二氫楊梅素對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

王署美 王 琳 王 碩 李萬忠 李海健 呂艷娜 趙春貞

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)是一種存在于天然植物中的多酚羥基雙氫黃酮類化合物，廣泛存在于葡萄科屬植物，其藥理作用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素具有調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管、抗炎等多種藥理作用，可改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能[1～4]。目前二氫楊梅素對于H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用尚未見報(bào)道。本研究利用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型，探討二氫楊梅素的作用效果及機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞及培養(yǎng):大鼠高分化嗜鉻瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液，加10%的胎牛血清，于37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.主要試劑：二氫楊梅素(DHM，HPLC≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司；高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍(lán)購自美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33342購自美國Sigma-Aldrich公司；Bax、Bcl-2和caspase-3兔多克隆抗體，GAPDH小鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800熒光標(biāo)記的二抗購自美國LI-COR公司。

3.細(xì)胞分組及干預(yù):細(xì)胞隨機(jī)分組，分為正常對照組、模型組(100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(10μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(20μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(40μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)。PC12細(xì)胞采用DHM干預(yù)0.5h后，給予H2O2進(jìn)行處理，24h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

4.細(xì)胞活性檢測:取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以5×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24h后，加入終濃度10、20、40μmol/L的DHM溶液作用0.5h后，加100μmol/L的H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)24h。避光加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h后，加入100μl的DMSO，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀檢測570nm波長處的A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組平均值/對照組平均值×100%。

5.LDH檢測:采用ELISA法測定細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)含量。取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按5×104個/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞隨機(jī)分組，培養(yǎng)24h后收集上清液按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書操作說明測定LDH含量。LDH(%)=實(shí)驗(yàn)組平均值/對照組平均值×100%。

6.Hoechst 33342染色:取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于24孔板，至于CO2孵箱37℃培養(yǎng)24h，等細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分組，加終濃度為10、20、40μmol/L的DHM處理后0.5h，加100μmol/L的H2O2溶液處理，置于CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，每次5min，加冰甲醇固定10min，棄去固定液，用PBS清洗3遍，每次5min，加入10μg/ml的Hoechst 33342染色液，室溫避光染色10min，棄掉染色液，用PBS清洗2遍，每次5min，吸棄液體，用碳酸甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化。顯微鏡下選取5個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比取平均值。

7.Western blot法檢測：細(xì)胞處理同上，24h后收集細(xì)胞，加適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，與加樣緩沖液混合后100℃煮沸5min變性，采用10%的SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加7.5%脫脂牛奶封閉2h，加抗Bax、Bcl-2、caspase-3和GAPDH抗體孵育過夜，TBST清洗3遍，每次5min，加熒光二抗孵育2h，TBST清洗后，Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)掃描。采用Quantity One軟件分析條帶灰度變化。

結(jié) 果

1.DHM對PC12細(xì)胞活性和LDH釋放的影響:MTT結(jié)果顯示，H2O2對PC12細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞存活率明顯下降，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，DHM 10、20、40μmol/L劑量組細(xì)胞存活率顯著提高(圖1，P<0.01)。與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中的LDH含量顯著增高(P<0.01)，經(jīng)DHM處理后，LDH含量顯著下降(P<0.05)，表明DHM顯著降低H2O2對PC12細(xì)胞的氧化損傷，詳見圖2。

2.Hoechst 33342觀察DHM對細(xì)胞凋亡的影響：正常對照組PC12細(xì)胞的細(xì)胞核輪廓完整，細(xì)胞大且細(xì)胞核呈圓形，而凋亡小體少。H2O2處理后PC12細(xì)胞核明顯固縮，DHM處理后細(xì)胞核固縮的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3A)。與對照組比較，H2O2組凋亡細(xì)胞百分比顯著增高，經(jīng)DHM 10、20、40μmol/L處理后，細(xì)胞凋亡百分比顯著降低(圖3B，P<0.01)。

3.PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的影響:Western blot法結(jié)果顯示，與對照組比較， 模型組PC12細(xì)胞中Bax和caspase-3蛋白表達(dá)顯著增高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，DHM 10、20、40μmol/L組Bax和caspase-3蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白顯著增高，Bax/Bcl-2比例顯著下降(圖4)。

圖1 二氫楊梅素對細(xì)胞存活百分比的影響與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P < 0.01

圖2 二氫楊梅素對乳酸脫氫酶活性的影響與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖3 Hoechst33342檢測細(xì)胞凋亡的影響A.Hoechst染色圖；B.凋亡率；與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；Bar=50μm

圖4 Western blot法檢測Bcl-2、Bax和caspase-3 表達(dá)的影響A.電泳圖；B.Bax/GAPDH;C.Bcl-2/GAPDH;D.Bax/Bcl-2/;E.caspase-3/GAPDH;與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.05, ##P<0.01

討 論

二氫楊梅素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎抗氧化等藥理作用，尤其是抗氧化作用。多項(xiàng)研究證實(shí)，DHM通過抑制氧自由基的形成減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞或組織損傷[5～7]。氧化應(yīng)激增強(qiáng)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡壞死[8]。二氫楊梅素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中能夠緩解氧化應(yīng)激引起的損傷，可能對神經(jīng)退行性疾病的治療和預(yù)防發(fā)揮保護(hù)作用。本研究采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷，初步探討二氫楊梅素保護(hù)PC12細(xì)胞氧化損傷的效果與機(jī)制。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞氧需求高且存在大量對過氧化反應(yīng)敏感的細(xì)胞，特別容易受到活性氧損傷。氧化應(yīng)激在阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過程中發(fā)揮非常重要的作用[9, 10]。神經(jīng)退行性疾病無法治愈，神經(jīng)元細(xì)胞逐漸退化死亡導(dǎo)致運(yùn)動或精神障礙。盡管它無法治愈，但神經(jīng)退行性變的進(jìn)展可被天然氧化劑阻斷從而減緩神經(jīng)元細(xì)胞的丟失。本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同濃度二氫楊梅素增加了PC12細(xì)胞的存活率，保護(hù)PC12細(xì)胞免受H2O2損傷。LDH含量是檢測細(xì)胞死亡的一個重要指標(biāo)，H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放增加，而二氫楊梅素處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平明顯減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)二氫楊梅素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有很好的保護(hù)作用。

大量研究表明H2O2誘導(dǎo)多種神經(jīng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外H2O2過量使氧化還原失衡，誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。筆者采用Hoechst染色結(jié)果顯示，二氫楊梅素明顯降低細(xì)胞凋亡百分比，表明二氫楊梅素能明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2是凋亡家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，作用于線粒體外膜，阻止線粒體釋放caspase，來影響細(xì)胞凋亡[12,13]。為進(jìn)一步研究二氫楊梅素的抗凋亡作用機(jī)制，Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，H2O2能夠顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞的Bax和caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而二氫楊梅素能顯著抑制促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。已有研究表明H2O2導(dǎo)致細(xì)胞毒性和caspase-3蛋白過表達(dá)，且多種黃酮類化合物通過抑制caspase-3減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明二氫楊梅素能夠增加H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡，并通過抑制caspase-3蛋白和Bax/Bcl-2比例，實(shí)現(xiàn)保護(hù)PC12細(xì)胞氧化損傷的效果。氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷是許多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等發(fā)病的重要機(jī)制。二氫楊梅素作為廣泛存在于天然植物的有效成分，對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用預(yù)示對神經(jīng)退行性疾病的潛在療效，是一種重要的藥物前體成分。