基于網(wǎng)絡藥理學的人參、黃連“藥對”治療2型糖尿病作用機制研究

孫瑞茜 傅強 趙進喜

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組常見的以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝內(nèi)分泌疾病，其引發(fā)的一系列并發(fā)癥嚴重危害著人類健康。中醫(yī)藥治療2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)有較好的療效，課題組基于《內(nèi)經(jīng)》“壯熱食氣”的理論，結合長期的臨床觀察，提出T2DM的基本病機為熱傷氣陰，治療強調(diào)清熱益氣養(yǎng)陰法的應用。

藥對是兩味藥的配伍運用，可使立方療效更彰，人參、黃連“藥對”是古代醫(yī)家常用的對藥，也是清熱益氣法的代表性藥物，唐代孫思邈的《千金方》里就有應用人參、黃連“藥對”治療“消渴病”的記載，漢末年代的《名醫(yī)別錄》中也提到人參、黃連有“止消渴”的作用，可見古人對于人參、黃連“藥對”治療糖尿病早有認識。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參、黃連“藥對”可以改善T2DM胰島素抵抗，保護胰島β細胞，其作用機制與下調(diào)胰島中促炎細胞因子、促凋亡因子的表達，以及上調(diào)調(diào)脂聯(lián)素受體的表達有關[1]，但其具體作用路徑仍不是十分清楚。中藥具有多成分、多靶點的特點，因為中藥方劑的復雜性，其機制研究比較困難。網(wǎng)絡藥理學近來已經(jīng)成為一種高效、系統(tǒng)地揭示中藥方劑分子機制的新手段。網(wǎng)絡藥理學可以將藥物作用所涉及的蛋白靶點納入一個龐大的生物學網(wǎng)絡中，通過分析這一生物學網(wǎng)絡，不僅可以發(fā)現(xiàn)藥物潛在蛋白靶標及靶標之間的相互作用，還可以發(fā)現(xiàn)靶標的功能以及對生物學網(wǎng)絡的影響[2]，進而尋找藥物的潛在作用通路，揭示中藥的配伍規(guī)律，尋找新的適應癥，為中藥的現(xiàn)代化研究提供幫助。

本研究從網(wǎng)絡藥理學出發(fā)，通過相關數(shù)據(jù)庫篩選人參、黃連“藥對”的主要作用成分及靶點，并與T2DM疾病靶點進行匹配，篩選出人參、黃連“藥對”治療T2DM的潛在關鍵靶點，構建藥物—靶點—疾病網(wǎng)絡，通過GO富集及通路富集分析人參、黃連“藥對”治療T2DM的潛在作用機制，為進一步研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 人參、黃連“藥對”成分收集和篩選

使用TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)、TCMSP平臺(version 2.3，traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)篩選人參、黃連兩味藥物化學成分。借助 TCMSP平臺的參數(shù)篩選活性成分，設定藥物成分口服生物利用度(oral bioavailability，OB) ≥30%，類藥性( druglikeness，DL) ≥0.18[3-4]。

1.2 人參、黃連“藥對”化合物靶點獲取

使用蛋白—化合物相互作用數(shù)據(jù)庫STITCH 5.0數(shù)據(jù)庫[5]及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索候選活性成分靶點，限定物種為人，選擇高置信度的靶點(interaction score≥0.7)，剔除沒有靶點的活性成分, 建立化合物—作用靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 T2DM相關靶點檢索

基于TTD 數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database)、DrugBank數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫 (genetic association database)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Type 2 Diabetes Mellitus”為關鍵詞進行檢索，篩選、整理T2DM相關靶點。

1.4 藥物—化合物—關鍵靶點網(wǎng)絡構建

將人參、黃連的活性成分所對應的靶點基因和T2DM相關的靶標基因進行匹配，獲得兩者的共同基因即為人參、黃連“藥對”治療T2DM的關鍵靶點。將靶點信息導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫, 獲得化合物—靶點蛋白相互作用關系，使用Cytoscape[6]軟件(Version 3.5.1)構建“藥物—化合物—靶點”關系網(wǎng)絡及靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中的節(jié)點表示靶點, 邊表示各靶點間的相互關系。

1.5 關鍵靶點GO分析及通路分析

DAVID數(shù)據(jù)庫整合了生物學數(shù)據(jù)庫和分析工具，可進行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析，從大規(guī)模的基因或蛋白序列中挖掘特定基因或蛋白的生物學意義[7]。設定P<0.05，GO富集分析選擇生物過程(biological process)和分子功能(molecular function)，通路富集分析選擇 KEGG數(shù)據(jù)庫。

2 結果

2.1 人參、黃連“藥對”活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出人參化學成分190個，黃連化學成分48個，從TCMID數(shù)據(jù)庫檢索出人參化學成分294個，黃連化學成分30個，剔除重復化學成分，并通過OB≥30%和DL≥0.18進一步篩選得到人參的潛在活性成分29個，黃連潛在活性成分17個。

2.2 靶點收集

通過STITCH數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應的作用靶點，人參對應的靶點有144個，黃連對應的靶點有246個。通過DrugBank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，共收集到350個2型糖尿病相關靶點。將人參、黃連活性成分靶點和T2DM靶點匹配后，得到42個人參、黃連“藥對”治療T2DM潛在靶點。見表1。

2.3 網(wǎng)絡關系構建

2.3.1 藥物—化合物—靶點網(wǎng)絡 將人參、黃連兩味藥物與其活性成分及關鍵靶點基因?qū)隒ytoscape軟件進行網(wǎng)絡構建及可視化。見圖1。結果表明，人參、黃連“藥對”直接與疾病靶點基因相連的活性成分有12個。其中槲皮素(quercetin)、黃連素(berberine)、山奈酚(kaempferol)、花生四烯酸(arachidonate acid)、阿魏酸(ferulic acid)、豆甾醇(stigmasterol)等6個成分能與3個及以上的關鍵靶點基因相連，可能是人參、黃連“藥對”治療2型糖尿病的重要成分。同時，多個化合物又可以具有共同靶點，人參、黃連的共同靶點有15個，分別為VEGFA、UGT1A9、UGT1A3、UGT1A1、TNF、SLC2A4、PTGS2、PTGS1、CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2、CYP1A1、AHR、ABCC1、ABCB1。

表1 人參、黃連“藥對”活性成分治療T2DM潛在靶點

圖1 人參、黃連“藥對”活性成分—靶點網(wǎng)絡圖

2.3.2 關鍵靶點基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡 將人參、黃連治療T2DM的41個關鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫獲取蛋白相互作用關系，再導入Cytoscape軟件繪制蛋白關系網(wǎng)絡。見圖2。該網(wǎng)絡圖共包括42個節(jié)點，229個邊。以連接度(Degree)數(shù)值反映節(jié)點的大小，Degree指與該節(jié)點相關聯(lián)邊的條數(shù)。Degree數(shù)值越大，節(jié)點越大，表明這些靶點參與可更多的生物功能，在網(wǎng)絡中具有重要地位。其中Degree值前五名的靶點有CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、TNF、VEGFA。為了進一步篩選出具有拓撲重要性的主要節(jié)點，計算了網(wǎng)絡中每個節(jié)點的3個拓撲特征：Degree、介度(Betweenness)和緊密度(Closeness)。Degree、Betweenness和Closeness的中值分別為12、0.017和0.516。確定Degree>12、Betweenness>0.017和Closeness>0.516的節(jié)點為主要節(jié)點，這些節(jié)點可能在人參、黃連“藥對”治療T2DM中具有重要意義，共篩選出25個主要靶點，以這些節(jié)點構建基因調(diào)控蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)，并對網(wǎng)絡進行生物過程、分子功能和通路富集分析。見表2。

表2 核心靶點及拓撲學參數(shù)

圖2 人參、黃連“藥對”治療T2DM靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡

2.4 GO分析及通路富集分析

對人參、黃連的25個核心靶點進行GO富集和KEGG 通路分析，選擇P<0.05的結果。生物過程富集結果見圖3，可見靶點關聯(lián)的生物過程主要有藥物代謝過程(7個靶點)、外源化合物代謝過程(8個靶點)、外源性藥物分解過程(5個靶點)、類固醇代謝途徑(6個靶點)等。主要相關的靶點為CYP3A4及其亞型CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C8、CYP1A2等。

分子功能富集結果見圖4，人參、黃連“藥對”核心靶點關聯(lián)的生物過程主要有氧結合、咖啡因氧化酶活性、酶結合、單加氧酶活性、血紅素結合、類固醇羥化酶活性、芳香化酶活性等，表明人參、黃連“藥對”可以通過參與調(diào)控多種生物學功能發(fā)揮作用。

對人參、黃連核心靶點進行KEGG 通路富集,富集結果見圖5，核心靶點富集到的信號通路有 AMPK信號通路(4個靶點)、NF-κB信號通路(3個靶點)、TNF信號通路(3個靶點)以及胰高血糖素信號通路(3個靶點)，可見人參、黃連“藥對”可通過多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮治療T2DM作用。

3 討論

網(wǎng)絡藥理學是中藥研究的新技術、新方法，其研究理念與中醫(yī)“整體觀”的思想不謀而合，十分適用于中藥復方的研究?，F(xiàn)在，網(wǎng)絡藥理學在中藥藥理機制研究、新藥發(fā)現(xiàn)以及不良反應、毒副作用研究等方面均取得了良好成果[8]

本次研究發(fā)現(xiàn)人參、黃連“藥對”的主要活性成分中槲皮素、黃連素、山奈酚、花生四烯酸、阿魏酸、豆甾醇等擁有較多的預測靶點，表明這些化合物可能是人參、黃連“藥對”中產(chǎn)生藥理作用的重要化合物。其中黃連素治療T2DM的機制已有很多研究，黃連素能夠促進胰島β細胞的修復和再生，活化胰島素受體基因的表達、增加胰島素敏感性，能夠提高糖尿病大鼠胰高糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)水平及胰島β細胞的數(shù)量[9]，還可以調(diào)控多個信號通路。

圖3 人參、黃連“藥對”核心靶點生物學過程富集分析

圖4 人參、黃連“藥對”核心靶點分子功能富集分析

圖5 人參、黃連“藥對”核心靶點KEGG通路富集分析

將獲得的人參、黃連的25個核心靶點進行GO分析和通路分析。GO分析和通路富集結果均顯示人參、黃連“藥對”治療T2DM的作用與CYP3A4及其亞型介導的藥物代謝有關。CYP3A4是參與人體藥物代謝的主要酶系，約占人體肝、腸、腎藥物代謝總反應的75%，其代謝速度影響化合物的藥代動力學，也可能影響藥效反應[10]，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下一些藥物的藥動學會發(fā)生改變，可能與CYPs酶活性改變有關[11]。而中藥可以通過誘導或抑制CYP3A4的活性, 加速或減慢其他藥物在體內(nèi)的代謝[12]。進一步研究人參、黃連對CYPs酶活性作用可能對研究藥物相互作用、避免不良反應、促進合理用藥具有重要臨床意義。

此外，人參、黃連“藥對”的核心靶點也和多個信號通路相關，其中TNF、PTGS2、IL1B是NF-κB信號通路、TNF信號通路的共同靶點。NF-κB通路是介導炎癥反應的重要信號通路, 可以引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，導致系列非特異性炎癥反應，進一步引起胰島素抵抗和糖代謝異常。靶點IGF1R、HNF4A、CFTR、SIRT1富集在AMPK信號通路上，AMPK通路是預防代謝綜合征的重要通路，具有調(diào)節(jié)糖原異生和周圍組織的葡萄糖利用功能[13]。一線降糖藥二甲雙胍發(fā)揮生物活性與激活AMPK通路密切相關，二甲雙胍也可以抑制糖尿病大鼠骨骼肌TLR4/NF-κB/TNF-α炎癥信號通路，增加胰島素敏感性[14]。

分析結果顯示，人參、黃連“藥對”改善胰島素抵抗的作用與PPARA、 TNF、 SLC2A2等靶點相關，PPARA的活化可以降低葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達,抑制血管損傷、脂毒性、炎癥、血管生成和血栓形成介質(zhì)的產(chǎn)生[15], 還有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用[16]。臨床上貝特類藥物是PPARA受體激動劑,可治療血脂紊亂和T2DM。SLC2A2編碼的葡萄糖轉運蛋白2在胰島β細胞、肝、腸、腎以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達，可以幫助肝臟發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)的功能, 參與刺激胰島素分泌過程，和空腹血糖受損高膽固醇血癥以及心血管疾病、T2DM的風險增加關系密切[17]，是糖尿病藥物研發(fā)的重要靶標。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法對人參、黃連“藥對”進行分析，發(fā)現(xiàn)了主要活性成分及其潛在作用靶點，通過靶點和通路分析討論了其治療T2DM的作用機制，但仍需要進一步實驗數(shù)據(jù)的支持。此外，本研究也揭示了人參、黃連“藥對”多成分、多靶點和多通路的協(xié)同作用的特點，符合中藥方劑多組分、多功效、協(xié)同作用的特點，為進一步深入研究人參、黃連“藥對”治療T2DM的活性成分和作用機制提供了重要的線索和依據(jù)。