活血止痛丸質(zhì)量標準研究

陶思宇，張永萍，陳曉蘭，徐幫會，劉純純，劉政岑

（貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025）

活血止痛方是遵義市劉端方骨傷醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，源于貴州苗族，用于治療骨傷病早期損傷。活血止痛方由丹參、當歸尾、赤芍、茯苓、連翹等27味中藥組成，具有行氣活血、化瘀止痛之功效，可使瘀血得散、氣血得通，促進骨折的愈合[1-3]。本試驗對赤芍、西紅花、木香、連翹、梔子進行了薄層鑒別，測定了本方組成中赤芍的丹酚酸B含量，以準確、可靠、專屬性強為基準，建立了該苗藥組方的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津2030，LabSolutions，LC-2030C 3D），DZ-20可傾式多功能制丸機（溫嶺市林大機械有限公司）；AUW120D十萬分之一電子天平（島津制作所），TGL-16B高速離心機（上海安亭科學儀器廠），紫外分析儀（型號：WD-9403C，上海金鵬分析儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 丹酚酸B對照品（批號：111562-201716）；赤芍對照藥材（批號：121093-201303）；西紅花對照藥材（批號：121009-201704）；木香對照藥材（批號：0921-200104）；連翹對照藥材（批號：120908-201216）；上述對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。陰性對照品除去處方中所含鑒別藥材后按該制劑工藝制備而成；活血止痛丸(自制）；甲酸、正丁醇等試劑均為分析純；乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 定性鑒別

2.1 赤芍的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取活血止痛丸約4.0 g，研細，加蒸餾水50 mL，超聲60 min，濾過，取濾液10 mL，加水飽和正丁醇（1：1）溶液萃取2次，每次10 mL，取正丁醇層，加氨試液2.5 mL，萃取，取正丁醇層，加正丁醇飽和水（1：1）溶液萃取2次，每次7.5 mL，取正丁醇層，揮干，加2 mL甲醇溶解，備用[4]。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取赤芍對照藥材約0.5 g，按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法制備。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取缺赤芍和牡丹皮的雙陰性活血止痛丸樣品約4.0 g，按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法制備。

參考2015版《中國藥典》第4部通則0502上面的質(zhì)量控制檢識方法，吸取供試品溶液15 μL，赤芍的對照藥材溶液10 μL及赤芍和牡丹皮的雙陰性對照溶液各15 μL，采用TLC進行檢識，三氯甲烷—乙酸乙酯—甲醇—甲酸（20：2.5：5：0.5）作為展開劑進行展開，待溶劑前沿到達板的頂端時取出，隨后用5%香草醛硫酸乙醇溶液潤濕該薄層板，放置幾分鐘后放入恒溫烘箱中用105 ℃加熱至斑點顯色清晰，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[4]。見圖1。

圖1 活血止痛丸（赤芍）TLC鑒別圖

2.2 西紅花的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取活血止痛丸樣品約0.36 g，研細，加甲醇1 mL，超聲處理10 min，放置使澄清，取上清液作為供試品溶液[5]129。

2.2.2 對照藥材溶液的制備 取西紅花對照藥材約20.0 mg，按“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制備。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取缺西紅花的陰性活血止痛丸樣品約0.36 g，按“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制備。

參照2015版《中國藥典》第4部通則方法，取上述3種溶液各5 μL進行薄層定性分析，以展開劑乙酸乙酯—甲醇—水 （100：16.5：13.5）進行展開，然后記錄在紫外燈的顯示情況[5]。見圖2。

圖2 活血止痛丸（西紅花）TLC鑒別圖

2.3 木香的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取活血止痛丸樣品約5.0 g，研細，加三氯甲烷10 mL進行超聲30 min后過濾，將濾液收集備用[5]62。

2.3.2 對照藥材溶液的制備 取對照藥材粉末約0.5 g，加甲醇10 mL，超聲30 min后濾過，濾液即為對照藥材溶液。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 取缺木香的陰性活血止痛丸樣品約5.0 g，按“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法制備。

參照2015版《中國藥典》第4部通則方法，對上述3種溶液各3～5 μL進行薄層檢識，以展開劑三氯甲烷—環(huán)己烷（5：1）進行展開，待溶劑前沿到達板的頂端時取出，隨后采用1%的香草醛硫酸乙醇溶液潤濕該薄層板，最后將該薄層板放置105 ℃恒溫烘箱中直到樣品的點清晰取出。見圖3。

圖3 活血止痛丸（木香）TLC鑒別圖

3 含量測定

本丸劑由27味藥組成，丹參為方中君藥，丹酚酸B作為丹參主要成分之一。故以丹酚酸B為指標建立HPLC含量測定方法，經(jīng)方法學驗證表明該方法簡便、穩(wěn)定可行。

3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，550）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（21：79）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫20 ℃；進樣量10 μL。

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加甲醇-水（8：2）的混合溶液制成濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 稱取研細的活血止痛丸約0.5 g，精密稱定，于25 mL容量瓶中，加入25 mL 80%甲醇后稱重，超聲提取60 min，取出，冷卻，用80%甲醇補足重量，離心10 min，取上清液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備 按活血止痛丸的制備方法制成不加丹參的陰性丸，同“3.3”項下供試品溶液的制備方法制成缺丹參的陰性對照溶液。

3.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別取丹酚酸B對照品溶液、供試品溶液及缺丹參藥材陰性供試品溶液各10 μL，按“3.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結(jié)果丹酚酸B的保留時間約為28.5 min，分離度均在1.5以上，理論塔板數(shù)為6 000，陰性對照溶液和空白對照溶液均無干擾。見圖4～圖6。

圖4 丹酚酸B對照品溶液

圖5 供試品溶液

圖6 陰性對照溶液

3.6 線性關(guān)系考察 分別取1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL 配好的丹酚酸B對照品溶液（C對=0.382 8 mg/mL），定容到 10 mL，精密吸取10 μL，按“3.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標（y），丹酚酸B質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/mL），得線性回歸方程：y=8E+06 x -4719.8（r=0.999 8）。結(jié)果表明在0.038 28～0.084 22 mg/mL范圍內(nèi)峰面積與丹酚酸B對照品溶液濃度呈良好的線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL按“3.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD=0.058 8%＜3%，表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗 按“3.3”項下供試品溶液的制備方法制備1份供試品，放置0、1、2、4、6、8 h后，分別按“3.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積結(jié)果RSD=0.830%，說明供試品中丹酚酸B在8 h內(nèi)穩(wěn)定，用此方法測活血止痛丸中丹酚酸B的含量時，供試品放置時間不宜超過8 h。

3.9 重復性試驗 精密稱取研細的活血止痛丸6份，分別按“3.3”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算活血止痛丸中丹酚酸B的含量，結(jié)果測得酚酸B的平均含量為3.206 mg/mL，RSD=0.506%，表明重復性良好。

3.10 回收率試驗 精密稱取約0.25 g研細的活血止痛丸9份，分別置于25 mL容量瓶中，精密加入相當于0.5 g中丹酚酸B的質(zhì)量的50%、100%、150%的丹酚酸B對照品溶液，各3份，按“3.3”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果每個回收率都在95%～105%范圍內(nèi)，RSD=0.78%＜2%，回收率達到要求，表明活血止痛丸中的其它成分對丹酚酸B的含量測定影響不大或建立的此方法對丹酚酸B的含量無顯著影響。見表1。

表1 丹酚酸B對照品回收率試驗表

3.11 活血止痛丸中丹酚酸B的含量 取3個不同批次的活血止痛丸，按“3.3”項下制備供試品溶液，得3份供試品溶液。分別進樣10 μL，按“3.1”項下色譜條件進行測定。見表2。

表2 活血止痛丸中丹酚酸B的含量

4 討論

本試驗因活血止痛丸處方藥味較多，成分復雜，易出現(xiàn)陰性干擾，故赤芍供試品與陰性對照采用了正丁醇萃取去除雜質(zhì)，而木香的供試品與陰性對照采用了三氯甲烷代替甲醇超聲濾過提取的方法。含量測定供試品制備純化過程中發(fā)現(xiàn)，供試品超聲后用0.45試驗的微孔濾膜過濾，經(jīng)過多次方法學考察，丹酚酸的回收率均在80%左右，懷疑是濾膜的滯留作用導致。經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)采用高速離心純化相較于微孔濾膜過濾丹酚酸B含量要高且回收率達到要求，證實微孔濾膜對丹酚酸B具有截留作用。所以確定供試品的純化方法為超聲后直接高速離心。綜上所述，建立了活血止痛丸的質(zhì)量標準，為其質(zhì)量控制提供參考。