藏藥西伯利亞蓼降尿酸活性部位篩選及HPLC分析

朱繼孝 王陸 鐘國(guó)躍

摘要 [目的]研究藏藥西伯利亞蓼不同部位降尿酸活性，并采用HPLC法進(jìn)行分析檢測(cè)。[方法]以氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)建立小鼠急性高尿酸血癥模型，連續(xù)灌胃給予西伯利亞蓼水部位（2.0、4.0 g/kg）、30%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、50%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）、90%乙醇部位（2.0、4.0 g/kg）及別嘌呤醇（AP，0.01 g/kg）7 d，探討西伯利亞蓼不同部位對(duì)急性高尿酸血癥血尿酸（UA）、肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）活性及尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（mURAT1、mGLUT9 和mOAT1）mRNA表達(dá)的影響，并對(duì)不同部位進(jìn)行HPLC分析。[結(jié)果]與模型組相比，AP以及30%、50%、90%乙醇部位顯著降低高尿酸血癥的血尿清水平;50%、90%乙醇部位既可以抑制黃嘌呤氧化酶活性又可以調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá);30%乙醇部位僅對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有調(diào)控作用;不同部位HPLC圖顯示除了30%、50%乙醇部位化學(xué)成分有重疊，西伯利亞蓼不同部位化學(xué)成分差別較大。[結(jié)論]30%、50%、90%乙醇部位是西伯利亞蓼的降尿酸的活性部位，其作用機(jī)制為抑制XOD活性和調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá);西伯利亞蓼不同部位HPLC圖有一定的差別，為探討西伯利亞蓼不同部位降尿酸藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 西伯利亞蓼;降尿酸;活性部位;篩選;HPLC;作用機(jī)制

中圖分類號(hào) R282.71 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）10-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.038

Abstract [Objective] The research aimed to study the lowering uric acid activity of different parts of Polygonum sibiricum， and to analyze and detect it by HPLC.[Method]Water fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 30% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 50% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg）， 90% ethanol fractions （2.0， 4.0 g/kg） and allopurinol （AP， 0.01 g/kg） were administered to hyperuricemia mice induced by potassium oxonate for seven days. The level of uric acid （UA） and xanthine oxidase （XOD） on different fractions were analyzed and the mRNA express of renal protein transporter （mOAT1， mURAT1 and mGLUT9） were also studied. The different parts of P. sibiricum were analyzed by HPLC. [Result]Compared with the model group， AP and 30%， 50%， 90% ethanol fractions of P. sibiricum obviously lowered the serum UA levels; 50% and 90% ethanol fractions not only inhibited the activity of XOD， but also regulated the expression of uric acid transporter; 30% ethanol fractions only regulated the uric acid transporter.The HPLC chart of different parts showed that the chemical constituents of different fractions were obvious distinctions except for the overlap of 30% and 50% ethanol fractions. [Conclusion]30%， 50% and 90% ethanol fractions are effective fractions of P. sibiricum and its mechanism is to inhibit XOD activity and regulate the expression of uric acid transporters. The HPLC images of different parts have certain differences， which provide a basis for exploring the physiochemical discussion for the reduction of uric acid.

Key words Polygonum sibiricum;Lowering uric acid;Active site;Screening;HPLC;Mechanism of action

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在普通人群中，痛風(fēng)患病率在全球范圍內(nèi)為0.1%～10.0%，其中老年人、男性的發(fā)病率偏高[1]?，F(xiàn)有治療痛風(fēng)藥物主要有別嘌呤醇、苯溴馬隆等[2]，但由于副作用較多，患者難以長(zhǎng)期服用和耐受[3]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。因此，亟需開發(fā)高效低毒、作用機(jī)制新穎、價(jià)格相對(duì)低廉的抗痛風(fēng)藥物。

基于“相生相克”的中醫(yī)理論，國(guó)內(nèi)外學(xué)者考慮從傳統(tǒng)中藥，或是民族藥中尋找有效的抗痛風(fēng)藥物。中藥包括民族藥治療痛風(fēng)、高尿酸血癥備受關(guān)注，取得了一些進(jìn)展[4]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)多種草藥單方或復(fù)方提取物進(jìn)行了抗痛風(fēng)活性研究，如短管兔耳草[5]、三妙丸[6]、丹溪痛風(fēng)方[7]、梔子[8]、車前草[9]、黃柏[10]、唐古特大黃[11]、茶樹根[12]、荬麻藤[13]、貓須草[14]等，其作用機(jī)制涉及到降尿酸的生成和促進(jìn)尿酸排泄2種作用機(jī)制。由此可見，從中藥甚至民族藥中尋找抗痛風(fēng)藥物具有潛在的研究前景。

藏藥西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）是蓼科（Polygonaceae）蓼屬植物多年生草本，主要分布于蒙古、俄羅斯、西藏、東北、華北等地，具有疏風(fēng)清熱、利水消腫的功效，目前鮮見西伯利亞蓼的藥理研究。王曉云等[15]研究發(fā)現(xiàn)西伯利亞蓼 70%乙醇總提取物具有降尿酸作用，但其有效部位尚不清楚?；诖?，該研究采用高尿酸血癥模型研究西伯利亞蓼不同部位降尿酸作用，并對(duì)不同部位進(jìn)行高效液相分析比較，為西伯利亞蓼的開發(fā)及利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

110只昆明種小鼠，雄性，SPF級(jí)，從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，整個(gè)試驗(yàn)保持在室溫23～25 ℃。

1.1.2 試驗(yàn)儀器。

CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司;傅日PCR儀，杭州博日科技有限公司;電熱恒溫箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;UV2100 紫外可見分光光度儀，北京瑞利分析儀器公司;Biorad凝膠成像儀，美國(guó)伯樂有限公司;CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布奇有限公司;RORMA-86C 型超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司。

1.1.3 藥品及試劑。

氧嗪酸鉀鹽（批號(hào)STBD5759V）和別嘌呤醇（批號(hào)081M1112V）由Sigma-Aldrich生產(chǎn);尿酸測(cè)定試劑盒（20150428）、黃嘌呤氧化酶測(cè)試盒（20151210）、考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒（20151208）由南京建成生物工程研究所生產(chǎn);總RNA 提取試劑盒（批號(hào)N3205）由天根生化科技（北京）有限公司提供;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)0000123564）由美國(guó)Promega 公司提供;尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體引物購買于天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 試材。

藏藥西伯利亞蓼于2013年10月采自西藏昌都，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國(guó)躍研究員鑒定為Polygonum sibiricum Laxm的干燥全草。藏藥西伯利亞蓼藥材用70%乙醇提取，過D101大孔樹脂不同梯度洗脫得到4個(gè)部位：水部位（FW，450.0 g）、30%乙醇部位（F30%，30.0 g）、50%乙醇部位（F50%，45.0 g）、90%乙醇部位（F90%，12.0 g），各部位的提取率分別為15.0%、1.0%、1.5%、0.4%[16]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組、造模及給藥。

將110只小鼠隨機(jī)分為11組，每組10只，分別為空白組（N）、模型組（急性高尿酸血癥組，M）、陽性對(duì)照組（別嘌呤醇組，AP）、水部位低劑量組（FWL）、水部位高劑量組（FWH）、30%乙醇部位低劑量組（FL30%）、30%乙醇部位高劑量組（FH30%）、50%乙醇部位低劑量組（FL50%）、50%乙醇部位高劑量組（FH50%）、90%乙醇部位低劑量組（FL90%）、90%乙醇部位高劑量組（FH90%）。趙雪梅等[14]研究西伯利亞蓼總提物降尿酸發(fā)現(xiàn)，西伯利亞蓼低、中、高劑量組均可顯著降尿酸作用，因此該研究西伯利亞蓼給藥劑量仍按生藥量計(jì)算，不同部位低、高劑量組給藥劑量分別為2.0、4.0 g/kg，別嘌呤醇給藥劑量為0.01 g/kg，每天08：00灌胃給予模型組及各給藥組氧嗪酸鉀鹽 250 mg/kg，1 h后給予藥物，連續(xù)給藥7 d，每天一次，空白組和模型組分別灌入相應(yīng)體積的生理鹽水，給藥劑量均為15 mL/kg，第7天給藥1.0 h后按照文獻(xiàn)[5]取血和分離肝臟、腎臟。

1.2.2 血清尿酸水平（UA）和尿素氮（BUN）測(cè)定。按照尿酸和尿素氮試劑盒說明方法測(cè)定。

1.2.3 肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性測(cè)定。將小鼠肝臟組織稱重，按照文獻(xiàn)方法[8，14]測(cè)定蛋白含量及XOD活性。

1.2.4 腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（mURAT1、mGLUT9和mOAT1）mRNA 的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)[5，15]測(cè)定腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 URAT1、OAT1和GLUT9的mRNA表達(dá)：取腎臟皮質(zhì)組織0.1 g，按照試劑盒方法，TRIzol 法提取總 RNA。加入引物序列分別為 URAT1（5′-GCTACCAGAATCG-GCACGCT-3′，5′-CACCGG GAAGTCCACAATCC-3′）、GLUT9（5′-ACTCCTACTGCTTCCTCGTCTT-3′，5′-GCT-GATTTCTGCATGGGTTC-3′）、OAT1（5′-ACGGGAAA-CAAGAAGAGGG-3′，5′- AAGAGAGGTATGGAGGGGTAG-3′）、GAPDH（5′-TGAGGCCGGTGCTGAGTAT GT-3′，5′-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′），按照文獻(xiàn)[14]的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。采用瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀成像，計(jì)算光密度。以 GAP-DH 作為參照計(jì)算得到待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.2.5 不同部位高效液相色譜分析。

1.2.5.1 西伯利亞蓼供試品溶液制備。準(zhǔn)確稱取西伯利亞蓼不同部位FW、F30%、F50%、F90%各20 mg，加入甲醇和水不同比例各2.0 mL超聲溶解，得到10 mg/mL的供試品溶液。

1.2.5.2 色譜條件。色譜柱為Intersil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）;甲醇（A）和水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～6 min，A 10%～10%;6～10 min，A 10%～30%;10～30 min，A 30%～60%;30～50 min，A 60%～90%;50～55 min，A 90%～100%;55～60 min，A 100%～10%;60～65 min，A 10%～10%），柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min，運(yùn)行時(shí)間為65 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 18.0 軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果用±S表示。采用單因素方差分析，P<0.05 表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏藥西伯利亞蓼不同部位對(duì)高尿酸血癥小鼠UA、XOD、BUN活性的影響

由表1可知，與空白組（N組）相比，模型組（M組）小鼠UA、XOD和BUN顯著升高（P<0.01，P<0.05）;與M組相比，AP組、FL30%、FH30%、FH50%、FH90%組在一定程度上均可降低高尿酸血癥的血尿清水平（P<0.01，P<0.05）。XOD是體內(nèi)嘌呤類物質(zhì)代謝成尿酸最后兩步的關(guān)鍵酶，通過不同部位對(duì)XOD活性影響表明，除了FL30%、FH30%以外，其他部位低、高劑量組均對(duì)肝臟XOD具有一定的抑制作用（P<0.01，P<0.05）。BUN是檢驗(yàn)?zāi)I功能的重要指標(biāo)，可以反映腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收的功能，F(xiàn)WL、FWH、FL30%、FH30%、FH90%均可降低高尿酸血癥小鼠尿素氮的水平。

2.2 藏藥西伯利亞蓼不同部位對(duì)腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（mOAT1、mURAT1和mGLUT9）mRNA的表達(dá)

由圖1可知，與模型組（M組）相比，AP組、FWL、FL30%、FL90%、FH90%對(duì)小鼠腎臟URAT1 mRNA的表達(dá)具有顯著下調(diào)作用（P<0.01，P<0.05），其中FWL可下調(diào)URAT1 mRNA至正常水平;西伯利亞蓼不同部位低、高劑量組均可顯著下調(diào)GLUT9 mRNA的表達(dá)（P<0.01，P<0.05），其中AP、FH90%可下調(diào)URAT1 mRNA至正常水平;僅AP、FWL、FH30%、FL50%、FH50%可顯著上調(diào)OAT1 mRNA的表達(dá)，且AP、FWL、FL50%、FH50%均可上調(diào)OAT1 mRNA至正常水平及以上（P<0.01）。

2.3 藏藥西伯利亞蓼不同部位HPLC?

由圖2可知，除了F30%和F50%化學(xué)成分有部分重疊，西伯利亞蓼不同部位化學(xué)成分差別較大;王洪玲等[16]研究發(fā)現(xiàn)西伯利亞蓼30%、50%乙醇部位都含有蘆丁和番石榴苷，此外50%乙醇部位還含有木犀草素和槲皮素。

3 結(jié)論與討論

“黃水病”和“惡性腹水”是藏區(qū)多發(fā)疾病，也是藏醫(yī)學(xué)臨床具有治療優(yōu)勢(shì)的病種之一?；诒静菘甲C和實(shí)地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)“曲瑪孜”類藥材為常用治療這類疾病的藏藥材。西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）為藏藥“曲瑪孜”基原品種之一，目前鮮見相關(guān)的化學(xué)和藥理學(xué)研究。王曉云等[15]研究發(fā)現(xiàn)西伯利亞蓼70%乙醇部位具有降尿酸作用，但是其有效部位和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。基于此，該研究對(duì)西伯利亞蓼大孔樹脂洗脫的4個(gè)部位進(jìn)行降尿酸研究，發(fā)現(xiàn)30%、50%、90%乙醇部位具有降尿酸作用;目前研究表明XOD常用于痛風(fēng)、殺菌及自由基分子損傷等模型研究，西伯利亞蓼水部位（FW）未顯示明顯的抗尿酸作用，但是對(duì)XOD具有一定的抑制作用，提示FW可能具有治療其他疾病的可能;30%乙醇部位具有降尿酸作用，但是對(duì)XOD沒有抑制作用，推測(cè)30%乙醇部位可能存在其他降尿酸作用機(jī)制。

尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白是近年來國(guó)外學(xué)者比較關(guān)注的熱點(diǎn)[17]，其中URAT1、GLUT9 和OAT1分別負(fù)責(zé)尿酸的重吸收、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)作用。該研究發(fā)現(xiàn)30%乙醇部位可以顯著下調(diào)URAT1和GLUT9、上調(diào)OAT1 mRNA的表達(dá);50%乙醇部位可顯著下調(diào)GLUT9和上調(diào)OAT1 mRNA的表達(dá);90%乙醇部位可顯著下調(diào)URAT1和上調(diào)OAT1 mRNA的表達(dá)，以上研究進(jìn)一步表明西伯利亞蓼降尿酸存在不同途徑。

通過文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分（如蘆丁、木犀草素、桑色素等）具有抗痛風(fēng)活性[18-21]，該研究發(fā)現(xiàn)30%和50%乙醇部位均含有黃酮類化合物，推測(cè)黃酮化合物可能是這2個(gè)部位抗痛風(fēng)的活性成分。尿素氮是檢驗(yàn)?zāi)I功能的重要指標(biāo)，30%、90%乙醇部位均可降低高尿酸血癥小鼠尿素氮的水平，提示西伯利亞蓼具有降尿酸的同時(shí)也具有改善腎功能的功效。

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