“三法三穴”對坐骨神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP及PKA表達(dá)的影響

羅宇婷 莫巖君 呂桃桃 沈熠 邵帥 張羽墨 于天源

推拿作為中醫(yī)治療周圍神經(jīng)損傷的常用方法，臨床療效好，不良反應(yīng)小。大量研究證明，以三法三穴為代表的推拿手法可以有效促進SNI大鼠受損神經(jīng)及后肢肌力的恢復(fù)。cAMP-PKA信號通路作為目前研究最深入的信號通路之一，在周圍神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是在促進軸突及髓鞘再生、調(diào)節(jié)生長錐、促進NGF表達(dá)等方面。在以三法三穴為代表的推拿手法恢復(fù)周圍神經(jīng)損傷的起效機制中，是否有cAMP及PKA的參與，是探究推拿治療周圍神經(jīng)神經(jīng)損傷機理的重要環(huán)節(jié)。本研究觀察“三法三穴”推拿治療對坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury，SNI)大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)cAMP及PKA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體質(zhì)量(200±10)g，購自北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實驗程序均符合動物福利與倫理原則，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物使用和管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品(索萊寶，PC0001)；彩虹245廣譜蛋白Marker(12條帶)(索萊寶，PR1920)；水合氯醛(滬試公司)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶，PC0020)；10×TBST pH 8.0(索萊寶，T1081)、兔源cAMP抗體(Abcam公司，英國,ab76238)、兔源PKA抗體(Abcam Company，英國，ab32390)。

1.3 主要實驗儀器

按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號200710187403.1)；電泳儀(美國BIO-RAD公司，美國，10002468)；Mini-P-2電泳槽(BIO-RAD公司，美國，10007296)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，1410101)；水平脫色搖床(六一公司，WD-9405FN)； Fresco低溫冷凍離心機(Thermo公司，美國，75007406)；電動組織勻漿器(Fluka公司，美國)。

1.4 造模與干預(yù)方法

1.4.1 造模方法 用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組16只、假手術(shù)組16只、模型組16只、推拿組8只。先將大鼠用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g體重的劑量腹腔注射麻醉；然后俯臥位固定于消毒過的鼠板上，手術(shù)區(qū)(右側(cè)臀股交界處)備皮、常規(guī)消毒，用手術(shù)剪沿坐骨神經(jīng)走行方向剪開大約1 cm的皮膚切口，然后用止血鉗鈍性逐層分離肌肉，暴露梨狀肌下緣及坐骨神經(jīng)；用彎鉤鑷確認(rèn)所暴露的組織確為坐骨神經(jīng)后，用特制無齒10號持針器在距梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持坐骨神經(jīng)5秒，然后逐層縫合，碘伏消毒。假手術(shù)組：預(yù)處理及顯露坐骨神經(jīng)的方法同造模組，但不做夾持。正常組不造模；三法三穴組同模型組。

1.4.2 穴位及推拿儀器的選取 干預(yù)的穴位為殷門、承山及陽陵泉穴。在本次實驗中，除從針灸學(xué)角度考慮此三穴為同時刺激穴位―神經(jīng)―肌肉的最佳點外；從推拿學(xué)角度分析，此三穴在臨床中屬常用穴及強刺激穴。此外，從實驗動物及干預(yù)手法考慮，此三穴有較強的可操作性。按摩推拿手法模擬儀：運用模擬儀進行定性定量推拿手法操作。

1.4.3 干預(yù)方法 各組均在造模后第7天開始干預(yù)。推拿組使用手法模擬儀依次刺激束縛后大鼠右側(cè)“殷門”“承山”“陽陵泉”，其中“殷門”位于后肢上段正中，“陽陵泉”位于后三里上外側(cè)5 mm(后三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處)，“承山”位于后肢腓腸肌兩肌腹形成凹陷處；手法模擬為點法、撥法、揉法；刺激力量為4 N。每穴每法1分鐘，頻率30次/分鐘，總計9 min。正常組、假手術(shù)組、模型組僅抓取，不作干預(yù)。治療次數(shù)：每天1次，每治療7次休息1天。

1.5 指標(biāo)觀測與檢測方法

1.5.1 行為學(xué)檢測 應(yīng)用改良Rivlin法制傾斜板，記錄行為學(xué)評分，每只大鼠重復(fù)測量3次，取平均值。各組分別于術(shù)后7天和干預(yù)20天時做斜板實驗行為學(xué)評分。

1.5.2 標(biāo)本采集 正常組、假手術(shù)組、模型組分別于術(shù)后第7天和干預(yù)20天時，三法三穴組于干預(yù)20天時，每組選取8只大鼠處死。迅速置于冰盤上，取L4～L6節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)，放于液氮罐中冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 DRG中cAMP、PKA蛋白表達(dá) 每組8個樣本進行檢測。組織加入3 mL預(yù)冷的RIPA裂解液充分研磨，12000 rpm低溫離心15 min后取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣本蛋白濃度后，確定蛋白上樣量約10 μg，加入5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。目標(biāo)蛋白上樣后電泳，20分鐘80 V，1小時100 V。轉(zhuǎn)膜時操作條件為2小時120 V。加入5%脫脂牛奶封閉1小時后，1×TBST每10 min洗1次，共洗3次。將PVDF膜按蛋白分子量剪開，分別加入一抗cAMP抗體(1∶50000)、一抗PKA抗體(1∶3000)、一抗CREB (1∶3000)及Anti-N Cadherin(1∶3000)，搖床上室溫孵育60 min后4℃過夜。洗膜，1×TBST每10 min洗1次，共洗3次。所得的印跡經(jīng)二抗HRP-羊抗兔IgG (1∶3000)室溫?fù)u床孵育60 min。1×TBST每10 min洗1次，洗3次。然后使用ECL試劑盒曝光顯影，條帶曝光完畢后，PVDF膜自然晾干后封存。應(yīng)用Quantity One分析軟件計算目標(biāo)條帶積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 斜板實驗

術(shù)后7天時，模型組大鼠斜板實驗評分明顯低于正常組(P<0.05)，假手術(shù)組大鼠斜板實驗評分與正常組無顯著性差異(P>0.05)；干預(yù)20天時，三法三穴組大鼠斜板實驗評分與模型組比較明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠斜板實驗結(jié)果(單位：度；

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠DRG中cAMP的表達(dá)情況

術(shù)后7天時，與正常組比較，模型組表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；干預(yù)20天時，與模型組相比，三法三穴組cAMP表達(dá)水平呈明顯升高趨勢，三法三穴組與模型組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見表2，圖1。

表2 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中cAMP的蛋白表達(dá)

注： 與正常組比較，aP>0.05；與模型組比較，bP>0.05。

2.3 各組大鼠DRG中PKA表達(dá)比較

術(shù)后7天，與正常組比較，模型組PKA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；干預(yù)20天后，與模型組比較，三法三穴組PKA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，且三法三穴組與正常組相比無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表3，圖2。

注：A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：三法三穴組。圖1 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG組織cAMP的蛋白表達(dá)

表3 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中PKA的蛋白表達(dá)

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

注：A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：三法三穴組。圖2 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中PKA的蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 干預(yù)手法及方式

楊超[1]運用Meta分析推拿治療原發(fā)性及繼發(fā)性坐骨神經(jīng)病變手法選擇時，納入的RCTs涉及14種手法，以使用頻次從高到低排序，同時依照治療中以放松類手法為主配合溫通類手法的原則，本實驗選擇了最常用的點、拔、揉三種手法。另實驗中以按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號200710187403.1)進行操作。通過專利儀器的使用，達(dá)到了對“三法三穴”干預(yù)手法定量的要求，保證了實驗結(jié)果的可信度和科學(xué)性。

3.2 推拿治療坐骨神經(jīng)損傷的機制日益明確

前期研究表明，以三法三穴為代表的推拿手法治療周圍神經(jīng)損傷療效確切。主要表現(xiàn)為：對腓腸肌細(xì)胞直徑的恢復(fù)[2]，神經(jīng)髓鞘的修復(fù)[3]，軸突的再生[4-5]；減緩神經(jīng)元凋亡[6]，細(xì)胞骨架的再建[7]，NTF相關(guān)因子(NGF、BDNF、CNTF等)在肌肉、神經(jīng)、脊髓中表達(dá)升高[8]；提高馬達(dá)蛋白kinesin及dynein在脊髓中的表達(dá)，促進軸漿運輸功能恢復(fù)，終改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠的運動及感覺功能[9]。

3.3 cAMP-PKA信號通路在多方面促進周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)

cAMP-PKA信號通路在改善神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境、抑制或中和神經(jīng)元內(nèi)的抑制因子、軸突生長錐導(dǎo)向和致靶過程中軸突投射的準(zhǔn)確性以及促進髓鞘修復(fù)和雪旺細(xì)胞有絲分裂等多方面影響軸突生長。Cai等[10]發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，可以增加cAMP的含量，激活PKA，軸突在接觸MAG之前暴露于BDNF和GDNF使cAMP水平升高，可以阻礙MAG的抑制作用；而加入PKA抑制劑后，BDNF和GDNF對軸突再生的促進作用消失。Cui等[11]證實向大鼠眼球內(nèi)注射cAMP和睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子，能增強大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cells，RGC)的生存能力和促進軸突再生長；而注射神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NTF-4/5)和同量的cAMP，仍可增強RGC的生存能力，但對遠(yuǎn)期軸突再生有抑制作用。這些研究提示cAMP與適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合對促進不同類型的軸突再生有協(xié)同作用；同時，cAMP-PKA信號通路參與生長錐導(dǎo)向的調(diào)節(jié)。Chierzi等[12]證實增加cAMP能促進成年人DRG和RGC軸突生長錐的出芽和再生，是由PKA介導(dǎo)的。Radwan等[13]發(fā)現(xiàn)BDNF、GDNF或NTF-3的梯度可吸引體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的生長錐，當(dāng)分別抑制cAMP和PKA時，這種吸引轉(zhuǎn)變?yōu)榕懦?，證明相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子對生長錐的吸引作用是經(jīng)cAMP-PKA信號通路介導(dǎo)的，這些形態(tài)學(xué)改變(生長錐出芽)與細(xì)胞分子水平機制(細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變)是一致的。Jin M[14]通過切斷脊神經(jīng)后根的體外模型觀察到，大多數(shù)成人脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)的軸突在橫切術(shù)4 h后形成新的生長錐；Qiu[15]在活體內(nèi)抑制PKA的活性，將影響損傷軸突生長錐的出芽?？梢园l(fā)現(xiàn)，cAMP和PKA可以但不限于從促進軸突再生和生長錐出芽等方面修復(fù)受損的周圍神經(jīng)。雖然現(xiàn)有研究無法在時空上確切說明二者表達(dá)變化的先后順序，但大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實PKA作為cAMP的下游效應(yīng)子，二者在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中表達(dá)變化趨同，且作用相似。

Aglah等[16]在實驗中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)cAMP的上調(diào)增加運動神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長，而拮抗cAMP導(dǎo)致培養(yǎng)的大鼠運動神經(jīng)元中神經(jīng)突向外生長顯著減少，這一變化直接影響了周圍神經(jīng)損傷大鼠后肢肌力與運動功能的恢復(fù)情況。因此可以明確，cAMP在大鼠周圍神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元的再生過程中起到了至關(guān)重要的作用。

Walikonis等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP水平在受傷后會發(fā)生顯著變化，當(dāng)坐骨神經(jīng)受到壓迫或永久性橫斷損傷后，其表達(dá)量會下降，并且在髓鞘再生時表達(dá)增加。因此cAMP水平主要反映了該信使的合成和降解之間的凈平衡。Ketty等[18]發(fā)現(xiàn)分離的施萬細(xì)胞(SCs)通過采用分化的有絲分裂后狀態(tài)響應(yīng)cAMP升高，該狀態(tài)表現(xiàn)出高水平的Kelx-20(髓鞘形成的轉(zhuǎn)錄增強子)和成熟的SC標(biāo)記物如髓鞘脂質(zhì)半乳糖腦苷脂。因此當(dāng)cAMP表達(dá)升高后，也可以通過對施萬細(xì)胞進行影響從而高效促進受損周圍神經(jīng)的修復(fù)。杜旭等[19]發(fā)現(xiàn)注射咯利普蘭(PDE-IV的特異性抑制劑)可提高DRG細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，當(dāng)cAMP表達(dá)水平上升時會顯著加速周圍神經(jīng)再生?？梢园l(fā)現(xiàn)，通過其他干預(yù)手法可以提高cAMP的表達(dá)從而促進周圍神經(jīng)的再生和修復(fù)。結(jié)合本實驗結(jié)果，坐骨神經(jīng)鉗夾模型造成坐骨神經(jīng)損傷后，會表現(xiàn)出cAMP含量的下降；在推拿干預(yù)后其表達(dá)量明顯增高。因此以三法三穴為代表的推拿手法對促進cAMP蛋白的表達(dá)升高作用十分明顯且推拿確實通過影響cAMP蛋白及其通路的表達(dá)，起到了提高大鼠患側(cè)肢體的后肢功能的作用，同時促進損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)，且效果顯著。

研究表明，cAMP也顯著影響神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞的生物學(xué)行為，如軸突生長，雪旺細(xì)胞增殖和軸突髓鞘再生。鑒于cAMP對神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞的關(guān)鍵作用，已經(jīng)研究了cAMP對周圍神經(jīng)再生的直接作用。通過注射毛喉素(一種增強cAMP生成的AC刺激物[20])原位增加神經(jīng)元cAMP水平[21]，導(dǎo)致感覺神經(jīng)再生率持續(xù)升高；在周圍神經(jīng)再生促進類似角色也可以通過用cAMP類似物(二丁酰cAMP和8-溴cAMP)和/或PDE抑制劑(茶堿)實現(xiàn)[22-23]。cAMP涉及許多神經(jīng)元改變的過程，包括細(xì)胞培養(yǎng)中的誘導(dǎo)、分化、神經(jīng)突向外生長和神經(jīng)元存活[24-25]以及體內(nèi)制劑影響下cAMP含量改變導(dǎo)致的神經(jīng)元變化[26]。

Howe等[27]發(fā)現(xiàn)PKA調(diào)節(jié)的活性十分廣泛，尤其是對MF、MT和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。PKA作為cAMP的必需下游靶標(biāo)，Yu等[28]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)、激素、應(yīng)激和炎性刺激誘導(dǎo)的鳥苷結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激活后，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增加并且其下游效應(yīng)子PKA被激活。因此在實驗中可以觀察到，在術(shù)后7天及20天兩個檢測時間點，cAMP和PKA表達(dá)的變化趨勢是相同的。cAMP的信號系統(tǒng)的中間體，如蛋白激酶A(PKA)和被cAMP激活的交換蛋白(EPAC)已經(jīng)被報道在體內(nèi)[29]和體外[30]均有調(diào)節(jié)髓鞘形成的作用。其中，Ketty等[31]發(fā)現(xiàn)PKA促進施旺細(xì)胞的增殖和分化、EPAC雪旺細(xì)胞分化和髓鞘形成。在雪旺細(xì)胞(SCs)中，cAMP不僅誘導(dǎo)分化為髓鞘SC相關(guān)表型，而且協(xié)同增強生長因子(如神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)的促有絲分裂作用，并且cAMP的促有絲分裂作用僅依賴于PKA活性。因此在實驗中可以發(fā)現(xiàn)，PKA在坐骨神經(jīng)損傷后表達(dá)下降，并且在cAMP表達(dá)增加后，PKA作為下游效應(yīng)子表達(dá)隨之增加，二者協(xié)同發(fā)揮作用，促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。因此，以三法三穴為代表的推拿治療在促進PKA蛋白表達(dá)、激活cAMP-PKA信號通路以促進坐骨神經(jīng)修復(fù)的過程中發(fā)揮了重要作用。

因此通過本次研究可以表明，斜板實驗證明以三法三穴為代表的推拿手法可以有效提高SNI大鼠后肢肌力及運動功能的恢復(fù)；同時Western blot表明三法三穴為代表的推拿手法通過提高SNI大鼠DRG中cAMP和PKA的表達(dá)量，使其同時發(fā)揮作用，激活cAMP-PKA信號通路，修復(fù)受損神經(jīng)。

4 展望

在本實驗中，無形態(tài)學(xué)部分，在未來的研究中，可以結(jié)合形態(tài)學(xué)實驗以進一步觀察推拿治療周圍神經(jīng)損傷在激活cAMP-PKA信號通路后具體以何種方式進行修復(fù)。可以從軸突的再生，髓鞘修復(fù)、生長錐的萌芽及導(dǎo)向調(diào)節(jié)等多方面觀察，以明確cAMP-PKA信號通路是否以一種或多種方式同時對受損的周圍神經(jīng)進行修復(fù)。