動(dòng)物類脂肪酸脫氫酶研究進(jìn)展

吳 敏，孫敬蒙，張煒煜*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021）

PUFAs具有較高藥用價(jià)值，其生理功能可作用于心血管系統(tǒng)疾病、促進(jìn)細(xì)胞生長、抗炎、抗癌、免疫調(diào)解等作用；缺乏不飽和脂肪酸，會(huì)引起生長發(fā)育遲緩，血小板減少，加速衰老，不能供儲(chǔ)能量等癥狀[1]。其中二十碳五烯酸（20：5 n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22：6 n-3，DHA）及二十碳四烯酸（花生四烯酸，20：4 n-6，AA）并不能被動(dòng)物自身合成，只有動(dòng)物在外界環(huán)境的刺激或食物攝取獲得。最近研究發(fā)現(xiàn)，一些動(dòng)物在外界低溫環(huán)境的刺激下，能通過動(dòng)物體內(nèi)存在的FADs將外源性攝入的亞油酸（Linoleic acid，LA），和亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）轉(zhuǎn)化成EPA、DHA、AA，來滿足自身的需要[2]；FADs能催化與載體結(jié)合的飽和或不飽和脂肪酸在脂酰鏈上形成雙鍵，例如△6-脂肪酸脫氫酶（△6-FAD）可以在脂肪酸的6號碳上脫氫，形成引入成雙鍵。PUFAs參與了生物膜的構(gòu)成，對生物膜的形成和物理性質(zhì)、膜脂中脂肪酸的組成與不飽和度等方面起主要調(diào)節(jié)作用，恒溫動(dòng)物或變溫動(dòng)物能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中脂肪酸的飽和程度來適應(yīng)外界環(huán)境溫度的變化，這種適應(yīng)能力主要是通過FADs對脂肪酸的去飽和催化作用來實(shí)現(xiàn)的，主要不飽和脂肪酸類別，見表1。

因此，F(xiàn)ADs受到極大關(guān)注，特別是近年來FADs在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)、基因工程方面都取得相當(dāng)進(jìn)展，成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。

表1 主要的不飽和脂肪酸類別

1 PUFAs的研究進(jìn)展

我國對于脂肪酸脫氫酶的研究相對較晚，但在近幾年，發(fā)展非常迅速，取得了令人矚目的成就。根據(jù)引入C=C不飽和雙鍵時(shí)所具有的鏈長特異性和位置特異性，F(xiàn)AD有△4、△5、△6、△9、△12和 △15 共6種[5]。

THIEDE M A等[6]首先從鼠肝中分離到△9-FAD的基因組文庫（cDNA），并在煙草中得到表達(dá)。ARONDEL V等[7]首先從擬南芥中分離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中△15-FAD基因的cDNA，后來陸續(xù)在擬南芥葉綠體、大豆質(zhì)體、油菜微粒體中分離到，藍(lán)細(xì)菌、擬南芥、水稻、線蟲線粒體中也克隆到△15-FAD基因。隨后，霉菌、琉璃苣、線蟲、鼠、人等20余種生物中都分離到了該基因，并分別在釀酒酵母、煙草、油菜、馬鈴薯、曲霉、大豆中獲得功能性表達(dá)。MICHAETON L V等[8]首次報(bào)道了從線蟲中分離到△5-FAD基因，并在酵母中進(jìn)行了功能性表達(dá)。

1.1 △6-FAD及其合成PUFAs的途徑 近年來，關(guān)于△6-FAD研究最多，△6-FAD是在不飽和脂肪酸的第6位和第7位碳原子脫氫，從而引入雙鍵，是多不飽和脂肪酸形成過程中的限速酶[9]。AKI T等[10]從大鼠中克隆了△6-FAD的全長基因，從人體內(nèi)克隆出△6-FAD的全長基因。吳景等[11]克隆得到鏡鯉肝臟中高不飽和脂肪酸（HUFA）合成代謝的△6-FAD基因cDNA全序列。于海彥等[12]以家蠶最新基因組數(shù)據(jù)庫資源為依據(jù)，通過生物信息分析方法對家蠶脂肪脫氫酶進(jìn)行克隆、序列分析，并對家蠶n3-FAD和△6-FAD基因進(jìn)行了表達(dá)模式、原核表達(dá)、釀酒酵母表達(dá)進(jìn)行研究。李凱等[13]以武定雞和大圍山微型雞為研究對象，檢測肌肉組織中脂肪酸含量及△6-FAD基因表達(dá)量，比較不同雞種脂肪酸含量及FAD基因表達(dá)差異。

△6-FAD合成多不飽和脂肪酸途徑是在從油酸（oleic acid，OA）開始，從而進(jìn)入多不飽和脂肪酸代謝的n-3途徑，也可以直接進(jìn)入n-6途徑。此時(shí)，2條途徑中的LA和α亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）必須經(jīng)△6-FAD的催化分別轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸（γ-1inolenic acid，GLA）和十八碳四烯酸（octadecatetraenoic acid，OTA）。GIA和OTA在其它酶的催化下經(jīng)過一系列延長和脫氫，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成n-3和n-6途徑中諸如AA、DHA，見圖1。

圖1 △6-FAD合成PUFAs的途徑

1.2 △9-FAD合成PUFAs的途徑 △9-FAD是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)其cDNA的酶，研究初期相關(guān)報(bào)道較少，但近年來△9-FAD的研究也較為深入，△9-FAD以C18的脂酰-輔酶A（脂酰-CoA）和脂酰-?；d體蛋白（脂酰-ACP）為底物，在第9、10位碳原子間引入第一個(gè)雙鍵，是目前唯一已知的可溶性脂肪酸脫氫酶。從草魚體內(nèi)克隆出△9-FAD，同時(shí)發(fā)現(xiàn)△9-FAD mRNA 在肝臟和大腦中的表達(dá)量最高[14-15]。虱目魚、鯉魚和羅非魚體內(nèi)均克隆得到了△9-FAD[16-18]。吳永保等[19]利用PCR-SSCP技術(shù)檢測安卡雞、文昌雞和如皋雞△9-FAD基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP），并對不同基因型與胸肌脂肪酸含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。HYEKYUNG P C等[20]首次從甲殼動(dòng)物中華絨螯蟹肝胰腺組織中克隆出△9-FAD，并在中華絨螯蟹各組織內(nèi)，對該基因的含量進(jìn)行定量檢測，結(jié)果表明△9-FAD基因在中華絨螯蟹肝胰腺中表達(dá)量最高。PERLING P等[21]證明地中海鰨中存在脂肪酸延長酶和△4-FAD，并發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境會(huì)引起△9-FAD基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞膜上的PUFAs會(huì)顯著增加，來保持膜的流動(dòng)性以適應(yīng)冷水環(huán)境。這一點(diǎn)已在多種魚類中得到證明[22]。

△9-FAD合成多不飽和脂肪酸途徑是在從多不飽和脂肪酸的代謝從硬脂酸（18：0）開始，必須在△9-脂肪酸脫氫酶的催化下形成OA，進(jìn)而進(jìn)入到下一步的氧化過程中，見圖2。

圖2 △9-FAD合成PUFAs的途徑

1.3 △5-FAD及其合成PUFAs的途徑 △5-FAD是多不飽和脂肪酸合成途徑中的第2個(gè)限速酶[23-25]，，其合成多不飽和脂肪酸途徑是一部分從20：4二十碳四烯酸（花生四烯酸；ARA）開始，必須經(jīng)過△5-FAD的催化作用，催化生成EPA。另外一部分從20：3γ-次亞麻酸開始，必須經(jīng)過△5-FAD的催化作用，才能催化生成AHA，見圖3。

圖3 △5-FAD合成PUFAs的途徑

1.4 其他種類脂肪酸脫氫酶 △4-FAD是DHA合成過程的關(guān)鍵酶酶。當(dāng)硬脂酸（18：0）經(jīng)過都△5-FAD合成途徑催化生成EPA后，必須經(jīng)過△4-FAD催化最終形成DHA。

△12-FAD、△15-FAD是動(dòng)物體內(nèi)沒有的2種脂肪酸脫氫酶，△12-FAD又稱油酸脫氫酶（oleate desaturases）只存在于植物和微生物中，因?yàn)槿撕筒溉閯?dòng)物細(xì)胞中缺乏在脂肪酸的第9位碳原子以上位置引入不飽和雙鍵的脫氫酶[26-28]。其主要作用是在單不飽和脂肪酸油酸的第12和13位碳原子之間插入一個(gè)雙鍵，形成含有2個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸-亞油酸。因?yàn)樗荘UFAs代謝n-3、n-6途徑的限速酶，所以控制著植物細(xì)胞中大多數(shù)不飽和脂肪的合成。同時(shí)它也是油酸脫氫形成亞油酸的關(guān)鍵酶。

△15-FAD在植物中一般有2個(gè)基因，一個(gè)在微粒體中，一個(gè)在質(zhì)體中。ARONDEL V等首先從擬南芥（Arabidopsis）中分離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中△15-FAD基因的cDNA，后來陸續(xù)在擬南芥葉綠體、大豆質(zhì)體、油菜微粒體中，藍(lán)細(xì)菌、水稻、線蟲線粒體中也克隆到該基因[29-31]。

2 PUFAs的合成途徑

在生物體內(nèi)，動(dòng)物類PUFAs的合成共有兩個(gè)途徑，其中，一條途徑為脂肪酸延長去飽和途徑，它是以硬脂酸（18：0）為底物，通過脂肪酸延長酶與脫氫酶作用完成的[32-33]。PUFAs的合成可分為n-6和n-3兩種途徑，分別由ALA經(jīng)n-6和n-3途徑中的各種脫氫酶和延長酶的催化經(jīng)過一系列脫氫和延長進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成AA、EPA、DHA。另一條途徑為聚酮合酶合成途徑，因其不涉及到脂肪酸脫氫酶的催化過程，故本文不進(jìn)行分析。見圖4。

圖4 PUFAs的延長去飽和合成途徑

3 PUFAs的基因工程

目前主要的幾種脂肪酸脫氫酶都已從動(dòng)物、植物和真菌等不同生物體中克隆到，并在多種微生物、模式植物、油料種子作物和一些動(dòng)物中獲得功能性表達(dá)。賈雪琦等[33]針對人類基因組密碼子的使用特性對大豆n-3和n-6脂肪酸脫氫酶基因的編碼序列進(jìn)行改造，為得到可以產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定了一定基礎(chǔ)，從而對人體內(nèi)必需脂肪酸的合成的研究提供了思路。

4 小結(jié)

研究表明，越來越多的疾病與不飽和脂肪酸的攝入及代謝的不平衡有關(guān)，脂肪酸脫氫酶的研究和應(yīng)用以及基因的克隆和轉(zhuǎn)化研究越來越受到重視。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是基因工程手段的利用，越來越多的脂肪酸脫氫酶基因被克隆到動(dòng)植物體內(nèi)，通過脂肪酸脫氫酶基因的遺傳操作來控制生物體中PUFAs的組成，獲得功能性脂肪酸成為可能，從而提高人們的生活質(zhì)量。