長鏈非編碼RNA DSCAM-AS1在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳 琦 陳 慧 池華茂 許文林

目前，乳腺癌是世界范圍內(nèi)的女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。中國乳腺癌的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)在世界范圍內(nèi)位居前列，晚期乳腺癌的形勢更為嚴(yán)峻，5年生存率僅約20%[2，3]。基因的異常表達(dá)在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，多項(xiàng)研究證明長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 在基因轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[4，5]。越來越多的研究者通過高通量測序技術(shù)建立lncRNA表達(dá)譜和數(shù)據(jù)庫，尋找與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，為靶向治療乳腺癌提供研究基礎(chǔ)與理論依據(jù)。DSCAM-AS1被證實(shí)在肺腺癌組織中高表達(dá)，而在乳腺癌中報(bào)道較少。本研究通過檢測DSCAM-AS1在乳腺癌患者組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與乳腺癌患者病理特征的關(guān)系，探討DSCAM-AS1在乳腺癌進(jìn)展中的作用，為發(fā)現(xiàn)診斷乳腺癌的新型分子標(biāo)志物提供研究依據(jù)。

材料與方法

1. 標(biāo)本資料:本研究所有樣本來源于2016年9月～2017年9月就診于江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院乳腺外科的乳腺癌患者，術(shù)前采集乳腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織60對，納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有術(shù)前未接受輔助放化療，且術(shù)后病理證實(shí)為乳腺癌；②患者臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過輔助放化療的患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③存在精神疾病患者；④合并有心臟、肺等臟器嚴(yán)重功能障礙的患者；⑤正在參與其他研究的患者。其中，浸潤性導(dǎo)管癌43例，導(dǎo)管內(nèi)癌12例，黏液癌5例，患者年齡41～80歲，>45歲患者45例，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，ER陽性患者42例，PR陽性患者27例，HER-2陽性患者34例，T1/T2期患者44例，T3/T4期患者16例，ki-67表達(dá)水平>10% 陽性患者41例。各分子分型luminal A型12 例，luminal B型23 例，HER-2陽性15 例，以及Basal-like 10例。

2.主要試劑:RNAiso試劑、SYBR Premix ExTaq Kit購自大連寶生物工程有限公司，lncRNA/mRNA RT-PCR Kit購自廣州銳博生物公司。

3.標(biāo)本處理:組織標(biāo)本用PBS清洗后，剪切成適當(dāng)大小分裝于凍存管中，儲存于-80℃冰箱備用。

4.RNA提取及qRT-PCR:樣本直接按試劑盒的提取步驟進(jìn)行總RNA提取，組織樣本在液氮中研磨成粉末后，用RNAiso進(jìn)行RNA的提取，按照lncRNA/mRNA RT-PCR Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。引物由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成，DSCAM-AS1 上游引物: 5′-TGATATCCGGACACATGGTGA-3′，下游引物：5′-CTGCAAAAACGTGCTGAGAAT-3′。采用SYBR Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測熒光信號水平，20μl反應(yīng)體系[2×SYBR Green 10μl, Primer (上游引物+下游引物)4μl，cDNA 2μl，ddH2O 4μl]，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃ 5s，60℃ 34s，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。采用2-ΔCT值計(jì)算癌組織及癌旁組織中DSCAM-AS1的相對表達(dá)量，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.生存曲線分析:采用Kaplan-MeierPlotter (http://kmplot.com/analysis/index. php?p=service & cancer=breast) 網(wǎng)站在線信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫中的616例乳腺癌患者DSCAM-AS1的差異表達(dá)對其總體生存率的影響[6]。

結(jié) 果

1.DSCAM-AS1在乳腺癌及各分子分型組織中表達(dá):乳腺癌組織中DSCAM-AS1的表達(dá)水平為0.473±0.073，高于癌旁組織 (0.057±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.667，P=0.000),詳見圖1。乳腺癌各分子分型之間DSCAM-AS1的表達(dá)存在差異 (F=7.053,P=0.000)，經(jīng)兩兩比較，lumial A型、luminal B型以及Basal-like表型的組織中DSCAM-AS1的表達(dá)高于癌旁組織 (P=0.000)，而HER-2陽性表型的組織與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖1 乳腺癌組織中DSCAM-AS1的表達(dá)情況

圖2 乳腺癌組織各分子分型中DSCAM-AS1的表達(dá)水平與癌旁組織比較，*P=0.000

2.乳腺癌組織標(biāo)本中DSCAM-AS1與臨床特征的相關(guān)性分析：通過60例患者的病理參數(shù)進(jìn)行分析，組織中DSCAM-AS1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.275，P=0.022)，ER (χ2=4.775，P=0.029)、HER-2 (χ2=5.984，P=0.014)，TNM分期 (χ2=4.105，P=0.043)及ki-67 (χ2=6.213，P=0.013)的表達(dá)水平相關(guān)，ER陽性，HER-2陽性及ki-67陽性表達(dá)的組織中DSCAM-AS1的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),詳見表1。

表1 組織中DSCAM-AS1的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

3.組織標(biāo)本DSCAM-AS1表達(dá)水平的ROC曲線分析:組織中DSCAM-AS1的敏感度為56.7%，特異性為98.33%，曲線下面積為0.7517 (P=0.000)，詳見圖3。

圖3 乳腺癌組織DSCAM-AS1的表達(dá)水平ROC曲線分析

4.DSCAM-AS1影響乳腺癌患者的總生存率：根據(jù)KM-plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，在大樣本數(shù)據(jù)庫中的616例乳腺癌中，高表達(dá)DSCAM-AS1 患者的總生存率降低 (P=0.18, HR=1.30)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌樣本中的109例ER陽性的患者中，高表達(dá)的DSCAM-AS1的患者的總體生存率顯著下調(diào) (P=0.007, HR=2.88)，而在79例ER陰性的患者中，與低表達(dá)組比較，高表達(dá)DSCAM-AS1患者的總體生存率也出現(xiàn)下降 (P=0.12, HR=1.80)，詳見圖4。

討 論

長鏈非編碼RNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7～10]。有研究者在綜合數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus (GEO) 和 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 中篩選出龐大數(shù)量的lncRNA，通過生物信息學(xué)和基因組數(shù)據(jù)分析研究這些lncRNAs的潛在生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中敲低lncRNA TINCR和HOTAIR，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為乳腺癌中致癌lncRNA的研究提供了理論基礎(chǔ)[11]。本研究前期通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，DSCAM-AS1在乳腺癌敏感和耐藥細(xì)胞株中出現(xiàn)差異表達(dá)，且在乳腺癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中DSCAM-AS1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且luminal A、luminal B，Basal-like表型的組織中DSCAM-AS1的表達(dá)高于癌旁組織，而HER-2陽性表型的組織與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測DSCAM-AS1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

圖4 生物信息學(xué)分析DSCAM-AS1在乳腺癌組織中的生存曲線A.乳腺癌患者中DSCAM-AS1的總體生存率；B.ER陽性患者中DSCAM-AS1的總體生存率；C.ER陰性的患者中DSCAM-AS1的總體生存率

非編碼RNA的表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性對診斷價(jià)值分析有著重要參考意義，本研究重點(diǎn)分析了DSCAM-AS1的表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。筆者發(fā)現(xiàn)，ER陽性的患者中DSCAM-AS1的表達(dá)水平高于ER陰性的患者，表明DSCAM-AS1與ER的表達(dá)存在相關(guān)性，DSCAM-AS1可能在ER調(diào)控的乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。筆者還發(fā)現(xiàn)T3/T4期乳腺癌患者中高表達(dá)DSCAM-AS1，表明DSCAM-AS1的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，并且ki-67表達(dá)陽性的患者中DSCAM-AS1也出現(xiàn)高表達(dá)。乳腺癌血漿中HOTAIR表達(dá)水平與ER和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，并且ROC曲線分析其敏感度和特異性均>70%，提示HOTAIR對乳腺癌有著極高的診斷價(jià)值，可以認(rèn)為是乳腺癌診治的分子標(biāo)志物[12]。非編碼RNA CCHE1在乳腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2表達(dá)水平有關(guān)，并且高表達(dá)的CCHE1組的中位PFS和OS都低于低表達(dá)組[13]。

DSCAM-AS1參與乳腺癌的功能調(diào)控的機(jī)制尚不清楚，馬騰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DSCAM-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能參與線粒體功能調(diào)控導(dǎo)致氧化磷酸化水平的改變，導(dǎo)致線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)增加。lncRNA 主要通過轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后水平，通過調(diào)控基因表達(dá)及重要信號通路，影響腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移甚至預(yù)后[14,15]。有研究發(fā)現(xiàn)DSCAM-AS1在多種雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且雌激素誘導(dǎo)下ER可以結(jié)合在DSCAM-AS1啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致DSCAM-AS1表達(dá)升高，證明DSCAM-AS1與ER存在相關(guān)性[16]。何玉峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者雌激素受體、孕激素受體及人類表皮生長因子受體2的表達(dá)可應(yīng)用于預(yù)測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，同時(shí)單純ER陽性的乳腺癌患者，相比較其他分子表型，最容易發(fā)生單純骨轉(zhuǎn)移，提示ER表達(dá)水平在乳腺癌的進(jìn)展轉(zhuǎn)移中起重要的作用。

有研究表明，高表達(dá)的DSCAM-AS1能夠作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后不良因素，通過調(diào)控細(xì)胞周期的生長或停滯影響luminal型乳腺癌的內(nèi)分泌治療，影響患者的無病生存期[18]。它還能通過CeRNA機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加乳腺癌對他莫昔芬耐藥[19]。因此，DSCAM-AS1可能在雌激素受體陽性的乳腺癌患者中，發(fā)揮著影響乳腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的重要作用，筆者通過生物信息學(xué)分析DSCAM-AS1的表達(dá)水平對乳腺癌患者總體生存率的影響，筆者發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的DSCAM-AS1降低了ER陽性乳腺癌患者的生存率。本研究通過ROC曲線評價(jià)DSCAM-AS1針對乳腺癌的效能，筆者發(fā)現(xiàn)組織中DSCAM-AS1的表達(dá)水平在乳腺癌診斷中的價(jià)值較好，其曲線下面積均>0.5，且特異性較高。

目前，DSCAM-AS1在腫瘤中的報(bào)道較少，尤其在乳腺癌中的作用還未進(jìn)行深入探討，本研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且與ER、腫瘤分期呈相關(guān)性，提示DSCAM-AS1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并在乳腺癌的診斷上有較高的價(jià)值。