七氟烷與丙泊酚對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制*

鄭仲磊， 范曉英， 杜克信

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 手麻科，陜西 西安 710038)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是麻醉手術(shù)后常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為記憶和學(xué)習(xí)能力下降、意識(shí)及判斷出現(xiàn)障礙、注意力不能集中等認(rèn)知功能的改變，可持續(xù)幾周甚至幾個(gè)月[1-2]。老年患者手術(shù)后經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)POCD，這不僅影響了老年患者的生活質(zhì)量及醫(yī)療負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致其他術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生及人格的改變[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和老年人口的不斷增加，老年患者接受手術(shù)治療的機(jī)會(huì)增大，POCD的發(fā)病率也逐漸增加[3-4]。有研究報(bào)道，年齡>60歲的患者在接受非心臟手術(shù)后，>25%的患者在一周內(nèi)會(huì)發(fā)生POCD[5]；而年齡>60歲的患者在接受腹部手術(shù)后，則大約有38%的患者也會(huì)發(fā)生POCD[6]。誘發(fā)POCD發(fā)生的因素有高齡、手術(shù)創(chuàng)傷及自身存在疾病等多種因素，而手術(shù)中麻醉藥物的使用也是誘發(fā)POCD發(fā)生的一種誘發(fā)因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)，麻醉和手術(shù)可誘發(fā)的炎癥、氧化應(yīng)激，可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，最終損傷海馬組織[8]。而海馬在腦中是學(xué)習(xí)和記憶等功能的重要腦區(qū)，海馬損傷后則會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)和認(rèn)知等方面的障礙[9]。七氟烷和丙泊酚是臨床上應(yīng)用較為廣泛的全麻藥物，七氟烷在臨床上是用于誘導(dǎo)和持續(xù)性的吸入型麻醉藥物，而丙泊酚則是靜脈麻醉藥物[10]，七氟烷、丙泊酚均會(huì)對(duì)大鼠認(rèn)知具有一定的損傷作用[11-12]，但2者對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能影響的差異及其作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究以老年大鼠作為研究對(duì)象，探究七氟烷與丙泊酚對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

30只18～20月齡的SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量450～550 g，許可證號(hào)SCXK(京)2007-2001。熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，XR-XM101 Morris 水迷宮購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，F(xiàn)abius麻醉機(jī)購(gòu)自德國(guó)-Drager公司，WB電泳儀購(gòu)自美國(guó) Bio-rad 公司，H-7500型透射電子顯微鏡購(gòu)自日本 Hitachi 公司；酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司， Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1造模與分組 將購(gòu)買的30只SD雄性大鼠在溫度(22±2)℃、濕度(50±10)%、照明時(shí)間12 h晝夜交替節(jié)律的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予自由飲水和飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、七氟烷組及丙泊酚組，每組10只。在麻醉過程中，將3組大鼠置于特制的麻醉箱中，通過Fabius麻醉機(jī)使箱內(nèi)的空氣氣流保持一致且流速為2 L/min，使其保持自主呼吸；七氟烷組大鼠使用麻醉機(jī)進(jìn)行吸入麻醉和吸氧，調(diào)節(jié)七氟烷的濃度為3%，每天持續(xù)2 h、持續(xù)5 d；丙泊酚組大鼠給予腹腔注射50 mg/kg丙泊酚，每天1次、持續(xù)5 d；對(duì)照組大鼠置于麻醉箱中，給予正常通氣處理。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮是一個(gè)水深50 cm、直徑120 cm的圓形水池；在實(shí)驗(yàn)開始前3 d，讓每組大鼠在水迷宮中適應(yīng)環(huán)境，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?xùn)練。于開始造模后的第7～14天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，把水迷宮劃分為東南西北4個(gè)象限，平臺(tái)在四象限，將大鼠面向池壁分別于水迷宮的4個(gè)象限的中部入水，使用視頻追蹤技術(shù)記錄大鼠在水迷宮中登上平臺(tái)所需的時(shí)間，記錄大鼠在4個(gè)象限中登上平臺(tái)所需的時(shí)間，取其平均值，作為大鼠的逃避潛伏期；若大鼠在120 s內(nèi)未登上平臺(tái)，則人為引導(dǎo)登上平臺(tái)，并使其在平臺(tái)上休息20 s，大鼠的逃避潛伏期記為120 s。實(shí)驗(yàn)的最后1 d，撤去平臺(tái)，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)；通過逃避潛伏期和穿過平臺(tái)次數(shù)對(duì)大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估。在整個(gè)測(cè)試過程中，保持環(huán)境一致以排除外在環(huán)境干擾。

1.2.3大鼠海馬組織標(biāo)本 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即麻醉后處死大鼠，分離大鼠腦組織中的海馬組織，分成若干份，分別用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

1.2.4細(xì)胞因子含量 采用ELISA法檢測(cè)，取1份大鼠海馬組織，制備成10%的組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心分離得到上清液，BCA蛋白定量，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)海馬組織中腫瘤壞死因子-α(TNF)及白細(xì)胞介素-6 (IL-6)含量。

1.2.5海馬組織CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué) 采用HE染色法檢測(cè)，取1份各組大鼠海馬組織(每組6只)，使用10%甲醛溶液固定，組織包埋成蠟塊，蠟塊切片后用二甲苯進(jìn)行脫蠟，100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精進(jìn)行梯度水化，每個(gè)水化過程3 min，然后自來水緩慢沖洗30 s，蘇木素染色5 min，自來水洗去組織表面多余的蘇木素，1%鹽酸乙醇分色，自來水沖洗3 min，0.5%伊紅染色30 s，自來水沖洗1 min，95%、100%的酒精梯度脫水2 min，用二甲苯對(duì)切片透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué) 采用透射電鏡觀察，取1份各組大鼠新鮮的大鼠海馬組織(每組6只)，甲醛固定，固定完成后，洗去表面甲醛溶液，放入1%鋨酸中反應(yīng)60 min，PBS緩慢清洗3次，在梯度酒精中進(jìn)行脫水，用環(huán)氧樹脂在37 ℃條件下對(duì)組織進(jìn)行包埋，切片，使用3%醋酸鈾-構(gòu)椽酸鉛染色劑使其染色，透射電鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.2.7海馬組織Bax及p-NF-κB蛋白的表達(dá) 采用免疫熒光法檢測(cè)，取出1.2.5包埋好的組織塊，烘片、脫蠟、抗原修復(fù)，PBS緩慢清洗、3 min/次，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS緩慢清洗，3 min/次，5% BSA 封閉30 min，孵一抗(Bax和p-NF-κB)4 ℃中過夜，復(fù)溫，PBS緩慢清洗，3 min/次，孵育熒光二抗2 h，PBS緩慢清洗，3 min/次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水和二甲苯透明，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL染色法，取1.2.5包埋好的組織切片，烘片1 h，切片在二甲苯和梯度酒精中脫蠟，滴加20 mg/L的蛋白酶工作液，37 ℃烘箱中15 min，滴加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃烘箱中避光孵育1 h，PBS緩慢清洗3次、3 min/次；滴加DAPI孵育10 min，PBS緩慢清洗3次、3 min/次，封片，熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.9海馬組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB和IκB蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)，取1份新鮮的大鼠海馬組織，加入裂解液后提取腦海馬組織總蛋白，BCA 蛋白定量法檢測(cè)裂解液中總蛋白濃度。按照樣本與上樣緩沖液4 ∶1的比例加入上樣緩沖液，在沸水中使蛋白變性10 min，獲得電泳蛋白樣本。采用SDS-PAGE電泳法，轉(zhuǎn)膜，封閉，完成封閉后，TPBS清洗3次，PBS清洗1次、8 min/次；孵一抗(Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB和IκB，1 ∶100)4 ℃下孵育過夜，TPBS 清洗3次；孵二抗 (1 ∶30 000)，TPBS清洗3次，PBS 洗1次、8min/次，洗膜完成后，配置顯影液，把顯影液涂抹在PVDF膜上，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描目的蛋白，Image-Pro Plus軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Morris水迷宮結(jié)果顯示，3組大鼠逃避潛伏期比較，七氟烷組>丙泊酚組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)七氟烷組<丙泊酚組<對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠認(rèn)知功能實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(n=10)Tab.1 The experimental index of cognitive function in rats(n=10)

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與丙泊酚組比較，P<0.05。

2.2 海馬組織TNF-α及IL-6含量

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，3組大鼠海馬組織TNF-α及IL-6含量比較，七氟烷組>丙泊酚組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 海馬CA1區(qū)組織學(xué)及海馬神經(jīng)元形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞大小、形態(tài)正常，核仁、細(xì)胞質(zhì)清晰；七氟烷組神經(jīng)元明顯減少，錐體神經(jīng)

表2 大鼠腦海馬組織中細(xì)胞因子含量(n=10)Tab.2 The cytokine levels in the hippocampus of rat brain(n=10)

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與丙泊酚組比較，P<0.05。

元排列松散、不規(guī)則，部分神經(jīng)元表現(xiàn)為核固縮和胞質(zhì)過濃；丙泊酚組中病理與七氟烷組相比，形態(tài)學(xué)改變相對(duì)較輕。透射電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則；七氟烷組海馬元神經(jīng)的細(xì)胞核發(fā)生明顯變化，細(xì)胞核膜開始內(nèi)陷，結(jié)構(gòu)不完整；丙泊酚組細(xì)胞核輕度內(nèi)陷，呈半月板狀。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織及神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化Fig.1 The morphological changes of hippocampus and neurons in rats

2.4 Bax及p-NF-κB蛋白表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示， 3組大鼠海馬組織Bax及p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較，七氟烷組>丙泊酚組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.5 海馬組織細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，TUNEL染色中陽性的細(xì)胞核為綠色，DAPI染色的細(xì)胞核為藍(lán)色；3組大鼠海馬組織凋亡指數(shù)比較，七氟烷組>丙泊酚組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.6 Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB蛋白表達(dá)

如圖4所示，3組大鼠海馬組織中Caspase-3、Bax和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平計(jì)較，七氟烷組>丙泊酚組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組大鼠海馬組織中Bcl-2和IκB蛋白表達(dá)水平計(jì)較，七氟烷組<丙泊酚組<對(duì)照組，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示，七氟烷和丙泊酚引起的認(rèn)知功能障礙可能與NF-κB和Bax/Caspase-3信號(hào)通路有關(guān)。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與丙泊酚組比較，P<0.05。

圖2 各組大鼠腦海馬組織Bax及p-NF-κB蛋白表達(dá)(免疫熒光法，×400)
Fig.2 Immunofluorescence detection of the expression of Bax and p-NF-κB in the hippocampus of rats (immunofluorescence,×400)

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與丙泊酚組比較，P<0.05。

圖3 各組大鼠腦海馬組織細(xì)胞凋亡水平(TUNEL，×400)
Fig.3 TUNEL analysis of the apoptosis level in the hippocampus of rats (TUNEL,×400)

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與丙泊酚組比較，P<0.05。

圖4 各組大鼠腦海馬組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB蛋白表達(dá)(Western blot)
Fig.4 Expression of Caspase-3, Bax, Bcl-2, p-NF-κB and IκB in the hippocampus of rats(Western blot)

3 討論

POCD是指在外科手術(shù)后引起的一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)的障礙，表現(xiàn)出失語、失行、失認(rèn)等改變，嚴(yán)重者甚至可進(jìn)一步發(fā)展為失智[13-14]。腦部是麻醉藥的靶器官，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能在接受麻醉后會(huì)受到抑制，這表明POCD的危險(xiǎn)因素可能是麻醉引起的[15]。七氟烷和丙泊酚在臨床上被廣泛應(yīng)用于麻醉手術(shù)中，前者為吸入型麻醉藥，后者靜脈注射型麻醉藥，有研究表明，七氟烷和丙泊酚對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)具有損傷作用[16-17]，但2者差異及其作用機(jī)制鮮有研究。本研究通過HE染色和電鏡掃描檢測(cè)老年大鼠腦組織病理變化，結(jié)果顯示，與正常組相比，七氟烷組和丙泊酚組大鼠腦組織都受到不同程度的病理損傷，但是七氟烷組損傷更加明顯。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是典型的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，它可以反映動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的能力，在本次研究中，七氟烷組和丙泊酚組大鼠潛伏期顯著高于對(duì)照組，穿過平臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組，且七氟烷組大鼠潛伏期明顯高于丙泊酚組，穿過平臺(tái)次數(shù)少于丙泊酚組，由此說明七氟烷麻醉后對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的損害更加明顯。

老年人在受到應(yīng)激、創(chuàng)傷、麻醉等過程后發(fā)生神經(jīng)元凋亡是造成認(rèn)知功能障礙的重要影響因素，該環(huán)節(jié)會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)通路，促使中樞和外周釋放多種炎癥因子，如TNF-α和IL-6等，而這種炎癥因子能夠介導(dǎo)神經(jīng)元的損傷和凋亡，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[18-19]。在本研究中，NF-κB信號(hào)通路被激活，p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯增多，從炎癥因子含量檢測(cè)可見七氟烷組和丙泊酚組老年大鼠腦中TNF-α和IL-6顯著高于對(duì)照組，且七氟烷麻醉后的大鼠腦中炎癥因子含量更高，提示七氟烷和丙泊酚麻醉藥都能誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，但七氟烷對(duì)神經(jīng)功能損傷高于丙泊酚。

大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡過度激活是造成神經(jīng)元損傷的重要原因[20]。促凋亡蛋白 Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是一組能夠反映機(jī)體凋亡水平的蛋白，Bax能夠形成同源二聚體促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，而Bcl-2起到抑制作用，細(xì)胞色素C的釋放能夠誘發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成Caspase-3的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21-22]。本研究利用 Western blot和TUNEL 染色檢測(cè)了大鼠海馬組織神經(jīng)元的凋亡水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，七氟烷組和丙泊酚組大鼠 Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，TUNEL結(jié)果顯示大鼠海馬神經(jīng)元凋亡明顯增加。進(jìn)一步提示七氟烷麻醉后，老年大鼠大腦海馬組織的神經(jīng)元凋亡更加嚴(yán)重，這也驗(yàn)證了七氟烷引起更嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙的原因。

綜上所述，七氟烷與丙泊酚均可引起老年大鼠的認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與NF-κB和Bax/Caspase-3信號(hào)通路有關(guān)，但丙泊酚對(duì)認(rèn)知功能影響低于七氟烷。