分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林

曾軍杰 張小軍 陳頁

摘要 [目的]建立一種同時(shí)測定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林農(nóng)藥殘留的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。[方法]樣品經(jīng)乙腈進(jìn)行提取，PSA為吸附劑進(jìn)行分散固相萃取凈化，C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分離，水溶液（含0.05%甲酸、5 mmol/L乙酸銨）∶乙腈=（85∶15）為初始流動相，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）定性定量分析。[結(jié)果]添加樣品的回收率為82.5% ～95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0% ～11.2%，最低檢出限為0.1 μg/kg。[結(jié)論]該方法精密度、靈敏度、回收率均能滿足水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林的快速分析測定。

關(guān)鍵詞 分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;水產(chǎn)品;泰妙菌素;沃尼妙林

中圖分類號 O657.6;TS254.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）10-0164-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.044

Abstract [Objective] The research aimed to establish a dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS） for the simultaneous determination of tiamulin and valnemulin residues in aquatic products.[Method]The samples were extracted by acetonitrile，purified by PSA as adsorbent，separated by C18 column （2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），water solution（0.05% formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate）∶acetonitrile=（85∶15） as the initial mobile phase，and analyzed by UPLCMS/MS.[Result]The recovery rate of the added sample was 82.5%-95.4%，the relative standard deviation was 3.0%-11.2%，and the detection limit of this method was 0.1 μg/kg.[Conclusion]The precision，sensitivity and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of tiamulin and valnemulin in aquatic products.

Key words Dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS）;Aquatic products;Tiamulin;Valnemulin

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20世50年代，學(xué)者從高等真菌Pleurotus multilus（Fr.）Sacc.和P.passecke-rianus Pilat中提取截短側(cè)耳素，這是具有抗菌活性的雙萜類化合物，它包括一個(gè)含有8個(gè)手性碳原子的5-6-8三元環(huán)骨架和一個(gè)乙醇酸酯側(cè)鏈[1]。泰妙菌素、沃尼妙林是經(jīng)過化學(xué)修飾后，具有很強(qiáng)抗耐藥菌活性的截短側(cè)耳素類藥物，最早用于防治革蘭氏陽性細(xì)菌、支原體等疾病的。泰妙菌素和沃尼妙林具有抗菌譜廣、毒性小等特點(diǎn)，對生殖支原體、豬密螺旋體以及水產(chǎn)品都有良好的抗菌性[2]。研究表明，少量使用泰妙菌素和沃尼妙林，能夠促進(jìn)水產(chǎn)品的生長，減少病蟲害的危害。但是在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，存在著濫用泰妙菌素和沃尼妙林的現(xiàn)象，大量地使用泰妙菌素和沃尼妙林會使水產(chǎn)品體內(nèi)蓄積并導(dǎo)致無法完全代謝，最終通過水產(chǎn)品消費(fèi)進(jìn)入人體并帶來潛在危害[3-5]。我國農(nóng)業(yè)部235公告中對豬、兔、雞中泰妙菌素的殘留作出了嚴(yán)格的規(guī)定，但對水產(chǎn)品中的泰妙菌素和沃尼妙林還未有明確限量規(guī)定。因此建立一種方便、有效、準(zhǔn)確的檢測方法極為重要，以便研究水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林的給藥量和休藥期。

目前據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，泰妙菌素和沃尼妙林的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-10]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[11-15]等，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法擁有超高效液相快速、有效的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的精準(zhǔn)靈敏度，是一種快速發(fā)展的分析技術(shù)[16]。將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與國際上通用的分散固相萃取技術(shù)[17]相結(jié)合，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)，可以真正實(shí)現(xiàn)多種獸藥殘留的快速檢測。 筆者使用分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測方法，實(shí)現(xiàn)了泰妙菌素和沃尼妙林等獸藥殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：泰妙菌素、沃尼妙林（純度均>98%），美國Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨，色譜純，德國Merck公司;PSA（粒徑50 μm）、氨水（分析純），上海國藥集團(tuán)。

準(zhǔn)確稱取泰妙菌素和沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用甲醇溶解定容至50 mL，配成20 μg/mL的中間使用液，于-18 ℃下避光保存待用。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM 超高效液相色譜儀、XEVO TQS三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司;ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美國Waters公司;N-EVAP-112氮吹儀，美國Organomation公司;3-30K 高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司;MX-S 渦旋攪拌器，美國Scilogex公司。

1.3 UPLC-MS/MS條件

1.3.1 色譜條件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ?℃;進(jìn)樣量5 μL;流動相：A為水溶液（含0.05%甲酸、5 mmol/L乙酸銨），B為乙腈;流速0.25 mL/min;洗脫條件：0～0.5 min，15% B;0.5～1.5 min，15%～65% B;1.5～4.0 min，65% B;4.0～4.5 min，65%～15% B;4.5～5.0 min，15% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子模式;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;干燥氣體流速800 L/h;碰撞池壓力0.3 Pa。泰妙菌素和沃尼妙林的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取。取已均質(zhì)魚肉1.0 g于50 mL離心管中，加10 mL乙腈超聲提取10 min，取出恢復(fù)至室溫，6 000 r/min離心5 min，全部上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管。重復(fù)以上操作提取一次，合并后加乙腈至25 mL，待凈化。

1.4.2 凈化。取乙腈提取液10 mL于預(yù)先加有PSA 30 mg的離心管中，渦旋2 min，隨后6 000 r/min離心5 min。

1.4.3 濃縮、轉(zhuǎn)溶。吸取5 mL上清液于40 ℃下氮吹，用1.0 mL 流動相A∶B=（ 8.5∶1.5，V∶V）溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，UPLC-MS/MS上機(jī)檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以10 μL/min 的流速進(jìn)入離子源，在ESI+離子化模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，對毛細(xì)管電壓和錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定泰妙菌素和沃尼妙林的錐孔電壓分別為32和12 V。用二級質(zhì)譜將母離子擊碎，選取經(jīng)碰撞后響應(yīng)值最高的2個(gè)子離子分別為定量離子和定性離子，并調(diào)查碰撞能量大小，使母離子與子離子響應(yīng)值達(dá)到最佳響應(yīng)值。泰妙菌素和沃尼妙林的二級質(zhì)譜圖如圖1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化 該試驗(yàn)以ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為2種化合物的色譜分析柱，分別選擇乙腈-水、甲醇-水、水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸銨）-乙腈體系以及水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸銨）-甲醇體系作為流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但乙腈作為有機(jī)相時(shí)峰形比甲醇好，響應(yīng)值高，同時(shí)在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨，改善了被待測物質(zhì)的峰形，這是由于有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽提高了他們的分離度和離子化效率，圖2為待測物質(zhì)的MRM圖。

2.3 前處理優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化。泰妙菌素、沃尼妙林極性偏弱，且易溶于甲醇、乙醇和水等溶劑。試驗(yàn)選取乙腈、丙酮、乙酸乙酯和甲醇4種提取溶劑進(jìn)行比較，4種溶劑提取效率如圖3所示。

試驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取，泰妙菌素回收率較好（91.5%），但對沃尼妙林提取回收率較低（83.1%），且部分油脂被萃取到提取液中，對（UPLC-MS/MS） 儀器響應(yīng)值有明顯的抑制作用。乙腈提取2種物質(zhì)回收率（泰妙菌素88.3%、沃尼妙林86.4%）都高于甲醇和丙酮，且受基質(zhì)影響較小，故選擇乙腈超聲10 min，提取2次保證提取率的最大化。

2.3.2 凈化條件的選擇。

目前，在對泰妙菌素和沃尼妙林報(bào)道的已有文獻(xiàn)中，多以HLB、C18等SPE凈化柱為主，且活化所用磷酸鹽緩沖液所造成的酸性環(huán)境可能會造成待測藥物的損失[18]。該試驗(yàn)以分散固相萃取為前處理方式，對HLB、MAX這2種凈化柱和PSA、C18進(jìn)行對比，凈化效果見圖4。

結(jié)果表明，弱陽離子（HLB、C18）等SPE柱凈化回收率一般，弱陰離子（MAX）可能因?yàn)閷μ┟罹亍⑽帜崦盍值奈叫阅茌^強(qiáng)，導(dǎo)致回收率降低。PSA能夠去除樣品中的脂肪酸、糖類物質(zhì)等不同雜質(zhì)，對泰妙菌素和沃尼妙林的吸附作用較小，平均回收率高于SPE的方法，并且凈化效果明顯，故選取PSA比較合適。

2.3.3 吸附劑使用量的優(yōu)化。

分別將10、20、30、40、50、60、70和80 mg的PSA用于凈化試驗(yàn)，比較PSA不同使用量的凈化效果，結(jié)果表明（圖5），當(dāng)PSA用量為10～20 mg時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)回收率在106.2%～112.3%，分析原因可能是PSA使用量太少，樣品中殘有脂肪酸和糖類等物質(zhì)，基質(zhì)干擾物未除完全，對目標(biāo)分子產(chǎn)生基質(zhì)作用。當(dāng)使用量在30～50 mg，回收率趨于平穩(wěn)，在80%左右，此時(shí)PSA使用量足夠吸附雜質(zhì)，且對目標(biāo)物質(zhì)回收率無較大干擾。當(dāng)PSA使用量繼續(xù)增大，回收率開始較低，分析原因可能PSA中氨基游離出來，與目標(biāo)物質(zhì)中某些基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。綜上所述，選擇PSA的使用量為30 mg，既保證了凈化后樣品的純凈，又避免樣品在凈化過程中過量損失。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 檢出限、定量限及線性關(guān)系。

取鯽魚空白樣品，按照“1.4”的前處理方法，得到空白基質(zhì)溶液，配成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以待測物質(zhì)的峰面積（y）和相應(yīng)的濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)7個(gè)空白樣品的基線噪音求其平均值，按3倍信噪比計(jì)算其方法檢測限（LOD），10倍信噪比計(jì)算其方法定量限（LOQ）。2種化合物的線性方程、檢出限和定量限見表2。

2.4.2 回收率和精密度。

通過加標(biāo)回收試驗(yàn)來評價(jià)方法的準(zhǔn)確性、精密度和回收率。在前處理前，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到1 g草魚基質(zhì)中，然后按照“1.4”方法進(jìn)行前處理。 其中，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液分為1.0、2.0、5.0 ng/mL這3個(gè)水平，每個(gè)平行測定6次。分析結(jié)果見表3，測得回收率為82.5%～95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤9.1%，由此表明該方法重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性好，精密度、回收率高，能夠滿足日常檢測的要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測

用2 mg/L的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液連續(xù)藥浴60條鯽魚14 d。利用已建立的方法進(jìn)行鯽魚體內(nèi)泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6）鯽魚的各個(gè)組織中均能檢測到泰妙菌素和沃尼妙林的殘留。表明該研究方法能夠同時(shí)測定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時(shí)測定泰妙菌素和沃尼妙林的分析方法，通過儀器條件、提取方式和PSA凈化條件的優(yōu)化，提高試驗(yàn)效率，該方法的檢出限為0.1 μg/kg，回收率在82.5% ～95.4%，方法學(xué)評價(jià)表明該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)，而且檢出限、定量限以及回收率均能滿足水產(chǎn)品質(zhì)量檢測要求的優(yōu)點(diǎn)，加強(qiáng)了分散固相萃取前處理方式在水產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用。

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