利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化深綠木霉Tr16液體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基研究

陳晨 錢林 于穩(wěn)欠

摘要 采用響應(yīng)面分析法（RSAM）對深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株Tr16液體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過Plackett-Burman（PB）方法，先篩選出培養(yǎng)基中影響產(chǎn)孢量的3個主要因素：MgSO4、H8MoN2O4和酵母提取物，再運用“最陡爬坡路徑法”和RSAM，確定主要因子之間的交互影響并篩選出最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖5 g/L、KH2PO4 ?8 g/L、MgSO4 ?1.29 g/L、丙三醇10 mL/L、蔗糖10 g/L、H8MoN2O4 ?0.99 mL/L、酵母提取物4.83 g/L、可溶性淀粉5 g/L。經(jīng)過3次平行測試，Tr16的平均孢子產(chǎn)量為6.19×108 CFU/mL，與預(yù)測最大孢子產(chǎn)量接近，比未優(yōu)化的培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量提高了70.8%。

關(guān)鍵詞 響應(yīng)面法;深綠木霉;產(chǎn)孢;優(yōu)化

中圖分類號 S476.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）10-0117-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.031

Abstract Response surface analysis method （RSAM） was used to optimize the liquid fermentation culture medium for spore production of Trichoderma atroviride strain Tr16. Through PlackettBurman method （PB）， three main factors （MgSO4， H8MoN2O4 and yeast extract） affecting sporulation quantity in the medium were firstly screened out. Then， the steepest climbing path method （SCPM） and RSAM were used to determine the interaction among the main factors and the best formula of liquid fermentation medium was screened and determined. The results showed that the optimal formula of the medium was glucose 5 g/L， KH2PO4 8 g/L， MgSO4 1.29 g/L， glycerol 10 mL/L， sucrose 10 g/L， H8MoN2O4 0.99 mL/L， yeast extract 4.83 g/L， soluble starch 5 g/L. After three parallel tests， the average spore yield of Tr16 was 6.19×108CFU/mL， which was close to the predicted maximum spore yield and was 70.8% higher than that of the unoptimized medium.

Key words Response surface method （RSM）;Trichoderma atroviride;Spore production;Optimization

??

早在20世紀(jì)30年代科研工作者就發(fā)現(xiàn)，木霉菌（Trichoderma spp.）對多種植物病原菌有拮抗作用[1]。作為一種生防菌，木霉菌的抗菌機制有占位競爭、產(chǎn)生抗生素、重寄生、誘導(dǎo)抗性等[2]。目前在世界范圍內(nèi)，商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的各種活體木霉菌生物農(nóng)藥已有300多種，在綠色、有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中，對多種植物病害的綠色防控起到了良好的助推作用[3]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在發(fā)酵設(shè)備和工藝上為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的木霉菌孢子提供了一定的支撐[4]，但如何通過液體發(fā)酵獲得大量的木霉菌孢子，仍是制約木霉菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。

微生物發(fā)酵過程機理復(fù)雜，影響因素眾多，對微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為重要，已成為發(fā)酵水平的決定因素，其相關(guān)的研究也越來越多[5]。同時，許多試驗技術(shù)和設(shè)計方法在微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中得到應(yīng)用。傳統(tǒng)的優(yōu)化試驗方法有單因素法、正交設(shè)計法等，當(dāng)考察的因子較多以及因素之間存在交互作用時，試驗次數(shù)會大增，甚至試驗結(jié)果不準(zhǔn)確[6]。而很多其他方法即使減少了試驗次數(shù)，卻未能給出直觀的圖形，不能憑直覺觀察其最優(yōu)點。有的雖能找出最優(yōu)值，但又難以直觀地判別優(yōu)化區(qū)域。由Bxo 和 Willsno 最早提出，后經(jīng) Hill 和 Htlnetr 進(jìn)一步完善的響應(yīng)曲面法（response surface method，RSM）在微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究中成功克服了傳統(tǒng)方法的缺點，取得了良好效果[7]。然而我國在木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究方面，目前主要采用單因素法和正交法。對深綠木霉液體發(fā)酵，以及利用RSAM優(yōu)化深綠木霉液體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基的研究目前鮮有報道。筆者采用RSAM，對深綠木霉產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，使菌株Tr16在發(fā)酵液中的孢子產(chǎn)量提高了70.8%，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)深綠木霉提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。

深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株Tr16，由上海萬力華生物科技有限公司從西瓜根際土壤中分離獲得，并保藏。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：200 g 去皮馬鈴薯開水煮沸 20 min，過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，定容1 L，充分混勻，用1 L三角瓶分裝，每瓶裝500 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃，無菌條件下倒入培養(yǎng)皿，凝固備用[8]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4 1 g/L、丙三醇10 mL/L、蔗糖1 g/L、H8MoN2O4 0.5 mL/L、酵母提取物41 g/L、可溶性淀粉5 g/L。

H8MoN2O4母液配制：0.1 g/L H8MoN2O4·2H2O 的母液，4 ℃冰箱保存，使用時按照要求用量添加到培養(yǎng)基中。

1.1.3 供試試劑。

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、丙三醇、蔗糖、H8MoN2O4、酵母提取物、可溶性淀粉等試劑均為分析純（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.4 供試設(shè)備。

顯微鏡（Olympus BX51），搖床（SY2020天呈設(shè)備有限公司），天平（OHAUS CP64）。

1.2 試驗方法

（1）Tr16 種子發(fā)酵液制備。將純化的 Tr16 菌塊轉(zhuǎn)移至 PDA 平板上培養(yǎng)72 h（28 ℃），在無菌條件下刮取長在平板上的分生孢子，用無菌水配成含5×107CFU/mL分生孢子懸浮液備用。

（2）搖瓶測試培養(yǎng)條件。設(shè)定搖床的溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，裝液量為110 mL/500 mL搖瓶，接種量為2%（V/V），每個處理3個重復(fù)，培養(yǎng)144 h。

（3）發(fā)酵液孢子含量測定。用血球計數(shù)板法。

木霉菌孢子個數(shù)（CFU/mL）=80個小方格細(xì)胞總數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)

1.3 試驗設(shè)計

（1）根據(jù) Plackett- Burman（PB）的設(shè)計原理，選取11個變量因素，分別為A（葡萄糖）、B（KH2PO4）、D（MgSO4）、E（丙三醇）、G（蔗糖）、H（H8MoN2O4）、J（酵母提取物）、K（可溶性淀粉），以及3個虛擬變量：C、F、I（以便估算誤差），共進(jìn)行12次發(fā)酵測試，響應(yīng)值為發(fā)酵液體的產(chǎn)孢量。PB 測試設(shè)計見表1。采用 Design- Expert 8.0.6 軟件，對表2中12次發(fā)酵測試的孢子產(chǎn)量進(jìn)行回歸分析，得到各因子對孢子產(chǎn)量的影響偏差回歸系數(shù)，以及各因子對孢子產(chǎn)量影響的顯著差異性。

? （2）最陡爬坡法（SCPM）試驗。根據(jù) PB 試驗得到的 3個正或負(fù)顯著影響因素效應(yīng)值，設(shè)定 SCPM 試驗的正負(fù)步長、爬坡方向，確定3個顯著影響因素的最佳值區(qū)。

（3）Box- Behnken（BB）設(shè)計。依據(jù) PB 試驗原理和最陡爬坡試驗結(jié)果，設(shè)計一個對菌株Tr16發(fā)酵培養(yǎng)基3因素3水平的 RSAM試驗。使用軟件Design-Expert 8.0.6 構(gòu)建試驗設(shè)計并對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。

（4）驗證試驗。用所得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行發(fā)酵試驗，得到平均值后與理論值進(jìn)行比較，以驗證測試的模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB 設(shè)計測試結(jié)果

通過 PB 設(shè)計，其測試結(jié)果（表2、3）表明，酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4 對孢子產(chǎn)量的影響最大，葡萄糖、KH2PO4、丙三醇、蔗糖、可溶性淀粉對孢子產(chǎn)量無顯著影響，其中酵母提取物的影響為正效應(yīng)，MgSO4、H8MoN2O4的影響為負(fù)效應(yīng)。

2.2 SCPM 測試結(jié)果

根據(jù)PB測試結(jié)果，明確了酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4 是發(fā)酵培養(yǎng)基中對孢子產(chǎn)量影響最大的3個因素。再根據(jù) SCPM 原理，設(shè)定這3個因素的爬坡方向及步長測試，其設(shè)計和測試結(jié)果見表4。由表4可知，測試2和測試3的孢子產(chǎn)量變化不大，說明此3個因素在這2個測試中的用量濃度值，已很接近最佳用量值。因此，該試驗選擇酵母提取物 5 g/L、MgSO4 1.3 g/L、H8MoN2O4 1 mL/L為中心點，展開響應(yīng)面對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

2.3 RSAM 對發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的測試結(jié)果

以酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4 3個因素為自變量，BB 試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面三維圖和等高線圖（圖1～3）。

從圖1～3可以看出，隨著培養(yǎng)基中酵母提取物、MgSO4和H8MoN2O4濃度的增加，孢子含量先增加后下降，表明兩因素間交互作用明顯。根據(jù)回歸方程式的求解，得到響應(yīng)面模型極值點，即酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4最佳使用濃度為4.83 g/L、1.29 g/L、0.99 mL/L時，按此用量配制的發(fā)酵液培養(yǎng)基，能使菌株Tr16的孢子產(chǎn)量達(dá)6.19× 108 CFU/mL最大值。

2.4 回歸模型結(jié)果試驗驗證?

根據(jù)響應(yīng)面分析法得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)配方，進(jìn)行了3次平行發(fā)酵測試，進(jìn)一步對響應(yīng)面模型進(jìn)行驗證。3次測試的孢子產(chǎn)量分別為6.17×108、6.36×108、6.09×108 CFU/mL，平均孢子產(chǎn)量為6.21×108 CFU/mL。這個數(shù)值與理論值6.19×108 CFU/mL非常接近。2個數(shù)值的相對吻合，證明了響應(yīng)面模型的可靠性。優(yōu)化后的培養(yǎng)基：葡萄糖 5 g/L、KH2PO4 8 g/L、MgSO4 1.29 g/L、丙三醇 10 mL/L、蔗糖 10 g/L、H8MoN2O4 0.99 mL/L、酵母提取物 4.83 g/L、可溶性淀粉 5 g/L。

3 結(jié)論與討論

用 RSAM 法對發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠精準(zhǔn)地判斷和評價各因素之間的交互作用，從而獲得一個最佳組合。袁輝林[10]對一株植物促生菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，首先利用 PB 設(shè)計對影響 SZ7-1 生長的11 個營養(yǎng)因素進(jìn)行評價，并篩選出顯著影響因子：玉米糖漿、酵母膏和 K2HPO4;其次用最陡爬坡試驗逼近以上 3 因素最優(yōu)水平;最后采用RSM 法對 3 個顯著因素的最佳水平范圍進(jìn)行研究，得到的最佳濃度分別為玉米漿28 g/L、酵母膏 14 g/L 和 K2HPO4 2.2 g/L。該測試結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，通過PB 設(shè)計試驗篩選出酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4對孢子含量貢獻(xiàn)較大，其中酵母提取物對孢子含量的影響最為明顯，然后利用 BB 設(shè)計建立了3個主要因素與響應(yīng)值之間的二次回歸模型，并由此確定了木霉菌Tr16產(chǎn)孢的最佳配方為酵母提取物、MgSO4、H8MoN2O4，最佳濃度為4.83 g/L、1.29 g/L、0.99 mL/L。

在優(yōu)化過程中，RSAM 可以單獨針對微生物發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，也可綜合培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件一起進(jìn)行考察。 目前，利用該方法對不同微生物的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，均不同程度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[11]。Lotfy等[12]采用 BB 設(shè)計，用一種新分離的黑曲霉進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)檸檬酸。在對該黑曲霉培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的同時，也對培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孢子濃度為 108 CFU/mL，pH為4.0，通氣量為 6 500 mL/min，溫度為 31.5 ℃時，檸檬酸的生產(chǎn)率可達(dá) 87.81%，是優(yōu)化前的14倍。該測試結(jié)果與以上研究結(jié)果說明，在微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作中，PB 設(shè)計、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面分析法結(jié)合是一種邏輯性強、效果良好的過程優(yōu)化過程。木霉菌 Tr16 經(jīng)過 RSAM 測試，孢子含量明顯提高，達(dá)6.21×108 CFU/mL，與理論值相近，比未優(yōu)化的培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量提高了70.8%。該結(jié)果將為木霉菌 Tr16 液體發(fā)酵的放大和工業(yè)化生產(chǎn)提供了可參考數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 惠有為，孫勇，潘亞妮，等.木霉在植物真菌病害防治上的作用[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，12（3）：96-99.

[2] 臺蓮梅，高俊峰，張亞玲，等.拮抗長枝木霉T115D菌株發(fā)酵條件[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：333-334.

[3] WEINDLING R.Studies on lethal principle effective in the parasitic action of Trichoderma lignorum in Rhizoctinia solani and other soil fungi[J].Phytopathology，1934，24：1153-1179.

[4] 高雪麗，吳堅平，徐剛，等.側(cè)鉤木霉的分離、鑒定及產(chǎn)孢條件優(yōu)化[J].中國生物工程雜志，2014，34（2）：84-92.

[5] BOSCOLO P R S，MENOSSI M，JORGE R A.Aluminuminduced oxidative stress in maize[J].Phytochemistry，2003，62（2）：181-189.

[6] CHO U H，PARK J O.Mercuryinduced oxidative stress in tomato seedlings[J].Plant science，2000，156（1）：1-9.

[7] SAMANTARY S.Biochemical responses of Crtolerant and Cr-sensitive mung bean cultivars grown on varying levels of chromium[J].Chemosphere，2002，47（10）：1065-1072.

[8] 陳晨，曠文豐，陳娟，等.鈣離子和藍(lán)光對深綠木霉Tr775在液體發(fā)酵過程中分生孢子產(chǎn)量的影響[J].化學(xué)與生物工程，2018，35（1）：36-40.

[9] 梁昌聰，郭立佳，劉磊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌C101發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物技術(shù)通報，2014（8）：169-174.

[10] 袁輝林.植物促生菌培養(yǎng)優(yōu)化及作用機理研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2011.

[11] 袁輝林，康麗華，馬海濱.響應(yīng)曲面法及其在微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（16）：9498-9500，9502.

[12] LOTFY W A，GHANEM K M，ELHELOW E R.Citric acid production by a novel Aspergillus niger isolate：II.Optimization of process parameters through statistical experimental designs[J].Bioresource technology，2007，98：3470-3477.