PARP抑制劑對胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤機制及耐藥性分析*

王蒲雄志， 夏光慨， 盧家俊， 袁周， 史向軍， 黃新余

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院 肝膽胰外科， 上海 200233)

胰腺癌是消化道的惡性腫瘤，發(fā)病率居我國惡性腫瘤第10位[1]。胰腺癌是預(yù)后極差的惡性腫瘤之一，死亡率居我國惡性腫瘤第6位[2]。隨著人們生活方式的不斷改變及生活水平不斷提高，胰腺癌的發(fā)病比例和死亡比例逐年增加[3]。目前對于胰腺癌患者臨床多采用外科手術(shù)為主、放射性治療和化學(xué)藥物治療為輔的綜合治療方案，能夠緩解臨床癥狀，縮小原發(fā)病灶，減緩腫瘤發(fā)展速度，但胰腺癌惡性程度極高，病情進展迅速，手術(shù)切除率低，對放化療敏感性低，患者往往預(yù)后不良，5年生存率不足5%，嚴(yán)重威脅人類健康[4-6]。因此，尋找有效的治療方法對提升胰腺癌患者的預(yù)后尤為重要。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種重要的DNA修復(fù)酶，廣泛存在于真核生物細(xì)胞核中，具有維持基因組穩(wěn)定、參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)、保持染色體結(jié)構(gòu)完整性的作用，在細(xì)胞生物學(xué)行為、惡性腫瘤發(fā)生及進展過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[7-8]。隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，分子靶向治療逐漸應(yīng)用于臨床腫瘤治療[9]。PARP抑制劑是一種新型分子靶向藥物，能夠影響癌細(xì)胞的自我復(fù)制，在胃癌[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12]等惡性腫瘤的靶向治療中有較好的應(yīng)用，但其在胰腺癌中的應(yīng)用較為少見。本研究以人胰腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株P(guān)ATU-8988/DDP細(xì)胞作為研究對象，采用PARP抑制劑AG014699及順鉑處理細(xì)胞，觀察處理后細(xì)胞的增殖及凋亡的變化，同時檢測細(xì)胞中 PARP蛋白表達水平，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人胰腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株P(guān)ATU-8988/DDP，購于上海美軒生物科技有限公司。

1.1.2實驗分組及處理 將PATU-8988/DDP細(xì)胞分為對照組、PARP抑制組及聯(lián)合順鉑組，進行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達85%時，細(xì)胞消化、傳代，取對數(shù)生長期的PATU-8988/DDP細(xì)胞，以5×106個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清(上海源葉生物科技有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(上海覓拓生物科技有限公司)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(常州普天儀器制造有限公司)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達90%時，對照組加入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，PARP抑制組加入10 μmmol/L PARP抑制劑AG014699(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)培養(yǎng)24 h，聯(lián)合順鉑組加入10 μmmol/L PARP抑制劑AG014699及10 mg/L順鉑(南京賽泓瑞生物科技有限公司)培養(yǎng)24 h。

1.2 方法

1.2.1PATU-8988/DDP細(xì)胞增殖率檢測 采用MTT法，取1.1.2項下的各組PATU-8988/DDP細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(武漢益普生物科技有限公司)20 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜溶液(北京金克隆生物技術(shù)有限公司)150 μL，振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀(上海楓起生物科技有限公司，型號Infinite? F50)測定490 nm波長下OD值，計算細(xì)胞增值率，細(xì)胞增殖率=(處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2PATU-8988/DDP細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)，取1.1.2項下的各組PATU-8988/DDP細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)液，用1 ×Tris Buffer緩沖液(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)洗滌，0.25%胰蛋白酶(上海圻明生物科技有限公司)消化，制備細(xì)胞懸液，向流式管中依次加入細(xì)胞懸液300 μL、PI染液(上海赫果生物科技有限公司)5 μL、Annexin V-FITC(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司)5 μL，避光反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀(上海迪奧生物科技有限公司，型號CyFlow? Cube 6)檢測各組PATU-8988/DDP細(xì)胞凋亡率。

1.2.3PATU-8988/DDP細(xì)胞中 PARP蛋白表達 采用Western blot法，取1.1.2項下的各組PATU-8988/DDP細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(上海子起生物科技有限公司)，充分裂解，采用離心機(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司，型號SelectspinTM17R)，13 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA試劑盒(北京澤平科技有限責(zé)任公司)測定白濃度并對蛋白定量，取總蛋白上樣于10% SDS-PAGE膠、電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液(上海君瑞生物技術(shù)有限公司)封閉、加入1 ∶200稀釋的 PARP單克隆抗體一抗(上海鈺博生物科技有限公司)、1 ∶400稀釋的β-actin單克隆抗體一抗(南京善本生物科技有限公司)，4 ℃孵育過夜，PBS溶液(上海春曉生物技術(shù)有限公司)漂洗，加山羊抗兔IgG二抗(美國Invitrogen公司)，37 ℃孵育1 h，采用ECL發(fā)光試劑盒(上海傳秋生物科技有限公司)顯色，洗片后顯影、定影，應(yīng)用Image Quant TL軟件(上海浩然生物技術(shù)有限公司)進行分析，選取β-actin為內(nèi)參照，以 PARP灰度值與β-actin灰度值之比表示 PARP蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PATU-8988/DDP細(xì)胞增殖率

結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，3組細(xì)胞增殖率比較，聯(lián)合順鉑組

表1 各組PATU-8988/DDP細(xì)胞增殖率Tab.1 Cell proliferation rate of PATU-8988/DDP

注：(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與PARP抑制組比較，P<0.001。

(1)與治療前比較，P<0.01。

2.2 PATU-8988/DDP細(xì)胞凋亡率

結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，3組細(xì)胞增殖率比較，聯(lián)合順鉑組>PARP抑制組>對照組，兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組PATU-8988/DDP細(xì)胞凋亡率Tab.2 Apoptosis rate of PATU-8988/DDP

注：(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與PARP抑制組比較，P<0.001。

2.3 PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達

結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，PARP抑制組及聯(lián)合順鉑組PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合順鉑組與PARP抑制組PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表3。

表3 各組PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達水平Tab.3 Levels of PARP protein expression of PATU-8988/DDP cells in each

組別PARP蛋白表達水平對照組2.87±1.23PARP抑制組1.11±0.49(1)聯(lián)合順鉑組1.09±0.47(1) F9.520 P0.002

注：(1)與對照組比較，P<0.001。

3 討論

胰腺癌病因尚不明確，目前認(rèn)為與環(huán)境污染、吸煙、飲酒、過量飲用咖啡、高脂肪飲食、高蛋白飲食及遺傳因素有關(guān)，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一[13]。外科手術(shù)是目前治療胰腺癌的主要方法，但胰腺癌初期癥狀不具備特異性，早期診斷困難，60%～80%患者因上腹部飽脹不適、惡心、嘔吐、腹瀉、消瘦、疼痛而就診時多已處于中晚期，已不能行外科手術(shù)治療[14-15]。且胰腺為人體重要腺體之一，解剖關(guān)系隱匿且復(fù)雜，手術(shù)不能徹底切除，癌細(xì)胞可向腹腔內(nèi)種植，還可沿切口面、縫線處轉(zhuǎn)移，術(shù)后復(fù)發(fā)率高[16-17]。放射性治療和化學(xué)藥物治療是目前治療胰腺癌的輔助方法，能夠清除原發(fā)病灶，阻止腫瘤進展，但具有不良反應(yīng)多、易產(chǎn)生耐藥性等不足[18]，因此尋找有效治療方案對降低胰腺癌病死率有著重要意義。

PARP是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞核中的DNA修復(fù)酶，能夠催化ADP-核糖單元從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)移到各種受體蛋白，維持基因組穩(wěn)定，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)，保持染色體結(jié)構(gòu)完整性，并在細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。PARP也是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的主要轉(zhuǎn)錄因子，抑制其活性可以增強DNA損傷類化療藥物及放射性治療的治療效果，現(xiàn)已成為抗腫瘤治療的新靶點之一[21]。隨著廣大學(xué)者對腫瘤分子生物學(xué)的不斷深入研究，分子靶向治療逐漸應(yīng)用于臨床治療各類惡性腫瘤。PARP抑制劑為DNA修復(fù)酶抑制劑，是一種新型分子靶向藥物，能夠通過靶向阻斷癌細(xì)胞DNA修復(fù)而發(fā)揮抗癌作用[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默卵巢癌細(xì)胞中PARP表達后可抑制DNA損傷修復(fù)機制，增強化療藥物對卵巢癌細(xì)胞DNA損傷，促進卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[24]。也有研究發(fā)現(xiàn)， PARP抑制劑能夠上調(diào)微小核糖核苷酸664b-5p(Microribonucleotide 664b-5p，miR-664b-5p)表達而增加BRCA1突變?nèi)幮腿橄侔熕幬锏拿舾行訹25]。本研究的結(jié)果與上述研究相符，結(jié)果顯示PARP抑制組PATU-8988/DDP細(xì)胞增殖率顯著低于對照組，PARP抑制組PATU-8988/DDP細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，提示PARP抑制劑可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖及促進胰腺癌細(xì)胞的凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合順鉑組PATU-8988/DDP細(xì)胞增殖率顯著低于PARP抑制組、而細(xì)胞凋亡率顯著高于PARP抑制組，提示PARP抑制劑可提高胰腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，增強順鉑對胰腺癌細(xì)胞的化學(xué)毒性。本研究另一個結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PARP抑制組PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達水平顯著低于對照組，而聯(lián)合順鉑組PATU-8988/DDP細(xì)胞中PARP蛋白表達水平與PARP抑制組差異不大，提示PARP抑制劑可能通過下調(diào)PARP表達發(fā)揮對胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，降低胰腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，這可為PARP抑制劑的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，PARP抑制劑可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進胰腺癌細(xì)胞凋亡，提高胰腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，增強順鉑對胰腺癌細(xì)胞的化學(xué)毒性，其機制可能與 PARP抑制劑下調(diào)PARP表達有關(guān)。但 PARP抑制劑抗胰腺癌的機制是否還有其他，有待進一步研究。