學位移值與文獻[11]報道的楊梅素的核磁譜相近，推斷該化合物為楊梅素。

鑒定結(jié)果表明，化合物3為綠色無定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 305.1出現(xiàn)[M+H]+峰?；衔?的UV吸收光譜在211.5、290.4 nm處顯示2個最大吸收波長，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)?；衔?的1H及13C NMR數(shù)據(jù)與化合物1數(shù)據(jù)相似（表3），說明化合物3是黃酮類化合物。與化合物1相比，C-15=108.6化學位移值移動到低場C-15=121.1，結(jié)合化合物3的DEPT135譜信息推測，C-15的-OH被-H取代。C15-H與鄰位C16-H耦合，耦合常數(shù)為J=11.6 Hz。化合物3的1H和13C NMR化學位移值與文獻[10]報道的Taxifolin的核磁譜相近，推斷該化合物為花旗松素（Taxifolin）。

試驗分離到的3個黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

2.4? 藤茶乙醇提取物黃酮類化合物含量測定

利用高效液相外標法測定利川市各黃酮化合物的含量：二氫楊梅素為186.31±10.43 mg/g、花旗松素為14.76±2.26 mg/g、楊梅素為13.83±1.32 mg/g。設(shè)置加樣回收試驗，計算回收率，如表4所示。3種黃酮類化合物的回收率分別為91.36%、93.26%、92.52%。

3? 小結(jié)

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，利川市產(chǎn)區(qū)藤茶幼嫩莖尖總黃酮平均含量高達453.67±11.26 mg/g，是已知所有植物種類中總黃酮含量最高的物種之一。從藤茶幼嫩莖尖乙醇提取物中分離鑒定了3個化合物：二氫楊梅素（1）、楊梅素（2）和花旗松素（3），并測定藤茶幼嫩莖尖中3種化合物的含量分別為186.31±10.43、13.83±1.32、14.76±2.26 mg/g。研究表明，二氫楊梅素具有抗氧化、抗神經(jīng)炎癥、神經(jīng)保護、抗老年癡呆癥、抗菌、抗癌等多種生理活性[12]。楊梅素具有抗炎、抗糖尿病和抗癌的作用[13]?；ㄆ焖伤鼐哂锌寡趸⒖寡?、保護心血管、保護肝臟、抗老年癡呆癥、抗菌和抗癌等多種生理活性[14]。目前，尚無關(guān)于藤茶植物體內(nèi)黃酮類化合物的次級代謝途徑以及二氫楊梅素的大量積累機制的報道，后續(xù)將通過藤茶次級代謝產(chǎn)物分離鑒定和轉(zhuǎn)錄組測序，進一步研究其黃酮類化合物的次級代謝途徑以及二氫楊梅素的大量積累機制。

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