心理應(yīng)激對(duì)大鼠牙周炎組織NF-κB表達(dá)的影響

鄧道坤 劉 佳 張 旻 陳永進(jìn) 李 強(qiáng)

牙周炎是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，其主要因素是宿主對(duì)細(xì)菌及其產(chǎn)物的不良反應(yīng)。然而，單純的菌斑微生物因素目前還難以解釋牙周炎的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制。臨床實(shí)驗(yàn)與流行病學(xué)研究證實(shí)，許多牙周炎患者存在不良心理狀態(tài)，心理應(yīng)激與牙周炎存在密切關(guān)聯(lián)[1,2]。筆者課題組前期研究也證實(shí)了心理應(yīng)激可以加重大鼠牙周炎、延緩其愈合反應(yīng)，但具體機(jī)制尚不明確[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一類參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)等生理病理活動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)重要核轉(zhuǎn)錄因子，并被證明在牙周炎組織中表達(dá)明顯升高[4]。心理應(yīng)激狀態(tài)下，需要明確加重的大鼠牙周炎炎癥組織中NF-κB會(huì)出現(xiàn)怎樣的變化。因此，本研究通過(guò)建立大鼠牙周炎模型和心理應(yīng)激模型，觀察心理應(yīng)激作用下NF-κB在牙周組織中的表達(dá)變化來(lái)探討其對(duì)牙周炎的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:4-0 醫(yī)用編織絲線(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)，氟西汀注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字:H12020957，天津金耀氨基酸有限公司)，DYCZ-24DN雙垂直蛋白電泳儀及WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)， ELX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，全蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65以及內(nèi)參抗體 β-actin(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)；RD1412-OF 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(上海Mobile-datum 公司)；大鼠皮質(zhì)酮及促腎上腺皮質(zhì)激素ELISA 試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：40只同源雄性SD大鼠[體重200～220g，第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：2015倫審學(xué)(048)號(hào)]隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組(A組)、實(shí)驗(yàn)性牙周炎組(B組)、心理應(yīng)激組(C組)、實(shí)驗(yàn)性牙周炎+心理應(yīng)激組(D組)、實(shí)驗(yàn)性牙周炎+心理應(yīng)激+氟西汀組(E組)。每組8只動(dòng)物，飼養(yǎng)時(shí)間4周。所有動(dòng)物均于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))統(tǒng)一飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22±1℃，相對(duì)濕度60%±5%。

3.動(dòng)物模型建立：參照Z(yǔ)hao等[3]的方法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，即對(duì)大鼠施行10g/L戊巴比妥鈉3.5mg /kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，4-0醫(yī)用無(wú)菌絲線結(jié)扎大鼠右上頜第二磨牙頸部；利用口腔檢查、頜骨大體標(biāo)本觀察以及組織形態(tài)學(xué)觀察，驗(yàn)證大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎建模的成功有效[3]。參照Cui等[5]的方法應(yīng)用CUMS法建立動(dòng)物心理應(yīng)激模型，即將禁食 12h、禁水 12h、潮濕墊料24h、束縛應(yīng)激1h、強(qiáng)迫浸水4℃ 5min、強(qiáng)迫浸水45℃ 5min、晝夜顛倒共計(jì) 7種應(yīng)激因子以隨機(jī)方式施加于大鼠，每日只施加1種應(yīng)激因子，1周內(nèi)每種應(yīng)激因子施加1次，相同的應(yīng)激不可連續(xù)施加2天。4周后，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化，ELASA 法測(cè)定大鼠血清中皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的水平變化，以驗(yàn)證 CUMS 法建模的有效性。

4.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠由曠場(chǎng)正中放入，儀器上方的攝像機(jī)自動(dòng)記錄指標(biāo)，包括大鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間和大鼠曠場(chǎng)移動(dòng)總距離。每只大鼠的測(cè)試時(shí)間為15min。測(cè)試完成之后，清除設(shè)備內(nèi)遺留排泄物，75%乙醇擦拭去除上一只大鼠留下的氣味及痕跡后，再進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。

5.血清學(xué)檢測(cè)：使用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后通過(guò)眼球取血2ml，4℃放置約 1～2h 后 4℃條件下 3000r/min離心30min，吸取上層血清，置于-80℃保存?zhèn)錅y(cè)。選用ELASA試劑盒檢測(cè)大鼠血清CORT和ACTH的含量。

6.NF-κB檢測(cè):取右上側(cè)第二磨牙區(qū)域牙齦組織，通過(guò)Western blot法檢測(cè)牙齦組織中IκBα、p-IκBα、p65和p-p65 的蛋白質(zhì)水平。具體方法：眼科剪剪碎牙齦組織，經(jīng) 4℃ 預(yù)冷，PBS 沖洗，組織裂解液裂解提取齦組織總蛋白，BCA 法定量，配膠，上樣，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉 1h，加入一抗 4℃孵育過(guò)夜，熒光二抗孵育 1h，Bio-Rad 發(fā)光儀進(jìn)行 ECL 法發(fā)光檢測(cè)。用軟件 Quantity One 對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描并分析。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行One-wayANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與對(duì)照組和單純實(shí)驗(yàn)性牙周炎組動(dòng)物比較，單純心理應(yīng)激后大鼠的中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，總移動(dòng)距離明顯縮短(P<0.05)，且與牙周炎+心理應(yīng)激組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而應(yīng)用氟西汀后上述指標(biāo)恢復(fù)至正常水平(P>0.05，圖1)。

2.血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果：ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，動(dòng)物接受心理應(yīng)激刺激后，兩種典型的應(yīng)激激素CORT和ACTH的含量顯著升高(P<0.05)，并與牙周炎合并心理應(yīng)激的動(dòng)物比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而氟西汀可有效逆轉(zhuǎn)這種升高的趨勢(shì)(P>0.05，圖2)。

圖1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果A.中央?yún)^(qū)停留時(shí)間；B.移動(dòng)距離。與A組比較，*P<0.05

圖2 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果A.皮質(zhì)醇；B.促腎上腺皮質(zhì)激素。與A組比較，*P<0.05

圖3 p-IκBα、IκBα蛋白表達(dá)檢測(cè)A.p-IκBα、IκBα Western blot法檢測(cè)結(jié)果；B.p-IκBα相對(duì)表達(dá)量;C.IκBα相對(duì)表達(dá)量。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

3.p-IκBα和IκBα蛋白表達(dá)檢測(cè)：p-IκBα和IκBα的Western blot法檢測(cè)和分析結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組比較，單純心理應(yīng)激并不引起p-IκBα和IκBα的表達(dá)變化(P>0.05)，而牙周炎牙齦組織的p-IκBα蛋白含量上升、IκBα的蛋白含量下降(P<0.05)。當(dāng)牙周炎動(dòng)物接受心理應(yīng)激刺激后，炎性組織的p-IκBα上升幅度以及IκBα下降幅度更加明顯(P<0.05)。經(jīng)過(guò)心理應(yīng)激拮抗治療后，升高表達(dá)的p-IκBα以及降低表達(dá)的IκBα趨向正常，但與對(duì)照組、單純牙周炎組和單純心理應(yīng)激組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4.NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè)：NF-κB p65和p-NF-κB p65的Western blot法檢測(cè)和分析結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組比較，單純牙周炎導(dǎo)致p-NF-κB p65蛋白含量上升(P<0.05)。牙周炎復(fù)合心理應(yīng)激后，牙周炎組織中p-NF-κB p65的高表達(dá)更加明顯，并且遠(yuǎn)大于單純牙周炎和單純心理應(yīng)激組(P<0.05)。氟西汀拮抗心理應(yīng)激后，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)有所下降，但仍高于對(duì)照組、單純牙周炎組和單純心理應(yīng)激組(P<0.05)。NF-κB p65的蛋白表達(dá)在各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

圖4 NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè)A.p-NF-κB p65、NF-κB p65 Western blot法檢測(cè)結(jié)果；B.p-NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量;C.NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

牙周炎作為一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，特征在于牙齒支持結(jié)構(gòu)的破壞。根據(jù)第4次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查，35～44歲居民的牙石檢出率為96.7%，牙齦出血檢出率為87.4%，牙周炎作為牙齒脫落的罪魁禍?zhǔn)祝渲匾杂用黠@。牙周組織中的微生物及其產(chǎn)物被認(rèn)為是牙周炎的始動(dòng)因素，但是單純菌斑學(xué)說(shuō)尚不足以解釋牙周炎的發(fā)病機(jī)制。20世紀(jì)以來(lái)，隨著生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的發(fā)展，心理因素在牙周炎發(fā)生和進(jìn)展中的重要性得到了越來(lái)越廣泛地認(rèn)可[6]。NF-κB作為細(xì)胞內(nèi)重要核轉(zhuǎn)錄因子，它涉及機(jī)體的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)等，其在牙周炎中的作用日益凸顯。體外研究顯示，牙齦卟啉單胞菌和其他致病性牙周細(xì)菌可促進(jìn)牙周組織中NF-κB的合成，而且牙周病患者牙周組織中存在大量NF-κB激活相關(guān)產(chǎn)物(TNF-α、IL-1)[7]。除此之外，研究證明，牙周病的發(fā)病機(jī)制和易感性可能與NF-κB的激活有關(guān)[4]。然而，到目前為止，NF-κB作為重要的炎性反應(yīng)因子，其在心理應(yīng)激加重牙周炎發(fā)展過(guò)程中扮演的角色尚未明晰[8]。

本研究通過(guò)7種應(yīng)激因子隨機(jī)施加于大鼠建立心理應(yīng)激模型，建立慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激動(dòng)物模型，該模型已在國(guó)際上被廣泛應(yīng)用，并被認(rèn)為可有效避免大鼠對(duì)重復(fù)應(yīng)激產(chǎn)生的耐受性以及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[6]。本課題組前期研究已顯示，心理應(yīng)激加重牙周組織破壞、延緩了牙周炎的愈合進(jìn)程[3]。經(jīng)過(guò)分析顯示，本研究中接受心理應(yīng)激的動(dòng)物，其自發(fā)性活動(dòng)較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)性牙周炎組明顯下降。并且，應(yīng)激激素水平明顯高于對(duì)照組和單純牙周炎組，與之前的研究結(jié)果相似[1]。在進(jìn)行有效的藥物治療后，大鼠上述變化指標(biāo)恢復(fù)至對(duì)照水平，這說(shuō)明本研究心理應(yīng)激模型建立成功。

NF-κB 是一類普遍存在的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由Rel蛋白家族成員中的兩種組成同源或異源二聚體，如p65-p65或p65-p50。在多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB與抑制蛋白 IκB 結(jié)合形成三聚體，一般情況下沒(méi)有活性。IκB 抑制蛋白家族能掩蓋 NF-κB 的核定位信(NLS)，抑制 NF-κB 核易位。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，TRAF/RIP與 TAK1 或者 TRAFs 和NIK 結(jié)合啟動(dòng) NF-κB 經(jīng)典及非經(jīng)典通路，使 Iκκ 活化。當(dāng) Iκκ 活化后，IκB 蛋白被磷酸化，最終降解，從而釋放了 NF-κB二聚體；游離的 NF-κB 二聚體通過(guò)各種轉(zhuǎn)錄后被激活，并進(jìn)入細(xì)胞核，與胞核內(nèi)特異的DNA鏈結(jié)合，進(jìn)而加快目的基因的轉(zhuǎn)錄。在眾多研究中， IκB、p-IκB、p-NF-κB p65的含量變化等都被作為NF-κB信號(hào)通路激活的標(biāo)志[9]。

NF-κB和各種疾病的密切關(guān)系受到研究者的廣泛關(guān)注，包括炎癥、免疫性疾病、癌癥等[10,11]。有病例對(duì)照研究將45例男性按年齡分為應(yīng)激組與對(duì)照組，測(cè)得應(yīng)激組中壓力誘導(dǎo)外周血NF-κB與DNA結(jié)合活性顯著增高[12]。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，褪黑素可通過(guò)抑制p65的核轉(zhuǎn)位來(lái)減少心理應(yīng)激誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)來(lái)改善細(xì)胞凋亡，表明心理應(yīng)激與NF-κB存在密切關(guān)聯(lián)[13]。Ambili等[4]通過(guò)免疫組化和PCR技術(shù)測(cè)量患病和健康牙齦組織細(xì)胞中NF-κB表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)患病組織明顯高于健康組織。牙周炎發(fā)展到后期，常表現(xiàn)為大量牙槽骨吸收，而NF-κB信號(hào)通路與骨吸收的關(guān)系已經(jīng)非常明確——即NF-κB與破骨細(xì)胞形成和骨吸收活性增加呈正相關(guān)[14]。上述研究提示，NF-κB在心理應(yīng)激誘導(dǎo)牙周炎過(guò)程中可能起到了一定的作用。

本研究結(jié)果顯示，在牙周炎模型的基礎(chǔ)上施加心理應(yīng)激，會(huì)進(jìn)一步促使p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白水平的上升以及IκBα蛋白水平的下降，而NF-κB p65蛋白含量不變，提示心理應(yīng)激促進(jìn)了IκBα和NF-κB p65的磷酸化，最終的結(jié)果是NF-κB通路被激活。而在氟西汀治療后，p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)量下降、IκBα蛋白表達(dá)量上升，NF-κB p65總量無(wú)明顯變化，說(shuō)明NF-κB通路被抑制。這與之前研究者對(duì)牙周炎研究中涉及到的NF-κB測(cè)量結(jié)果類似[15]。這些發(fā)現(xiàn)表明，NF-κB信號(hào)通路的激活參與中心理應(yīng)激加速牙周炎的發(fā)生、發(fā)展，心理應(yīng)激治療通過(guò)糾正牙周局部NF-κB過(guò)度激活，能夠在很大程度上減少對(duì)牙周組織的損傷。然而，藥物治療組p-IκBα和p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)仍高于單純牙周炎組，IκBα表達(dá)仍低于單純牙周炎組，說(shuō)明心理應(yīng)激拮抗治療并未完全逆轉(zhuǎn)心理應(yīng)激造成的牙周炎齦組織中NF-κB過(guò)度激活。這提示牙周炎是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，心理應(yīng)激因素去除后，牙周炎局部環(huán)境可能還存在著其他影響NF-κB過(guò)表達(dá)的因素。比如，ROS也可以激活牙周炎中的NF-κB信號(hào)，從而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，最終觸發(fā)炎性反應(yīng)和破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致牙周破壞[16]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，慢性應(yīng)激可通過(guò)抑制糖皮質(zhì)激素受體-α信號(hào)，介導(dǎo)NF-κB活性上調(diào)，最終表現(xiàn)為牙槽骨喪失，牙周帶深度增加[17]。

綜上所述，筆者推測(cè)NF-κB信號(hào)通路是心理應(yīng)激加重牙周炎的重要機(jī)制之一，心理應(yīng)激可以誘導(dǎo)NF-κB的過(guò)表達(dá)，從而導(dǎo)致牙周炎的加重。在未來(lái)的研究中，筆者將繼續(xù)深入探討NF-κB是如何通過(guò)調(diào)節(jié)上、下游分子來(lái)介導(dǎo)心理應(yīng)激加重牙周炎病變，從而為研究牙周炎的心理病因?qū)W發(fā)病機(jī)制及有效防治提供新的防治策略。