ASPM基因在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

呂珊妹 徐文杰 王藝臻 董學(xué)君

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因[1, 2]。盡管手術(shù)結(jié)合放化療的診療手段取得了一定的提高，但其預(yù)后不良的情況并未改善[3,4]。因此，從分子水平深入研究乳腺癌潛在的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)延長(zhǎng)乳腺癌患者的生存時(shí)間具有重要意義。細(xì)胞有絲分裂相關(guān)基因ASPM (abnormal spindle microtubule assembly)位于1號(hào)染色體，編碼3477個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，在正常細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮紡錘體功能是必不可少的[5, 6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ASPM在多種癌癥中異常表達(dá)，且與肝癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等多種腫瘤的不良預(yù)后顯著相關(guān)[6～9]。然而，ASPM參與癌癥進(jìn)展的機(jī)制尚不明確，并且其在乳腺癌中的表達(dá)和作用機(jī)制的研究較少。為深入研究ASPM與乳腺癌的相關(guān)性，本研究使用Oncomine在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASPM在乳腺癌中的表達(dá)水平，并利用GEO (gene expression omnibus)和TCGA (the cancer genome atlas)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)，探討ASPM與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性及其對(duì)預(yù)后的影響。通過(guò)基因富集分析 (gene sets enrichment analysis, GSEA)、String以及TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)ASPM在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能參與的信號(hào)通路及作用機(jī)制。同時(shí)RT-qPCR驗(yàn)證ASPM在乳腺癌臨床組織樣本中的表達(dá)情況。

材料與方法

1.ASPM表達(dá)量分析:利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.oncomine.org/resource/login.html) 分析ASPM在乳腺癌組織中的表達(dá)情況。以正常組織為對(duì)照，選擇差異表達(dá)倍數(shù)大于2倍、基因排位于前10%且P=0.000的結(jié)果，選擇箱式圖展現(xiàn)結(jié)果。本研究設(shè)置的篩選條件：①Gene：ASPM；②Analysis Type：cancer vs normal analysis；③Cancer Type：breast cancer；④Data Type：mRNA；⑤Sample Type：Clinical Specimen。

2.ASPM與乳腺癌患者臨床資料相關(guān)性分析:在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)上的GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載乳腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE3494的系列矩陣數(shù)據(jù)文件，以獲得表達(dá)原始數(shù)據(jù)和臨床資料。GSE3494采用的平臺(tái)是Affymetrix公司的GPL96基因表達(dá)芯片 (Affymetrix Human Genome U133A Array)，包含251例乳腺癌樣本及對(duì)應(yīng)的臨床信息。從TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù) (https://cancergenome.nih.gov/)中共下載1090例乳腺癌組織樣本，排除目的基因表達(dá)值和臨床信息缺失的病例。根據(jù)ASPM表達(dá)值的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，χ2檢驗(yàn)分析ASPM表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。GSE3494數(shù)據(jù)庫(kù)中采用Kaplan-Meier法分析ASPM表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。采用Kaplan-MeierPlotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)選取乳腺癌頁(yè)面，分析ASPM表達(dá)與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系。

3.基因富集分析:官方網(wǎng)站(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) 下載GSEA 2.2.4版本并按照其運(yùn)行說(shuō)明進(jìn)行GSEA分析。將GSE3494數(shù)據(jù)集中的乳腺癌樣本根據(jù)ASPM (219918_s_at)表達(dá)值的中位數(shù)分為ASPM高表達(dá)組和ASPM低表達(dá)組。選擇MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)的KEGG基因集 (c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt)作為參照基因集，按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000次，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR)<0.25以及P<0.05，預(yù)測(cè)高表達(dá)ASPM富集的基因集，探究ASPM可能參與的信號(hào)通路機(jī)制研究。

4.蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析:STRING數(shù)據(jù)庫(kù) (https://string-db.org/)是一個(gè)包含2031種物種和960萬(wàn)種蛋白質(zhì)的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)可分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，結(jié)合基因富集分析結(jié)果，進(jìn)一步分析乳腺癌中ASPM相關(guān)蛋白的相互作用。

5.TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析:利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，對(duì)ASPM在乳腺癌組織中的表達(dá)與BUB1、CCNA2、CDC20C、CDK1、DLGAP5C、KIF11C、KIF23、NCAPG、TTK的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。本研究設(shè)置的篩選條件：①Cancer Type：breast invasive carcinoma，共1093例；②gene symbols (Y-axis)：ASPM；③gene symbols (X-axis)：BUB1、CCNA2、CDC20C、CDK1、DLGAP5C、KIF11C、KIF23、NCAPG、TTK；④correlation adjusted by：tumor purity。

6.RT-qPCR:采用Trizol 法提取乳腺癌組織樣本總RNA，使用TaKaRa One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為: 42℃ 5min, 95℃ 10s (反轉(zhuǎn)錄)；95℃ 5s，60℃ 20s，40個(gè)循環(huán)(PCR反應(yīng))；95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s (溶解曲線分析)。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△Cq法計(jì)算ASPM mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列如下：ASPM上游引物：5′-TCCGAAGTTGTAATCGCAGT-3′，下游引物： 5′-GTTGCAGGGGATTTGTGATT-3′； β-actin上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCAC-GAT-3′。

結(jié) 果

1.乳腺癌組織中ASPM的表達(dá)情況:Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與正常乳腺組織比較，ASPM基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，共有9個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，2880個(gè)樣本。在TCGA Breast芯片包含的6個(gè)子數(shù)據(jù)庫(kù)中，ASPM在乳腺癌組織中的表達(dá)分別是正常乳腺組織的9.248、7.378、9.379、8.673、6.466、7.590倍 (P<0.01，圖1)。

圖1 Oncomine子數(shù)據(jù)庫(kù)中ASPM mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)

2.乳腺癌組織中ASPM表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性：本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中1090例乳腺癌患者 (表1)和GSE3494數(shù)據(jù)集中251例乳腺癌患者 (表2)的ASPM mRNA相對(duì)表達(dá)量及臨床隨訪資料，研究ASPM表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，ASPM表達(dá)均與ER、PR水平 (P=0.000)顯著相關(guān)，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ASPM表達(dá)還跟年齡 (P=0.002)以及TNM分期中的T分期 (P=0.000)和N分期 (P=0.030)顯著相關(guān)。GSE3494數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示，ASPM還與腫瘤直徑(P=0.000)和淋巴結(jié)浸潤(rùn) (P=0.012)顯著相關(guān)。

3.ASPM表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系：本研究利用GSE3494數(shù)據(jù)集 (251例乳腺癌患者)和Kaplan-MeierPlotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌組織ASPM表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。GSE3494數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果為L(zhǎng)og-Rank=9.821，P=0.002 (圖2A)；Kaplan-MeierPlotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果為HR=1.71， 95%CI： 1.38～2.13，P=0.000(圖2B)，ASPM高表達(dá)乳腺癌患者總體生存率短于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ASPM與乳腺癌患者 (GSE3494)的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

表2 ASPM與乳腺癌患者 (TCGA)的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

4.ASPM高表達(dá)的基因集富集分析:本研究在明確ASPM基因與乳腺癌多個(gè)臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性后，進(jìn)一步分析ASPM基因促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制。將GSE3494數(shù)據(jù)集中的251個(gè)乳腺癌樣本按照ASPM (219918_s_at)表達(dá)值的中位數(shù)分為ASPM高表達(dá)組 (n=126)和ASPM低表達(dá)組 (n=125)，選用 MsigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG基因集作為參照基因集進(jìn)行GSEA分析。ASPM高表達(dá)組乳腺癌樣本主要富集在細(xì)胞周期 (圖3A)、氧化磷酸化 (圖3B)、DNA修復(fù) (圖3C)、錯(cuò)配修復(fù) (圖3D)、剪接體 (圖3E)和蛋白酶體 (圖3F)基因集。

5.與ASPM相關(guān)蛋白的分析：本研究通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASPM蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)多個(gè)蛋白與ASPM相互作用，其中包括BUB1、CENPE、KIF23、KIF11、DLGAP5、CCNA2、NCAPG、TTK、CDC20、CDK1 (圖4)。結(jié)合GSEA分析結(jié)果，在細(xì)胞周期中， BUB1、CCNA2、TTK、CDC20、CDK1這些相關(guān)蛋白與ASPM表達(dá)上調(diào)有關(guān)。同時(shí)，在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中ASPM與BUB1 (r=0.878，P=4.62e-320，圖5A)、CCNA2 (r=0.848，P=3.11e-275，圖5B)、TTK (r=0.851，P=3.08e-279，圖5C) 都具有強(qiáng)相關(guān)性，與CDC20 (r=0.683，P=1.62e-137，圖5D)和CDK1 (r=0.774,P=2.27e-199，圖5E)也有一定的相關(guān)性。

圖2 Kaplan-Meier法分析ASPM表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性A.GSE3494數(shù)據(jù)集；B.Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)

圖3 GSEA分析ASPM高表達(dá)的乳腺癌樣本富集基因集A.細(xì)胞周期 (P=0.000；FDR=0.003；ES=0.68)；B.氧化磷酸化 (P=0.002；FDR=0.004； ES=0.60)；C.DNA修復(fù) (P=0.000；FDR=0.003；ES=0.77)；D.錯(cuò)配修復(fù) (P=0.000；FDR=0.008；ES=0.71)；E.剪接體 (P=0.010；FDR=0.008；ES=0.51)；F.蛋白酶體 (P=0.000；FDR=0.007；ES=0.73)

圖4 String數(shù)據(jù)庫(kù)中與ASPM相互作用的蛋白質(zhì)

6.RT-qPCR驗(yàn)證ASPM mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá):本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了13對(duì)乳腺癌及癌旁組織中ASPM的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示乳腺癌病灶組織中ASPM的表達(dá)水平顯著高于其配對(duì)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01, 圖6)，與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果一致。

討 論

ASPM位于人類染色體1q31，編碼由3477個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，在維持有絲分裂紡錘體功能的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。ASPM基因可能參與了DNA損傷修復(fù)的相關(guān)過(guò)程，該基因的缺失會(huì)影響細(xì)胞有絲分裂、分裂方向和分化方式，造成DNA損傷增加和細(xì)胞凋亡[10]。最新的研究表明，ASPM在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)，干擾ASPM表達(dá)可以減少腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[11～13]。ASPM與肝細(xì)胞癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的預(yù)后不良顯著相關(guān)[14]。上述研究均提示，ASPM異常表達(dá)與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，然而ASPM表達(dá)與乳腺癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性及預(yù)后的研究仍較為缺乏。

圖5 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析A.ASPM與BUB1的相關(guān)性 (r=0.878，P=4.62e-320)；B.ASPM與CCNA2的相關(guān)性 (r=0.848，P=3.11e-275)；C.ASPM與TTK的相關(guān)性 (r=0.851，P=3.08e-279)；D.ASPM與 CDC20的相關(guān)性 (r=0.683，P=1.62e-137)；E.ASPM與CDK1的相關(guān)性 (r=0.774, P=2.27e-199)

圖6 RT-qPCR驗(yàn)證ASPM在13對(duì)乳腺癌配對(duì)組織中mRNA的表達(dá)

本研究首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常的乳腺組織比較，ASPM在乳腺癌組織中的表達(dá)異常升高。進(jìn)一步對(duì)收集的乳腺癌配對(duì)組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與配對(duì)的癌旁組織比較，ASPM的mRNA水平在乳腺癌組織中顯著上調(diào)。通過(guò)GSE3494數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床資料完整的乳腺癌樣本，回顧性分析發(fā)現(xiàn)，ASPM與多項(xiàng)臨床指標(biāo)顯著相關(guān)。在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均發(fā)現(xiàn)ASPM與ER水平、PR水平顯著相關(guān) (P=0.000)。ASPM與年齡僅在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中顯著相關(guān) (P=0.002)，可能是TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)包含有1090例乳腺癌患者，而GSE3494只含有251例，樣本量不夠大。此外，在GSE3494數(shù)據(jù)集中，ASPM與腫瘤直徑、淋巴結(jié)浸潤(rùn)顯著相關(guān) (P=0.000)；在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，ASPM與TNM分期中的T分期 (P=0.000)、N分期 (P=0.03)顯著相關(guān)，與M分期 (P=0.724)無(wú)相關(guān)性，提示ASPM在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮癌基因的作用。通過(guò)GSE3494數(shù)據(jù)集中的乳腺癌患者的臨床隨訪數(shù)據(jù)資料，發(fā)現(xiàn)ASPM高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差。Kaplan-MeierPlotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)也證實(shí)了ASPM高表達(dá)患者的總體生存率顯著低于ASPM低表達(dá)患者。這些結(jié)果提示ASPM表達(dá)水平升高與預(yù)后不佳有關(guān)，可作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的臨床指標(biāo)。

本研究進(jìn)一步利用GSE3494數(shù)據(jù)集的251例乳腺癌樣本進(jìn)行基因富集分析，發(fā)現(xiàn)ASPM高表達(dá)與細(xì)胞周期、氧化磷酸化、DNA修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、剪接體和蛋白酶體等基因集關(guān)系密切。多數(shù)腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)出染色體的改變，包括缺失、易位和多倍體等[15]。細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖過(guò)程中的主要步驟，腫瘤的發(fā)生都有一個(gè)共同特征即細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂。而ASPM與細(xì)胞周期過(guò)程中的紡錘體功能密切相關(guān)，影響著細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而影響細(xì)胞的增殖[16]。ASPM還能與Cdk2/Cyclin E復(fù)合物相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)其泛素化、磷酸化和在細(xì)胞核內(nèi)的定位來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的活性[17]。胃癌的起源細(xì)胞，缺乏特定的生物學(xué)標(biāo)志物，唯一表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，可以參與干細(xì)胞的自我更新和胃癌發(fā)展，其與ASPM密切相關(guān)，共同參與了關(guān)鍵細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，故ASPM可作為胃癌干細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物[18]。ASPM可以通過(guò)增強(qiáng)Wnt-β-catenin信號(hào)通路維持前列腺癌細(xì)胞的干性特征[19]。這些結(jié)果提示ASPM可能通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及癌細(xì)胞的干性，影響乳腺癌的增殖能力，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，通過(guò)GSE3494數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，發(fā)現(xiàn)ASPM與乳腺癌多個(gè)病理指標(biāo)有關(guān)，可以通過(guò)多種途徑來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，從而影響患者的臨床預(yù)后水平，其有望成為預(yù)警乳腺癌不良預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，其促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍需要開(kāi)展進(jìn)一步研究。