• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    “三法三穴”對坐骨神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP及PKA表達(dá)的影響

    2020-06-08 06:39:46羅宇婷莫巖君呂桃桃沈熠邵帥張羽墨于天源
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年4期
    關(guān)鍵詞:軸突髓鞘手法

    羅宇婷 莫巖君 呂桃桃 沈熠 邵帥 張羽墨 于天源

    推拿作為中醫(yī)治療周圍神經(jīng)損傷的常用方法,臨床療效好,不良反應(yīng)小。大量研究證明,以三法三穴為代表的推拿手法可以有效促進SNI大鼠受損神經(jīng)及后肢肌力的恢復(fù)。cAMP-PKA信號通路作為目前研究最深入的信號通路之一,在周圍神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮了重要作用,尤其是在促進軸突及髓鞘再生、調(diào)節(jié)生長錐、促進NGF表達(dá)等方面。在以三法三穴為代表的推拿手法恢復(fù)周圍神經(jīng)損傷的起效機制中,是否有cAMP及PKA的參與,是探究推拿治療周圍神經(jīng)神經(jīng)損傷機理的重要環(huán)節(jié)。本研究觀察“三法三穴”推拿治療對坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury,SNI)大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)cAMP及PKA表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選用SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠32只,體質(zhì)量(200±10)g,購自北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0011。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實驗程序均符合動物福利與倫理原則,并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物使用和管理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 藥物與試劑

    2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品(索萊寶,PC0001);彩虹245廣譜蛋白Marker(12條帶)(索萊寶,PR1920);水合氯醛(滬試公司);BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶,PC0020);10×TBST pH 8.0(索萊寶,T1081)、兔源cAMP抗體(Abcam公司,英國,ab76238)、兔源PKA抗體(Abcam Company,英國,ab32390)。

    1.3 主要實驗儀器

    按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號200710187403.1);電泳儀(美國BIO-RAD公司,美國,10002468);Mini-P-2電泳槽(BIO-RAD公司,美國,10007296);MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司,1410101);水平脫色搖床(六一公司,WD-9405FN); Fresco低溫冷凍離心機(Thermo公司,美國,75007406);電動組織勻漿器(Fluka公司,美國)。

    1.4 造模與干預(yù)方法

    1.4.1 造模方法 用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組16只、假手術(shù)組16只、模型組16只、推拿組8只。先將大鼠用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g體重的劑量腹腔注射麻醉;然后俯臥位固定于消毒過的鼠板上,手術(shù)區(qū)(右側(cè)臀股交界處)備皮、常規(guī)消毒,用手術(shù)剪沿坐骨神經(jīng)走行方向剪開大約1 cm的皮膚切口,然后用止血鉗鈍性逐層分離肌肉,暴露梨狀肌下緣及坐骨神經(jīng);用彎鉤鑷確認(rèn)所暴露的組織確為坐骨神經(jīng)后,用特制無齒10號持針器在距梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持坐骨神經(jīng)5秒,然后逐層縫合,碘伏消毒。假手術(shù)組:預(yù)處理及顯露坐骨神經(jīng)的方法同造模組,但不做夾持。正常組不造模;三法三穴組同模型組。

    1.4.2 穴位及推拿儀器的選取 干預(yù)的穴位為殷門、承山及陽陵泉穴。在本次實驗中,除從針灸學(xué)角度考慮此三穴為同時刺激穴位―神經(jīng)―肌肉的最佳點外;從推拿學(xué)角度分析,此三穴在臨床中屬常用穴及強刺激穴。此外,從實驗動物及干預(yù)手法考慮,此三穴有較強的可操作性。按摩推拿手法模擬儀:運用模擬儀進行定性定量推拿手法操作。

    1.4.3 干預(yù)方法 各組均在造模后第7天開始干預(yù)。推拿組使用手法模擬儀依次刺激束縛后大鼠右側(cè)“殷門”“承山”“陽陵泉”,其中“殷門”位于后肢上段正中,“陽陵泉”位于后三里上外側(cè)5 mm(后三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處),“承山”位于后肢腓腸肌兩肌腹形成凹陷處;手法模擬為點法、撥法、揉法;刺激力量為4 N。每穴每法1分鐘,頻率30次/分鐘,總計9 min。正常組、假手術(shù)組、模型組僅抓取,不作干預(yù)。治療次數(shù):每天1次,每治療7次休息1天。

    1.5 指標(biāo)觀測與檢測方法

    1.5.1 行為學(xué)檢測 應(yīng)用改良Rivlin法制傾斜板,記錄行為學(xué)評分,每只大鼠重復(fù)測量3次,取平均值。各組分別于術(shù)后7天和干預(yù)20天時做斜板實驗行為學(xué)評分。

    1.5.2 標(biāo)本采集 正常組、假手術(shù)組、模型組分別于術(shù)后第7天和干預(yù)20天時,三法三穴組于干預(yù)20天時,每組選取8只大鼠處死。迅速置于冰盤上,取L4~L6節(jié)段背根神經(jīng)節(jié),放于液氮罐中冷凍,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5.3 DRG中cAMP、PKA蛋白表達(dá) 每組8個樣本進行檢測。組織加入3 mL預(yù)冷的RIPA裂解液充分研磨,12000 rpm低溫離心15 min后取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣本蛋白濃度后,確定蛋白上樣量約10 μg,加入5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。目標(biāo)蛋白上樣后電泳,20分鐘80 V,1小時100 V。轉(zhuǎn)膜時操作條件為2小時120 V。加入5%脫脂牛奶封閉1小時后,1×TBST每10 min洗1次,共洗3次。將PVDF膜按蛋白分子量剪開,分別加入一抗cAMP抗體(1∶50000)、一抗PKA抗體(1∶3000)、一抗CREB (1∶3000)及Anti-N Cadherin(1∶3000),搖床上室溫孵育60 min后4℃過夜。洗膜,1×TBST每10 min洗1次,共洗3次。所得的印跡經(jīng)二抗HRP-羊抗兔IgG (1∶3000)室溫?fù)u床孵育60 min。1×TBST每10 min洗1次,洗3次。然后使用ECL試劑盒曝光顯影,條帶曝光完畢后,PVDF膜自然晾干后封存。應(yīng)用Quantity One分析軟件計算目標(biāo)條帶積分光密度值。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 斜板實驗

    術(shù)后7天時,模型組大鼠斜板實驗評分明顯低于正常組(P<0.05),假手術(shù)組大鼠斜板實驗評分與正常組無顯著性差異(P>0.05);干預(yù)20天時,三法三穴組大鼠斜板實驗評分與模型組比較明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

    表1 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠斜板實驗結(jié)果(單位:度;

    注: 與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

    2.2 各組大鼠DRG中cAMP的表達(dá)情況

    術(shù)后7天時,與正常組比較,模型組表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);干預(yù)20天時,與模型組相比,三法三穴組cAMP表達(dá)水平呈明顯升高趨勢,三法三穴組與模型組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見表2,圖1。

    表2 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中cAMP的蛋白表達(dá)

    注: 與正常組比較,aP>0.05;與模型組比較,bP>0.05。

    2.3 各組大鼠DRG中PKA表達(dá)比較

    術(shù)后7天,與正常組比較,模型組PKA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);干預(yù)20天后,與模型組比較,三法三穴組PKA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),且三法三穴組與正常組相比無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表3,圖2。

    注:A:正常組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:三法三穴組。圖1 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG組織cAMP的蛋白表達(dá)

    表3 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中PKA的蛋白表達(dá)

    注: 與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

    注:A:正常組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:三法三穴組。圖2 術(shù)后7天與干預(yù)20天時各組大鼠DRG中PKA的蛋白表達(dá)

    3 討論

    3.1 干預(yù)手法及方式

    楊超[1]運用Meta分析推拿治療原發(fā)性及繼發(fā)性坐骨神經(jīng)病變手法選擇時,納入的RCTs涉及14種手法,以使用頻次從高到低排序,同時依照治療中以放松類手法為主配合溫通類手法的原則,本實驗選擇了最常用的點、拔、揉三種手法。另實驗中以按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發(fā)明專利號200710187403.1)進行操作。通過專利儀器的使用,達(dá)到了對“三法三穴”干預(yù)手法定量的要求,保證了實驗結(jié)果的可信度和科學(xué)性。

    3.2 推拿治療坐骨神經(jīng)損傷的機制日益明確

    前期研究表明,以三法三穴為代表的推拿手法治療周圍神經(jīng)損傷療效確切。主要表現(xiàn)為:對腓腸肌細(xì)胞直徑的恢復(fù)[2],神經(jīng)髓鞘的修復(fù)[3],軸突的再生[4-5];減緩神經(jīng)元凋亡[6],細(xì)胞骨架的再建[7],NTF相關(guān)因子(NGF、BDNF、CNTF等)在肌肉、神經(jīng)、脊髓中表達(dá)升高[8];提高馬達(dá)蛋白kinesin及dynein在脊髓中的表達(dá),促進軸漿運輸功能恢復(fù),終改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠的運動及感覺功能[9]。

    3.3 cAMP-PKA信號通路在多方面促進周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)

    cAMP-PKA信號通路在改善神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境、抑制或中和神經(jīng)元內(nèi)的抑制因子、軸突生長錐導(dǎo)向和致靶過程中軸突投射的準(zhǔn)確性以及促進髓鞘修復(fù)和雪旺細(xì)胞有絲分裂等多方面影響軸突生長。Cai等[10]發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF),可以增加cAMP的含量,激活PKA,軸突在接觸MAG之前暴露于BDNF和GDNF使cAMP水平升高,可以阻礙MAG的抑制作用;而加入PKA抑制劑后,BDNF和GDNF對軸突再生的促進作用消失。Cui等[11]證實向大鼠眼球內(nèi)注射cAMP和睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子,能增強大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cells,RGC)的生存能力和促進軸突再生長;而注射神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NTF-4/5)和同量的cAMP,仍可增強RGC的生存能力,但對遠(yuǎn)期軸突再生有抑制作用。這些研究提示cAMP與適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合對促進不同類型的軸突再生有協(xié)同作用;同時,cAMP-PKA信號通路參與生長錐導(dǎo)向的調(diào)節(jié)。Chierzi等[12]證實增加cAMP能促進成年人DRG和RGC軸突生長錐的出芽和再生,是由PKA介導(dǎo)的。Radwan等[13]發(fā)現(xiàn)BDNF、GDNF或NTF-3的梯度可吸引體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的生長錐,當(dāng)分別抑制cAMP和PKA時,這種吸引轉(zhuǎn)變?yōu)榕懦?,證明相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子對生長錐的吸引作用是經(jīng)cAMP-PKA信號通路介導(dǎo)的,這些形態(tài)學(xué)改變(生長錐出芽)與細(xì)胞分子水平機制(細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變)是一致的。Jin M[14]通過切斷脊神經(jīng)后根的體外模型觀察到,大多數(shù)成人脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)的軸突在橫切術(shù)4 h后形成新的生長錐;Qiu[15]在活體內(nèi)抑制PKA的活性,將影響損傷軸突生長錐的出芽??梢园l(fā)現(xiàn),cAMP和PKA可以但不限于從促進軸突再生和生長錐出芽等方面修復(fù)受損的周圍神經(jīng)。雖然現(xiàn)有研究無法在時空上確切說明二者表達(dá)變化的先后順序,但大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實PKA作為cAMP的下游效應(yīng)子,二者在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中表達(dá)變化趨同,且作用相似。

    Aglah等[16]在實驗中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)cAMP的上調(diào)增加運動神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長,而拮抗cAMP導(dǎo)致培養(yǎng)的大鼠運動神經(jīng)元中神經(jīng)突向外生長顯著減少,這一變化直接影響了周圍神經(jīng)損傷大鼠后肢肌力與運動功能的恢復(fù)情況。因此可以明確,cAMP在大鼠周圍神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元的再生過程中起到了至關(guān)重要的作用。

    Walikonis等[17]在研究中發(fā)現(xiàn),cAMP水平在受傷后會發(fā)生顯著變化,當(dāng)坐骨神經(jīng)受到壓迫或永久性橫斷損傷后,其表達(dá)量會下降,并且在髓鞘再生時表達(dá)增加。因此cAMP水平主要反映了該信使的合成和降解之間的凈平衡。Ketty等[18]發(fā)現(xiàn)分離的施萬細(xì)胞(SCs)通過采用分化的有絲分裂后狀態(tài)響應(yīng)cAMP升高,該狀態(tài)表現(xiàn)出高水平的Kelx-20(髓鞘形成的轉(zhuǎn)錄增強子)和成熟的SC標(biāo)記物如髓鞘脂質(zhì)半乳糖腦苷脂。因此當(dāng)cAMP表達(dá)升高后,也可以通過對施萬細(xì)胞進行影響從而高效促進受損周圍神經(jīng)的修復(fù)。杜旭等[19]發(fā)現(xiàn)注射咯利普蘭(PDE-IV的特異性抑制劑)可提高DRG細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,當(dāng)cAMP表達(dá)水平上升時會顯著加速周圍神經(jīng)再生??梢园l(fā)現(xiàn),通過其他干預(yù)手法可以提高cAMP的表達(dá)從而促進周圍神經(jīng)的再生和修復(fù)。結(jié)合本實驗結(jié)果,坐骨神經(jīng)鉗夾模型造成坐骨神經(jīng)損傷后,會表現(xiàn)出cAMP含量的下降;在推拿干預(yù)后其表達(dá)量明顯增高。因此以三法三穴為代表的推拿手法對促進cAMP蛋白的表達(dá)升高作用十分明顯且推拿確實通過影響cAMP蛋白及其通路的表達(dá),起到了提高大鼠患側(cè)肢體的后肢功能的作用,同時促進損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù),且效果顯著。

    研究表明,cAMP也顯著影響神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞的生物學(xué)行為,如軸突生長,雪旺細(xì)胞增殖和軸突髓鞘再生。鑒于cAMP對神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞的關(guān)鍵作用,已經(jīng)研究了cAMP對周圍神經(jīng)再生的直接作用。通過注射毛喉素(一種增強cAMP生成的AC刺激物[20])原位增加神經(jīng)元cAMP水平[21],導(dǎo)致感覺神經(jīng)再生率持續(xù)升高;在周圍神經(jīng)再生促進類似角色也可以通過用cAMP類似物(二丁酰cAMP和8-溴cAMP)和/或PDE抑制劑(茶堿)實現(xiàn)[22-23]。cAMP涉及許多神經(jīng)元改變的過程,包括細(xì)胞培養(yǎng)中的誘導(dǎo)、分化、神經(jīng)突向外生長和神經(jīng)元存活[24-25]以及體內(nèi)制劑影響下cAMP含量改變導(dǎo)致的神經(jīng)元變化[26]。

    Howe等[27]發(fā)現(xiàn)PKA調(diào)節(jié)的活性十分廣泛,尤其是對MF、MT和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。PKA作為cAMP的必需下游靶標(biāo),Yu等[28]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)、激素、應(yīng)激和炎性刺激誘導(dǎo)的鳥苷結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激活后,細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增加并且其下游效應(yīng)子PKA被激活。因此在實驗中可以觀察到,在術(shù)后7天及20天兩個檢測時間點,cAMP和PKA表達(dá)的變化趨勢是相同的。cAMP的信號系統(tǒng)的中間體,如蛋白激酶A(PKA)和被cAMP激活的交換蛋白(EPAC)已經(jīng)被報道在體內(nèi)[29]和體外[30]均有調(diào)節(jié)髓鞘形成的作用。其中,Ketty等[31]發(fā)現(xiàn)PKA促進施旺細(xì)胞的增殖和分化、EPAC雪旺細(xì)胞分化和髓鞘形成。在雪旺細(xì)胞(SCs)中,cAMP不僅誘導(dǎo)分化為髓鞘SC相關(guān)表型,而且協(xié)同增強生長因子(如神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)的促有絲分裂作用,并且cAMP的促有絲分裂作用僅依賴于PKA活性。因此在實驗中可以發(fā)現(xiàn),PKA在坐骨神經(jīng)損傷后表達(dá)下降,并且在cAMP表達(dá)增加后,PKA作為下游效應(yīng)子表達(dá)隨之增加,二者協(xié)同發(fā)揮作用,促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。因此,以三法三穴為代表的推拿治療在促進PKA蛋白表達(dá)、激活cAMP-PKA信號通路以促進坐骨神經(jīng)修復(fù)的過程中發(fā)揮了重要作用。

    因此通過本次研究可以表明,斜板實驗證明以三法三穴為代表的推拿手法可以有效提高SNI大鼠后肢肌力及運動功能的恢復(fù);同時Western blot表明三法三穴為代表的推拿手法通過提高SNI大鼠DRG中cAMP和PKA的表達(dá)量,使其同時發(fā)揮作用,激活cAMP-PKA信號通路,修復(fù)受損神經(jīng)。

    4 展望

    在本實驗中,無形態(tài)學(xué)部分,在未來的研究中,可以結(jié)合形態(tài)學(xué)實驗以進一步觀察推拿治療周圍神經(jīng)損傷在激活cAMP-PKA信號通路后具體以何種方式進行修復(fù)。可以從軸突的再生,髓鞘修復(fù)、生長錐的萌芽及導(dǎo)向調(diào)節(jié)等多方面觀察,以明確cAMP-PKA信號通路是否以一種或多種方式同時對受損的周圍神經(jīng)進行修復(fù)。

    猜你喜歡
    軸突髓鞘手法
    聽覺神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘相關(guān)病理和可塑性機制研究進展
    機械敏感性離子通道TMEM63A在髓鞘形成障礙相關(guān)疾病中的作用*
    microRNA在神經(jīng)元軸突退行性病變中的研究進展
    層遞手法
    快樂語文(2021年11期)2021-07-20 07:41:42
    緩解后背疼的按摩手法
    七步洗手法
    人從39歲開始衰老
    腦白質(zhì)病變是一種什么???
    益壽寶典(2018年1期)2018-01-27 01:50:24
    神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合腹腔注射促紅細(xì)胞生成素對橫斷性脊髓損傷大鼠神經(jīng)軸突的修復(fù)作用
    中樞神經(jīng)損傷后軸突變性的研究進展
    中亚洲国语对白在线视频| 久久人妻av系列| 精品久久国产蜜桃| 午夜视频国产福利| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品一区av在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久精品国产自在天天线| 国产伦精品一区二区三区四那| 1024手机看黄色片| 国产精品一及| 日日夜夜操网爽| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩欧美国产在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 午夜福利在线在线| 日韩在线高清观看一区二区三区 | а√天堂www在线а√下载| 神马国产精品三级电影在线观看| 看黄色毛片网站| 最新在线观看一区二区三区| 有码 亚洲区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 成人无遮挡网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 熟女人妻精品中文字幕| 91精品国产九色| 哪里可以看免费的av片| 一区二区三区高清视频在线| 中文字幕免费在线视频6| 精品免费久久久久久久清纯| 国产黄片美女视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 色噜噜av男人的天堂激情| 免费无遮挡裸体视频| 中文在线观看免费www的网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 麻豆成人av在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本免费a在线| 免费av毛片视频| 午夜福利高清视频| 窝窝影院91人妻| 国产精品一区www在线观看 | 可以在线观看的亚洲视频| 一夜夜www| 天堂动漫精品| 亚洲自拍偷在线| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人av教育| 成人午夜高清在线视频| 国产精品,欧美在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲色图av天堂| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久久久精品国产欧美久久久| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久九九精品影院| 深爱激情五月婷婷| 91麻豆精品激情在线观看国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产成人福利小说| 丝袜美腿在线中文| 美女高潮的动态| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产午夜精品论理片| 久久精品91蜜桃| 亚洲最大成人中文| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久人人精品亚洲av| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费高清视频大片| 天美传媒精品一区二区| 免费观看的影片在线观看| 国产视频内射| 午夜激情欧美在线| 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲av成人av| 成人国产麻豆网| 三级国产精品欧美在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日本视频| 极品教师在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久国内视频| 久久中文看片网| ponron亚洲| 日韩国内少妇激情av| 午夜精品一区二区三区免费看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久午夜福利片| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久久久久,| 在线天堂最新版资源| 中文资源天堂在线| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色女人牲交| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 午夜影院日韩av| 欧美日韩综合久久久久久 | 日韩国内少妇激情av| 最近最新中文字幕大全电影3| 99热6这里只有精品| 人妻少妇偷人精品九色| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本色播在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 真人做人爱边吃奶动态| 中出人妻视频一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩av在线大香蕉| 国国产精品蜜臀av免费| 香蕉av资源在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产欧美日韩精品一区二区| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人av教育| 男人和女人高潮做爰伦理| 嫩草影院入口| 欧美性感艳星| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 免费看av在线观看网站| 免费看av在线观看网站| 国产美女午夜福利| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲熟妇熟女久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产高清视频在线播放一区| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 赤兔流量卡办理| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 久久午夜福利片| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费电影在线观看免费观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产伦人伦偷精品视频| 69人妻影院| 国产一区二区在线av高清观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产主播在线观看一区二区| av国产免费在线观看| 黄色女人牲交| 深爱激情五月婷婷| 国产一区二区激情短视频| 高清日韩中文字幕在线| 精品国产三级普通话版| 成人三级黄色视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美日韩东京热| 一个人看的www免费观看视频| 国产黄片美女视频| 看十八女毛片水多多多| 伦精品一区二区三区| 亚洲三级黄色毛片| 成人综合一区亚洲| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美一级a爱片免费观看看| 级片在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产精品永久免费网站| 日本三级黄在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美极品一区二区三区四区| 国产在视频线在精品| 真实男女啪啪啪动态图| 免费观看精品视频网站| 18+在线观看网站| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲av不卡在线观看| x7x7x7水蜜桃| 最后的刺客免费高清国语| 天美传媒精品一区二区| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲无线观看免费| 中文资源天堂在线| 欧美+日韩+精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 色5月婷婷丁香| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成年版毛片免费区| 国产精品1区2区在线观看.| 波野结衣二区三区在线| 国产免费男女视频| 国产毛片a区久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 日本成人三级电影网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜福利高清视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美激情在线99| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美一区二区亚洲| 欧美日韩乱码在线| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩亚洲欧美综合| 乱系列少妇在线播放| x7x7x7水蜜桃| 亚洲欧美激情综合另类| 91精品国产九色| av黄色大香蕉| 欧美潮喷喷水| 国产伦在线观看视频一区| 少妇高潮的动态图| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品在线观看二区| avwww免费| 国产亚洲91精品色在线| 精品午夜福利在线看| 亚洲最大成人av| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 麻豆成人午夜福利视频| 在线看三级毛片| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品永久免费网站| 中文字幕av在线有码专区| 内射极品少妇av片p| 日韩国内少妇激情av| 免费观看在线日韩| 最好的美女福利视频网| 精品一区二区免费观看| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一进一出抽搐动态| 国产日本99.免费观看| 又爽又黄无遮挡网站| 日本一本二区三区精品| 黄色配什么色好看| 97碰自拍视频| 午夜福利在线在线| 亚洲自拍偷在线| 少妇高潮的动态图| 九九在线视频观看精品| 亚洲成人久久性| 日本五十路高清| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品久久久久久精品电影| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲熟妇熟女久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜精品久久久久久毛片777| 中出人妻视频一区二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品电影一区二区三区| 91狼人影院| 麻豆一二三区av精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产老妇女一区| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区二区三区av在线 | 国产精华一区二区三区| 简卡轻食公司| 久久久久性生活片| 中文在线观看免费www的网站| 久久久久久久久久成人| 久久香蕉精品热| 91av网一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久色成人| av黄色大香蕉| 亚洲性久久影院| 久久久久久九九精品二区国产| 在线天堂最新版资源| 久久精品人妻少妇| 精品乱码久久久久久99久播| 丰满乱子伦码专区| 婷婷六月久久综合丁香| 天堂√8在线中文| 丝袜美腿在线中文| 欧美xxxx性猛交bbbb| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人国产综合亚洲| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产私拍福利视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日日啪夜夜撸| 美女黄网站色视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 干丝袜人妻中文字幕| 免费在线观看日本一区| 麻豆成人av在线观看| 搡老岳熟女国产| 久久久久久国产a免费观看| av视频在线观看入口| 欧美成人a在线观看| 亚洲内射少妇av| 亚洲专区中文字幕在线| 免费看美女性在线毛片视频| 91在线观看av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲在线观看片| 国产亚洲精品av在线| 国内精品美女久久久久久| 少妇丰满av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日本视频| 一区二区三区激情视频| 久久亚洲精品不卡| 听说在线观看完整版免费高清| 久久午夜亚洲精品久久| 直男gayav资源| 91狼人影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品,欧美在线| 天天躁日日操中文字幕| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲欧美日韩无卡精品| 色哟哟·www| 日韩欧美精品免费久久| 特大巨黑吊av在线直播| 看黄色毛片网站| 九九在线视频观看精品| 精品久久久久久久久亚洲 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 久久久久久伊人网av| 一区二区三区四区激情视频 | 国产老妇女一区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 小说图片视频综合网站| 午夜福利在线在线| 舔av片在线| x7x7x7水蜜桃| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲不卡免费看| 国产精品不卡视频一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 老司机福利观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产一区二区三区av在线 | 老女人水多毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩强制内射视频| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一区二区三区高清视频在线| 丰满的人妻完整版| 色播亚洲综合网| 亚洲不卡免费看| 小说图片视频综合网站| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 老司机福利观看| 婷婷亚洲欧美| 一进一出好大好爽视频| 一本久久中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲第一区二区三区不卡| 丰满的人妻完整版| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久午夜福利片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩中字成人| 嫩草影院入口| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 18+在线观看网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产免费av片在线观看野外av| 成人午夜高清在线视频| 99热这里只有是精品在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天堂动漫精品| 禁无遮挡网站| 亚洲人成网站高清观看| 不卡一级毛片| 亚洲av美国av| 国产精华一区二区三区| 国产高清三级在线| 欧美三级亚洲精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产高清三级在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 五月玫瑰六月丁香| 能在线免费观看的黄片| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 级片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成人特级av手机在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品国产高清国产av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美色视频一区免费| 99热精品在线国产| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲无线在线观看| 如何舔出高潮| 日韩国内少妇激情av| avwww免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| x7x7x7水蜜桃| 亚洲色图av天堂| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文字幕高清在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品久久久久久av不卡| 国产探花在线观看一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线免费观看的www视频| 成年免费大片在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 免费观看在线日韩| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品永久免费网站| 成人国产一区最新在线观看| 夜夜爽天天搞| 久久久久久久久中文| 日韩精品有码人妻一区| 日本欧美国产在线视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品,欧美在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 欧美性猛交黑人性爽| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美成人一区二区免费高清观看| av专区在线播放| 成人国产麻豆网| 国产中年淑女户外野战色| 黄色一级大片看看| 乱人视频在线观看| 国产综合懂色| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精华国产精华精| 日韩欧美在线乱码| 国产伦精品一区二区三区视频9| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产伦人伦偷精品视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女大奶头视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜福利成人在线免费观看| ponron亚洲| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品不卡视频一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情福利司机影院| 日本成人三级电影网站| 亚洲av一区综合| 欧美国产日韩亚洲一区| ponron亚洲| 国产精品久久视频播放| 在线国产一区二区在线| 免费电影在线观看免费观看| 性欧美人与动物交配| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕高清在线视频| 色吧在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品久久视频播放| av在线亚洲专区| 欧美精品国产亚洲| 日本三级黄在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 春色校园在线视频观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇被粗大猛烈的视频| 韩国av在线不卡| 12—13女人毛片做爰片一| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲无线观看免费| 亚洲av成人av| 99久久成人亚洲精品观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 九色国产91popny在线| 两个人的视频大全免费| 国产成人影院久久av| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩强制内射视频| 男女那种视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 免费观看人在逋| 日韩欧美在线乱码| videossex国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 香蕉av资源在线| 超碰av人人做人人爽久久| 人妻久久中文字幕网| 男人舔奶头视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品亚洲美女久久久| 国产 一区精品| 欧美成人a在线观看| 亚洲性久久影院| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产久久久一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 99热6这里只有精品| 久久精品91蜜桃| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产极品精品免费视频能看的| a在线观看视频网站| 又紧又爽又黄一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 听说在线观看完整版免费高清| 国产欧美日韩精品一区二区| 天堂√8在线中文| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一本一本综合久久| 国产精品无大码| 国产色爽女视频免费观看| av在线天堂中文字幕| 欧美区成人在线视频| 韩国av在线不卡| www.色视频.com| 午夜日韩欧美国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩中字成人| 日本在线视频免费播放| 黄色女人牲交| 九九爱精品视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 成人二区视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 美女高潮的动态| 久久中文看片网| 欧美日本视频| 国产成人影院久久av| 免费看a级黄色片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久久久午夜电影| 国产乱人伦免费视频| 国产成人av教育| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品午夜福利在线看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| netflix在线观看网站| www.www免费av| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 听说在线观看完整版免费高清| 免费观看在线日韩| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av免费在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久国产成人免费| 色噜噜av男人的天堂激情|