Let-7e-5p對變應(yīng)性鼻炎小鼠Treg/Th17細(xì)胞失衡的影響*

閆智永， 張爽， 唐橋斐

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉科， 遼寧 沈陽 110002)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一種過敏性疾病，主要癥狀體征表現(xiàn)為打噴嚏、瘙癢、鼻漏、鼻塞和鼻充血[1]。近年AR患病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，已成為世界性重大公共衛(wèi)生問題[2]。以往觀點(diǎn)認(rèn)為2型輔助T細(xì)胞(T helper cells2，Th2)的流入和分化是AR發(fā)生和加重的重要因素[3]。伴隨免疫學(xué)研究的快速發(fā)展，經(jīng)典的1型輔助性T細(xì)胞(T helper cells1，Th1)/Th2構(gòu)架失衡理論在AR中的作用不斷受到新的挑戰(zhàn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)Th1應(yīng)答并不能減輕Th2介導(dǎo)的AR反應(yīng)，表明AR的發(fā)病機(jī)制不能簡單用Th1/Th2免疫失衡來解釋[5]。近年的研究表明，輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Treg)與AR發(fā)生密切相關(guān)，提示Treg/Th17細(xì)胞失衡在AR進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6]。以往研究表明MicroRNAs (miRNAs)是AR潛在生物標(biāo)志物，參與AR發(fā)病機(jī)制[7]。最近Suojalehto等[8]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-let-7e-5p在AR患者鼻黏膜組織中低表達(dá)。此外，let-7e-5p還可通過調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞分化參與自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的發(fā)生進(jìn)展[9]，但let-7e-5p是否通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞失衡參與AR進(jìn)展有待研究。因此本研究擬建立BALB/c小鼠AR模型，探討let-7e-5p對Treg/Th17細(xì)胞失衡的影響，進(jìn)一步闡明AR發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠12只，體質(zhì)量16～18 g，購買于遼寧長生生物科技股份有限公司[合格證號(hào)SCXK(遼)2015-0001]，給予普通飼料喂養(yǎng)，飲用蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥品和主要試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)購自美國Sigma公司，蘇木精購自中國索萊寶公司，曙紅Y購自中國上海生工生物，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescent，ECL)液、全蛋白提取試劑盒、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)快速制備試劑盒、羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobin G，IgG)-辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)、內(nèi)參抗體β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)及叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(fork-head box p3，F(xiàn)oxp3)抗體購自中國沈陽萬類生物，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自加拿大Fermentas公司，維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)抗體購自美國Affinity公司，小鼠免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒和白細(xì)胞介素17A(interleukin 17A，IL-17A)ELISA試劑盒購自中國聯(lián)科生物公司，小鼠白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)ELISA試劑盒購自中國武漢優(yōu)爾生公司，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的分化群4(cluster of differentiation 4, CD4)抗體、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的IL-17A抗體及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Foxp3抗體購自美國Thermo公司，let-7e-5p激動(dòng)劑(agomir)及陰性對照由中國吉瑪基因公司合成。

1.1.3主要儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)購自中國蘇州凈化，NW10LVF超純水系統(tǒng)購自香港Heal Force公司，RM2235石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司，QH01-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司，DP73顯微鏡拍照系統(tǒng)購自日本OLUMPUS公司，Exicycler 96熒光定量PCR儀購自韓國BIONEER公司，NANO 2000紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司)，DYY-7C電泳儀購自中國北京六一儀器廠，ELX-800酶標(biāo)儀購自美國BIOTEK公司，NovoCyte流式細(xì)胞儀購自美國艾森生物。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 12只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，取3只作為正常組，不造模；余9只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為模型組、let-7e-5p激動(dòng)劑對照組及l(fā)et-7e-5p激動(dòng)劑組，9只小鼠建立AR模型：實(shí)驗(yàn)第1、7及14 d腹腔注射含 OVA 25 μg和氫氧化鋁[Al(OH)3] 2 mg的生理鹽水混懸液200 μL對小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，第21天開始自前鼻孔給予含3% OVA的生理鹽水按20 μL/鼻孔進(jìn)行局部激發(fā)、連續(xù)14 d(即第21～34天)；激發(fā)致敏第28～34天，于OVA激發(fā)前3 h向let-7e-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻腔內(nèi)按10 μL/鼻孔滴入5 μmol/Llet-7e-5pagomir，let-7e-5p激動(dòng)劑對照組小鼠鼻腔內(nèi)滴入相同劑量agomir陰性對照片段。正常組和模型組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積生理鹽水。與行為學(xué)觀察結(jié)束后各組小鼠眼眶靜脈取血，腹腔注射過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死小鼠，取鼻黏膜組織。

1.2.2行為學(xué)觀察及評分 各組小鼠于第34天鼻腔致敏30 min內(nèi)觀察抓撓鼻子、打噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，參照文獻(xiàn)[10]對小鼠過敏癥狀進(jìn)行評分，即噴嚏1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，超過11個(gè)為3分；爪偶有撓鼻為1分，爪反復(fù)撓鼻為2分，爪撓鼻面不止和到處摩擦為3分；清涕流至前鼻孔周圍為1分，超過鼻前孔為2分，涕流滿面為3分。以疊加法記錄總分，總分范圍1～9分，總分超過5分說明建模成功。

1.2.3ELISA法檢血清IgE和炎性因子 采集各組小鼠靜脈血1 mL/只，凝集30 min，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集血清，采用ELISA法檢測小鼠血清中IgE、IL-17A及IL-10水平變化，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 取各組小鼠鼻黏膜組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫鈣、透蠟、包埋、切片、水化，蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，伊紅染液浸泡3 min，脫水、透明、封片，于200×顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測let-7e-5p采用總RNA提取試劑(TRIpure)提取各組小鼠鼻黏膜樣本總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；NCBI上查找let-7e-5p和U6序列，采用Primer5設(shè)計(jì)引物(上海生工合成)；以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s及72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；采用2-ΔΔct法計(jì)算樣本let-7e-5p相對表達(dá)量。見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time PCR

1.2.6蛋白印跡法(Western blot)檢測鼻黏膜組織RORγt和Foxp3蛋白 根據(jù)各組小鼠鼻黏膜組織樣本的質(zhì)量和體積加入RIPA裂解液，靜置5 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清得到蛋白抽提物，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度，制備蛋白上樣液，取等量蛋白點(diǎn)樣，SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，浸入脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗，洗膜、37 ℃孵育一抗45 min，ECL底物發(fā)光，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶灰度值，計(jì)算RORγt和Foxp3蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞百分比 采集各組小鼠外周血，采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，加CD4/IL-17A抗體0.125 μg，孵育30 min，加Foxp3抗體1 μg于室溫避光孵育30 min，同時(shí)設(shè)置同型對照，1 000 r/min離心5 min，棄上清、收集細(xì)胞，PBS清洗后加入流式染色液重新懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分和血清IgE、IL-17A及IL-10水平

與正常組比較，模型組小鼠行為學(xué)評分和血清IgE、IL-17A水平明顯增高，IL-10水平明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，let-7e-5p激動(dòng)劑組小鼠行為學(xué)評分、IgE和IL-17A水平明顯下降，IL-10水平明顯升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠行為學(xué)評分和血清IgE、IL-17A及IL-10水平Tab.2 Behavioral scores and levels of serum IgE, IL-17A and IL-10 of mice in each

注：(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。

2.2 鼻黏膜組織病理學(xué)特征

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，未見增厚和炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠鼻黏膜基底層明顯增厚，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，上皮結(jié)構(gòu)紊亂；同模型組比較，let-7e-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻黏膜組織基底結(jié)構(gòu)清晰，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，上皮細(xì)排列相對整齊。見圖1。

2.3 鼻黏膜組織let-7e-5p基因表達(dá)

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中l(wèi)et-7e-5p基因的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，let-7e-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻黏膜組織中l(wèi)et-7e-5p基因的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 鼻黏膜組織RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中RORγt蛋白的表達(dá)增加，F(xiàn)oxp3蛋白的表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同模型組比較，let-7e-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻黏膜組織RORγt蛋白的表達(dá)減少，F(xiàn)oxp3蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖3。

注：箭頭表示炎癥細(xì)胞。

圖1 各組小鼠鼻黏膜組織HE染色(200×)
Fig.1 HE staining of mice nasal mucosa in each group (200×)

注：(1)與正常組比較 P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

圖2 各組小鼠鼻黏膜組織let-7e-5p基因的表達(dá)
Fig.2 Expression oflet-7e-5pgene in nasal mucosal tissues of mice in each group

2.5 外周血CD4+Foxp3+ Treg細(xì)胞和CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞百分比

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠外周血中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群比例明顯降低(P<0.01)，CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞亞群比例明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，let-7e-5p激動(dòng)劑組CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群比例顯著升高，CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞亞群比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖4。

注：(1)與正常組比較P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

圖3 各組小鼠鼻黏膜組織RORγt和Foxp3蛋白的表達(dá)(Western blot)
Fig.3 Expression of RORγt and Foxp3 in nasal mucosa of mice in each group(Western blot)

表3 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4+Foxp3+ Treg和CD4+IL-17A+ Th17細(xì)胞亞群的比較Tab.3 Changes of CD4+Foxp3+Treg and CD4+IL-17A+ Th17 subsets in peripheral blood of

注：(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。

圖4 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4+Foxp3+ Treg和CD4+IL-17A+ Th17細(xì)胞亞群的流式結(jié)果Fig.4 Flow diagram of CD4+Foxp3+Treg and CD4+IL-17A+ Th17 subgroup in peripheral blood of mice in each group

3 討論

AR是一種常見的由IgE介導(dǎo)的鼻變態(tài)反應(yīng)性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻癢、打噴嚏、流清涕和鼻塞。AR雖然不直接威脅患者生命，但嚴(yán)重影響患者的生活、學(xué)習(xí)和工作[11]。目前臨床治療方法主要包括避免接觸過敏原、藥物治療和免疫治療[12]。然而，針對AR預(yù)防和治療的有效藥物研究進(jìn)展緩慢，免疫治療仍是臨床實(shí)踐中最有效的治療手段[13]。因此，迫切需要挖掘AR發(fā)病機(jī)制，探明新型分子靶點(diǎn)，開發(fā)治療AR的新方法。本研究為避免雌激素對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，以獲得更加穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，僅選用雄性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。OVA致敏建立AR小鼠模型，與生理鹽水對照組比較，模型組小鼠鼻部摩擦、打噴嚏和流涕噴率增加，行為學(xué)評分顯著增高(P<0.01)，類似臨床AR表現(xiàn)，同時(shí)血清IgE的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，說明AR小鼠模型建立成功。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為22個(gè)核苷酸(nt)的非編碼RNA，通過結(jié)合靶mRNA的3'-UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，導(dǎo)致基因降解或翻譯抑制[14]。miRNAs在干細(xì)胞自我更新和多能性、器官發(fā)生、細(xì)胞周期、心血管疾病和腫瘤發(fā)生等多種過程中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明，miRNAs在過敏性氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[16]，一些miRNAs亦被發(fā)現(xiàn)參與AR的不同方面：如miR-375作用于Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transduction 3，STAT3)通路，抑制鼻黏膜細(xì)胞凋亡，改善AR癥狀[17]；miR-487b通過調(diào)節(jié)白介素33(interleukin 33，IL-33)/腫瘤發(fā)生抑制蛋白2(suppression of tumorigenicity 2，ST2)信號(hào)通路降低血清IgE水平，減輕AR小鼠鼻部過敏癥狀[18]；miR-199-3p通過調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A，Dnmt3A)-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)炎性因子IFN-γ和TNF-α釋放，將miR-199-3p沉默后小鼠搔鼻和打噴嚏次數(shù)明顯減少[19]。說明miRNAs在AR發(fā)病中扮演重要角色。

MiR-let-7家族在動(dòng)物物種中高度保守，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，let-7e-5p沉默導(dǎo)致促炎因子釋放增加，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[21]。Li等[22]研究證實(shí)，let-7e-5p在AR患者中的水平下降，通過靶向細(xì)胞因子信號(hào)抑制分子4(suppressor of cytokine signaling 4，SOCS4)調(diào)節(jié)Janus激酶1(Janus kinase 1，JAK1)/STAT3信號(hào)活性抑制AR小鼠炎癥反應(yīng)。提示let-7e-5p參與AR的發(fā)生和進(jìn)展。本研究采用Real-time PCR技術(shù)分析AR小鼠鼻黏膜組織，發(fā)現(xiàn)let-7e-5p的表達(dá)較正常組減少(P<0.05)，與前人研究結(jié)果一致[8]。為了進(jìn)一步探討let-7e-5p調(diào)控AR進(jìn)展的具體分子機(jī)制，本研究給予AR小鼠鼻腔內(nèi)滴入let-7e-5p激動(dòng)劑agomir，證實(shí)let-7e-5p過表達(dá)顯著降低小鼠行為學(xué)評分和血清IgE水平，抑制炎性細(xì)胞浸潤鼻黏膜組織，改善小鼠鼻部過敏癥狀(P<0.01)，說明let-7e-5p抑制AR進(jìn)展。

經(jīng)典免疫學(xué)說認(rèn)為Th1和Th2細(xì)胞失衡是AR發(fā)生的免疫學(xué)基礎(chǔ)，生理狀態(tài)下Th1和Th2相互制衡，維持平衡穩(wěn)態(tài)，病理?xiàng)l件下，細(xì)胞平衡被破壞，Th2細(xì)胞百分比增加，Th1細(xì)胞百分比減少，導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常[23-24]。然而伴隨研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)AR的一些臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全用Th1/Th2失衡來解釋[5]。Th17和Treg細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的在免疫耐受方面發(fā)揮重要作用的一類細(xì)胞，Th17和Treg細(xì)胞在功能上互相拮抗，從而維持機(jī)體免疫狀態(tài)相對穩(wěn)定[25]。越來越多的研究證實(shí)，Th17/Treg細(xì)胞平衡與AR的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，可能是對Th1/Th2學(xué)說的重要補(bǔ)充[26]。如Salmani等[27]研究發(fā)現(xiàn)，給予AR患者進(jìn)行快速免疫治療后，F(xiàn)oxp3蛋白的表達(dá)顯著升高；AR小鼠經(jīng)桔皮素(tangeretin)治療后，CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并伴隨神經(jīng)源性位點(diǎn)缺口同系物蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1)/Jagged1通路活性下降[28]。由此可見，調(diào)控Treg/Th17失衡可以增強(qiáng)AR小鼠免疫耐受功能。本研究分析了let-7e-5p激動(dòng)劑agomir對AR小鼠Treg/Th17平衡狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，模型組Treg細(xì)胞亞群較正常組明顯減少，Th17細(xì)胞亞群增加，let-7e-5pagomir顯著減少Th17細(xì)胞亞群，增加Treg細(xì)胞亞群(P<0.01)。此外，與正常組比較，模型組RORγt表達(dá)及血清IL-17A水平升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)及IL-10水平下降(P<0.01)，而采用let-7e-5pagomir干預(yù)后，上述指標(biāo)的表達(dá)趨勢相反。

綜上所述，let-7e-5p在小鼠中可能通過調(diào)節(jié)Foxp3和RORγt的表達(dá)，介導(dǎo)Treg/Th17細(xì)胞平衡，減輕炎癥反應(yīng)，改善AR小鼠鼻部過敏癥狀。